本發(fā)明屬于抗病毒藥物領(lǐng)域，具體涉及脂肪基酯類(lèi)化合物在制備抗腸道病毒藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腸道病毒包括脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒(CV)、埃可病毒及新型腸道病毒(EV)共71個(gè)血清型。本屬病毒感染分布廣泛，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣。其中腸道病毒71型(EV71)是引起嬰幼兒手足口病的最主要病原體之一，有時(shí)伴有嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，包括無(wú)菌性腦膜炎，腦炎，脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹，神經(jīng)性心肺衰竭等，甚至導(dǎo)致死亡。自1974年首次報(bào)道以來(lái)，EV71感染性疾病已在世界范圍內(nèi)多次爆發(fā)與流行，在亞太地區(qū)尤其是我國(guó)形勢(shì)嚴(yán)峻。目前對(duì)于由EV71感染的疾病治療沒(méi)有特效藥物，相關(guān)的疫苗于2015年才上市，其預(yù)防效果還有待進(jìn)一步調(diào)查?？滤_奇病毒感染可引起多種疾病，如手足口病、無(wú)菌性腦膜炎、腦炎、心肌炎、流行性肌炎痛、皰疹性咽峽炎等。已報(bào)道的CV共有29個(gè)血清型，根據(jù)其對(duì)乳鼠的致病特點(diǎn)及對(duì)細(xì)胞敏感性的不同，可將其分為A和B兩組，即CVA(CVA1-22,24)和CVB(CVB1-6)。以CVBs的感染最為常見(jiàn)，其中CVB3是CVB六個(gè)血清型中致病性最強(qiáng)的一型，是病毒性心肌炎最主要的致病原因。據(jù)美國(guó)疾病預(yù)防控制中心(CDC)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，CVB(1-6型)每年可導(dǎo)致約500萬(wàn)人患腸道系統(tǒng)疾病，其中10％-20％是由CVB3引起的急性心肌炎。近年來(lái)CVB3引起手足口病的趨勢(shì)也在上升。目前對(duì)于柯薩奇病毒感染無(wú)特效藥物，臨床尚無(wú)有針對(duì)性的治療手段。因此開(kāi)發(fā)特異有效的抗EV71和CVB3病毒的藥物勢(shì)在必行。

酯類(lèi)化合物是一類(lèi)重要的精細(xì)化工產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于藥物、材料、食品、增塑劑、溶劑等化工行業(yè)。本申請(qǐng)人所在項(xiàng)目組自主合成了一種具有新型結(jié)構(gòu)的脂肪基酯類(lèi)化合物，并于2015年在期刊Tetrahedron Letters公開(kāi)了這種化合物的制備方法。未對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供脂肪基酯類(lèi)化合物WY124在制備抗腸道病毒藥物中的應(yīng)用，所述的WY124，其結(jié)構(gòu)式如下式：

本發(fā)明在細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)WY124具有強(qiáng)的抗EV71、CVB3病毒活性。具體表現(xiàn)為WY124可以強(qiáng)烈抑制這些病毒引起的宿主細(xì)胞病變效應(yīng)，增強(qiáng)感染細(xì)胞的存活率，降低子代病毒產(chǎn)量，抑制EV71感染導(dǎo)致的宿主RD細(xì)胞凋亡，且主要作用于EV71感染細(xì)胞后的復(fù)制階段。

進(jìn)一步地，所述的腸道病毒為腸道病毒71型或柯薩奇病毒B3型。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種抗腸道病毒的藥物，包含有效劑量的作為活性成份的化合物WY124，或它們的鹽，和藥學(xué)上可以接受的載體。

進(jìn)一步地，所述藥物制劑是顆粒劑、片劑、丸劑、膠囊劑、注射劑或分散劑。

由此表明化合物WY124有制備抗EV71感染的特異治療藥物的潛力，具有臨床應(yīng)用前景。

本發(fā)明的脂肪基酯類(lèi)化合物WY124的制備，參照文獻(xiàn)Tetrahedron Letters2015，56，6136–6141的方法，具體以過(guò)渡金屬鈀為催化劑，在吡啶的鄰位誘導(dǎo)作用下，在芳環(huán)的鄰位用高價(jià)碘苯作用，進(jìn)行芳酰氧基化，得到最終酯化產(chǎn)物。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、化合物WY124合成原料價(jià)格低廉，易于購(gòu)得；合成工藝簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)快速，易于大規(guī)模生產(chǎn)推廣。

2、WY124對(duì)于EV71、CVB3均具有高效的抑制活性，易于開(kāi)發(fā)為廣譜抗腸道病毒藥物。

附圖說(shuō)明

圖1是不同濃度的WY124對(duì)于EV71、CVB3作用的RD、Hep-2細(xì)胞存活率的影響。

圖2是WY124對(duì)于EV71、CVB3作用的RD、Hep-2細(xì)胞CPE的抑制效應(yīng)。

圖3是WY124不同加藥方式處理下對(duì)于EV71的抑制活性。

圖4是WY124對(duì)于EV71作用的RD細(xì)胞子代病毒產(chǎn)量的影響。

圖5是WY124對(duì)于EV71引起的RD細(xì)胞凋亡的影響。

具體實(shí)施方式

通過(guò)以下詳細(xì)說(shuō)明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明方法的說(shuō)明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

在下文中，如果未特別說(shuō)明，本發(fā)明所用材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的。

【實(shí)施例1】對(duì)WY124的抗腸道病毒活性進(jìn)行評(píng)估

1、試驗(yàn)方法：

1.1 WY124對(duì)于宿主RD、Hep-2細(xì)胞的毒性

將RD、Hep-2細(xì)胞鋪板96孔板，在37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)長(zhǎng)滿(mǎn)單層后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，分別加含不同濃度的WY124的細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)，48h后顯微鏡目測(cè)并分別記錄其細(xì)胞毒性，MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。SPSS 11.5軟件計(jì)算藥物對(duì)于細(xì)胞的半數(shù)中毒濃度(Median cyctoxic concentration，CC50)。細(xì)胞存活率＝(藥物組平均OD₄₉₂值/細(xì)胞對(duì)照組平均OD₄₉₂值)×100％。

1.2 WY124對(duì)于EV71、CVB3的抑制活性

將RD、Hep-2細(xì)胞鋪板96孔板，在37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)長(zhǎng)滿(mǎn)單層后，棄去培養(yǎng)液，100TCID₅₀的EV71、CVB3病毒液分別感染宿主細(xì)胞RD、Hep-2 1h，在病毒感染前，感染期間，感染后均加入不同濃度的測(cè)試化合物(利巴韋林作為陽(yáng)性對(duì)照藥物)孵育細(xì)胞。待繼續(xù)培養(yǎng)約48h，病毒對(duì)照孔出現(xiàn)90％左右的CPE病變時(shí)，顯微鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。CPE的觀察記錄方法：無(wú)細(xì)胞病變記做-，25％以下細(xì)胞病變記做+，25％-50％細(xì)胞病變記做++，50％-75％細(xì)胞病變記做+++，75％以上細(xì)胞病變記為++++。

CPE觀察完畢后，利用MTT方法檢測(cè)藥物對(duì)病毒的抑制率。具體步驟為：每孔加入MTT 50μL(5mg·mL^-1)，孵育3-4h后去掉上清液，加入等體積的DMSO溶解沉淀。用酶標(biāo)儀在492nm處讀取所對(duì)應(yīng)的吸光度(OD₄₉₂值)。利用如下公式計(jì)算藥物對(duì)EV71和CVB3的抑制率。用SPSS 11.5軟件計(jì)算藥物的半數(shù)有效濃度(Concentration for 50％of maximal effect，EC50)。

1.3藥物的治療指數(shù)(SI)

SI＝CC50/EC50。治療指數(shù)越高，說(shuō)明抗病毒潛力越大。

2、試驗(yàn)結(jié)果

表1WY124細(xì)胞毒性及抗病毒活性

WY124細(xì)胞毒性及抗病毒活性測(cè)試結(jié)果如表1所示。濃度依賴(lài)的化合物WY124對(duì)于EV71、CVB3作用的RD、Hep-2細(xì)胞存活率的影響如圖1所示。本發(fā)明檢測(cè)到WY124對(duì)于EV71，CVB3病毒都有很強(qiáng)的抑制作用(IC50分別為7.95μg/mL和11.2μg/mL)，優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照化合物利巴韋林(IC50分別為85.6μg/mL和24.7μg/mL)。利巴韋林對(duì)于CVB3的抑制效果良好，但是對(duì)于EV71抑制效果較差。WY124在40μg/mL時(shí)對(duì)于EV71、CVB3的最高抑制率可以達(dá)到100％和93％。

WY124抑制病毒引起的宿主細(xì)胞CPE效應(yīng)如圖2所示，EV71感染的RD細(xì)胞，CVB3感染的Hep-2細(xì)胞都呈現(xiàn)出明顯的病變效應(yīng)，EV71聚縮成團(tuán)，CVB3變圓凋亡，都從細(xì)胞板壁脫離，WY124(40μg/mL)處理可以很好的保護(hù)細(xì)胞，幾乎完全抑制兩種宿主細(xì)胞的病變效應(yīng)。

【實(shí)施例2】化合物WY124抗EV71活性藥理學(xué)研究

1、試驗(yàn)方法

1.1 WY124對(duì)于EV71的直接殺傷作用分析

10⁴TCID₅₀的EV71懸液與化合物100μg/mL WY124在4℃冰箱孵育24h，病毒懸液稀釋100倍數(shù)，使其小于化合物對(duì)于病毒抑制的有效濃度，滴定于提前準(zhǔn)備好的已貼壁長(zhǎng)滿(mǎn)單層的RD細(xì)胞中，通過(guò)Reed和Muench方法計(jì)算病毒懸液的TCID₅₀值。

1.2 WY124對(duì)于EV71作用方式的分析

通過(guò)三種不同的加藥方式(EV71感染前，感染之間，感染之后加入測(cè)試化合物)分別測(cè)定化合物對(duì)于EV71的影響。

(1)預(yù)防作用：在EV71感染之前加入WY124作用。

RD細(xì)胞在96孔板中長(zhǎng)滿(mǎn)單層后，吸棄培養(yǎng)液，加入含不同濃度WY124孵育2h，棄掉藥物培養(yǎng)液之后，100TCID₅₀的EV71懸液吸附1h，去掉病毒懸液，加細(xì)胞培養(yǎng)維持液繼續(xù)培養(yǎng)。48h時(shí)觀察細(xì)胞CPE，測(cè)定細(xì)胞存活率。

(2)抑制吸附作用:在EV71感染期間加入類(lèi)似物作用。

將EV71懸液和不同濃度WY124混勻，直接滴定于已長(zhǎng)滿(mǎn)單層96孔板的RD細(xì)胞中，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱吸附1h后，棄去感染液，加細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)。48h時(shí)測(cè)定細(xì)胞存活率。

(3)治療作用：在EV71感染之后加入類(lèi)似物作用。

RD細(xì)胞在96孔板中長(zhǎng)滿(mǎn)單層后，吸棄培養(yǎng)液，100TCID₅₀的EV71懸液吸附1h，棄去病毒液，加入含不同濃度WY124繼續(xù)培養(yǎng)，48h時(shí)檢測(cè)細(xì)胞CPE和存活率。

2、試驗(yàn)結(jié)果

2.1化合物WY124體外直接殺傷EV71作用

化合物WY124處理過(guò)的EV71懸液感染RD細(xì)胞，48h檢測(cè)其病毒滴度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藥物處理組相比病毒對(duì)照組，病毒滴度無(wú)明顯變化(數(shù)據(jù)未顯示)，說(shuō)明這些類(lèi)似物均不具有體外直接殺傷EV71作用。

2.2化合物WY124抑制EV71的作用方式

結(jié)果顯示，WY124預(yù)處理細(xì)胞對(duì)于隨后的EV71感染無(wú)明顯的CPE抑制效應(yīng)(圖3)，WY124與EV71同時(shí)孵育感染細(xì)胞這種加藥方式得出相似的結(jié)果，說(shuō)明WY124不能通過(guò)預(yù)先作用于細(xì)胞來(lái)抑制EV71，即對(duì)于病毒感染無(wú)預(yù)防作用，且WY124對(duì)于EV71的吸附內(nèi)化無(wú)明顯影響。EV71感染之后加入化合物WY124，結(jié)果顯示了對(duì)于EV71強(qiáng)的抑制活性，幾乎可以完全抑制EV71導(dǎo)致的細(xì)胞病變效應(yīng)(圖3)，由此說(shuō)明WY124主要作用EV71感染后在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制增殖過(guò)程，此種具有脂肪基結(jié)構(gòu)的新型酯類(lèi)化合物可以用于制備抗EV71感染后在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制增殖過(guò)程的藥物。

【實(shí)施例3】WY124對(duì)于EV71子代病毒產(chǎn)量的抑制作用

1、試驗(yàn)方法

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RD細(xì)胞鋪板24孔板，長(zhǎng)滿(mǎn)單層后100TCID₅₀EV71感染細(xì)胞，37℃孵育1.5h后移去病毒液，PBS洗滌三次，加入含40μg/mL WY124的細(xì)胞維持液。48h后收集細(xì)胞和上清培養(yǎng)液，-20℃和37℃三次凍融裂解后，TCID50方法測(cè)定EV71病毒滴度。

2、試驗(yàn)結(jié)果

如圖4所示，40μg/mL WY124處理的RD細(xì)胞相對(duì)于病毒對(duì)照組，其病毒滴度顯著下降，說(shuō)明了化合物對(duì)于EV71子代病毒產(chǎn)量強(qiáng)烈的抑制作用。

【實(shí)施例4】WY124對(duì)于EV71引起的RD細(xì)胞凋亡的抑制作用

1、試驗(yàn)方法

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RD細(xì)胞鋪板24孔板，長(zhǎng)滿(mǎn)單層后100TCID50EV71感染細(xì)胞，37℃孵育1.5h后移去病毒液，加入含40μg/mL WY124的細(xì)胞維持液。大約48h后，收集細(xì)胞，運(yùn)用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。

2、試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，WY124可以有效抑制EV71導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。在病毒對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為95.83％(圖5)，正常未處理細(xì)胞凋亡率1.76％的情況下(圖5)，40μg/mL WY124處理的細(xì)胞凋亡率只有9.13％(圖5)?？梢?jiàn)WY124可以有效保護(hù)EV71導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，一種具有新型結(jié)構(gòu)的脂肪基酯類(lèi)化合物WY124具有強(qiáng)的抑制腸道病毒EV71和CVB3的活性，可以完全抑制病毒感染引起的宿主細(xì)胞CPE，保護(hù)細(xì)胞免受病毒感染引發(fā)的凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞存活率，主要作用于EV71在RD細(xì)胞中的復(fù)制增殖過(guò)程，有潛力制備一種臨床上有效對(duì)抗腸道病毒感染的藥物。