本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及低聚多酚類化合物在制備抗革蘭氏陽性耐藥菌產(chǎn)品的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

二聚體和三聚體白藜蘆醇低聚多酚類化合物，是具有1,2-二苯乙烯骨架單元及其聚合物的總稱。大量文獻(xiàn)報道，該類低聚多酚結(jié)構(gòu)具有強(qiáng)的抗菌作用。隨著分離技術(shù)和光譜分析技術(shù)的進(jìn)步，植物化學(xué)研究報道，越來越多的該類聚合體化合物被發(fā)現(xiàn)。自1995年迄今為止，文獻(xiàn)報道分別從百部、大麻、蝶形花、豆科錦雞屬、菊科、苦瓜科、蘭科、買麻藤科、葡萄科、?？啤⑸炙幙频炔煌频?3屬植物中共分離得到此類低聚多酚類化合物已有500多個。該類化合物的活性主要表現(xiàn)在：抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗艾滋病及保肝作用；對環(huán)氧酶、前列腺素H2合成酶、蛋白激酶C等均有強(qiáng)的抑制活性及抗真菌和抗細(xì)菌活性等。近年來我們研究發(fā)現(xiàn)，由于該類化合物具有結(jié)構(gòu)多樣性和生物活性的多樣性，部分這類低聚體的分子還展現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗耐藥菌活性，因而具有的抗生素樣作用。大量文獻(xiàn)研究報道的自然界低聚多酚類化合物具有廣泛的抗菌活性。我們曾發(fā)現(xiàn)了反式-D-葡萄素和龍膽H具有的抗耐藥菌活性，并且已經(jīng)申報了專利“含有龍膽H的天然抗生素飼料添加劑及其制備方法和應(yīng)用”（申請?zhí)枺?015108551149）。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明目的是公開低聚多酚類化合物在制備抗革蘭氏陽性耐藥菌產(chǎn)品的應(yīng)用，且所述的低聚多酚類化合物為反式結(jié)構(gòu)的二聚體和三聚體低聚多酚類化合物。

更進(jìn)一步的，所述的二聚體和三聚體白藜蘆醇低聚多酚類化合物為化合物1：反式-D-葡萄素和化合物2：龍膽H，結(jié)構(gòu)式分別為：

化合物1

化合物2

更進(jìn)一步的，所述的二聚體抗耐藥菌性較三聚體的抗耐藥菌性更強(qiáng)，所述的二聚體反式-D-葡萄素的抗耐藥菌MIC值為8μg/mL，三聚體龍膽H的抗耐藥菌MIC值為16μg/mL。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有下述優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

本發(fā)明首次公開兩個化合物抗耐藥菌譜為革蘭氏陽性耐藥菌，及抗耐藥菌最小抑菌濃度MIC值的評價結(jié)果，是具抗生素效力的天然化合物，該結(jié)果對該類天然低聚多酚化合物的研究有重要科學(xué)意義和應(yīng)用價值。該類化合物以葡萄科、?？坪蜕炙幙七@些植物的籽食含量最高，他們廣泛存在于藥食兩用植物的果實(shí)和籽食中，可作為功能保健品添加劑和重要抗生素樣藥用原料，即低聚多酚類化合物將在制備抗革蘭氏陽性耐藥菌藥物、添加劑、保健品、食品等產(chǎn)品上具有廣泛的應(yīng)用。

具體實(shí)施方式

一、關(guān)于兩個化合物的抗耐藥菌評價

最小抑菌濃度MICs (Minimum Inhibitory Concentration) 采用體外常量肉湯連續(xù)稀釋法測定。具體方法如下。

1．抗菌藥物貯存液制備

陽性對照抗生素萬古霉素和所有菌株，直接購自北京中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所。

具體配置參考NCCLS抗菌藥物敏感性試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)，被測抗菌藥物式I和式II兩個低聚酚類配置濃度為不應(yīng)低于1000μg/ml。如需配制100 ml濃度為1280μg/ml的抗生素貯存液，設(shè)定其藥物的有效力為750μg/mg。用分析天平精確稱取抗生素粉劑的量為182.6mg。根據(jù)公式計(jì)算所需稀釋劑用量為：（182.6mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后將182.6 mg抗生素粉劑溶解于107.0ml稀釋劑中。配制好的抗菌藥物貯存液應(yīng)貯存于-60℃以下環(huán)境，保存期不超過4-6個月。

2.藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基制備

根據(jù)NCCLS抗菌藥物敏感性試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)，培養(yǎng)基使用Mueller-Hinton（MH）肉湯，pH7.2~7.4。另外在肉湯中加入2%（W/V）氯化鈉。按制造廠家的要求配制需要量的MH肉湯。

3. 接種物的制備采用直接菌落懸液配制法。

耐甲氧西林葡萄球菌直接取培養(yǎng)18~24h。即取1-2個耐甲氧西林葡萄球菌菌落置上述2的培養(yǎng)液中，調(diào)配成0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液。

取用MH肉湯將上述菌懸液進(jìn)行1∶1稀釋后備用。注意應(yīng)在15分鐘內(nèi)接種完配制好的接種物，并取一份接種物在非選擇性瓊脂平板上傳代培養(yǎng)，以檢查接種物純度。

4. 稀釋抗菌藥物的制備及菌液接種

取無菌試管（13x100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉湯外，其余每管加入MH肉湯1ml，在第1管加入式I抗菌藥物原液（如1280μg/ml）0.4ml混勻，然后吸取1ml至第2管，混勻后再吸取1ml至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第11管，并從第11管中吸取1ml棄去，第12管為不含藥物的生長對照。此時各管藥物濃度依次為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管內(nèi)加入上述制備好的接種物各1ml，使每管最終菌液濃度約為5×105CFU/ml。第1管至第11管藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 、0.125μg/ml. 同樣，式II低聚酚類化合物和陽性對照萬古霉素如上同樣操作。將接種好的稀釋管塞好塞子孵育，置35℃普通空氣孵箱中孵育滿24h。

5、結(jié)果判斷與解釋

在讀取和報告所測試菌株的MIC前，應(yīng)檢查生長對照管的細(xì)菌生長情況是否良好，同時還應(yīng)檢查接種物的傳代培養(yǎng)情況以確定其是否污染，質(zhì)控菌株的MIC值是否處于質(zhì)控范圍。以肉眼觀察，藥物最低濃度管無細(xì)菌生長者，即為受試菌的MIC。與陽性生長對照管比較抑制80%細(xì)菌生長管藥物濃度為受試菌MIC。

表1. 天然低聚多酚化合物I和II抗耐藥菌測定(MIC平皿法，單位μg/ml)

如上，天然低聚多酚化合物I和II抗耐藥菌測定結(jié)果見表1.所示。

從表1中可知，1）化合物式I （Trans-ε-Viniferin，反式-D-葡萄素）抗耐甲氧西林葡萄球菌（MRSA）和耐表皮葡萄球菌（MSSE）均為8μg/ml； 式II （Gentin H，龍膽H）抗耐表皮葡萄球菌（MSSE）為16μg/ml，抗耐藥屎腸球菌 （VRE）的MIC值為16μg/ml。它們均顯示強(qiáng)的抗革蘭氏陽性耐藥菌活性，對所有的革蘭氏陰性耐藥菌均大于128μg/ml，因此無抗革蘭氏陰性耐藥菌的活性。2）從化合物式I到式II，實(shí)際上是從二聚體到三聚體的改變，水溶性逐漸減小，抗耐藥菌活性減弱。因此化合物I二聚體抗耐藥菌性更強(qiáng)。3）通過對兩個化合物構(gòu)效關(guān)系對比研究可知，化合物I和II都為反式構(gòu)型；相反順式構(gòu)型無論是I還是結(jié)構(gòu)式II，實(shí)驗(yàn)顯示均沒有抗耐藥菌活性。

二、天然低聚多酚化合物I和II抗耐藥菌測定操作實(shí)施例：

實(shí)施例1. 從葡萄籽提取化合物I和II及抗耐藥菌測定

（1）化合物I和II的提?。?/p>

葡萄籽7公斤，用70% 乙醇常溫浸泡，持續(xù)3天，重復(fù)兩次。將得到的浸出液減壓蒸餾，得到乙醇浸膏400 g。取300 g乙醇浸膏，將乙醇浸膏用溶劑溶解后，取大孔樹脂脫色后，再用800 g硅膠（100-200目）拌樣裝住。首先用5倍柱體積的乙酸乙酯進(jìn)行洗脫，然后用5倍柱體積的丙酮進(jìn)行洗脫。洗脫液分別做減壓蒸餾，得到乙酸乙酯浸膏80 g和丙酮87 g浸膏。

取丙酮提取物，通過Waters高效液相制備色譜（甲醇：水55:45，流速8ml/min，YMC ODS C18，250*20mm）, 得組分F1 ，F(xiàn)2，F(xiàn)3和F4. 組分F1通過Waters高效液相色譜（甲醇：水50:50，流速8ml/min，YMC ODS C18，250*20mm），得化合物II（Gnetin H）；組分F3通過Waters高效液相色譜（甲醇：水45:55，流速8ml/min，YMC ODS C18，250*20mm），得化合物I （Trans-ε-Viniferin反式-D-葡萄素）。

（2）化合物I和II的抗耐藥菌測定：

1．抗菌藥物貯存液制備

陽性對照抗生素萬古霉素和所有菌株，直接購自北京中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所。

具體配置參考NCCLS抗菌藥物敏感性試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)，被測抗菌藥物式I和式II兩個低聚酚類配置濃度為不應(yīng)低于1000μg/ml。用分析天平精確稱取抗生素粉劑的量為171.2mg。根據(jù)公式計(jì)算所需稀釋劑用量為：（171.2mg×750μg/ml）/1200μg/ml=107.0ml，然后將171.2mg抗生素粉劑溶解于107.0ml稀釋劑中。配制好的抗菌藥物貯存液應(yīng)貯存于-60℃以下環(huán)境，保存期不超過4-6個月。

2.藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基制備

根據(jù)NCCLS抗菌藥物敏感性試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)，培養(yǎng)基使用Mueller-Hinton（MH）肉湯，pH7.2~7.4。另外在肉湯中加入2%（W/V）氯化鈉。按制造廠家的要求配制需要量的MH肉湯。

3. 接種物的制備采用直接菌落懸液配制法。耐甲氧西林葡萄球菌直接取培養(yǎng)18~24h。即取1-2個耐甲氧西林葡萄球菌菌落置上述2的培養(yǎng)液中，調(diào)配成0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液。

取用MH肉湯將上述菌懸液進(jìn)行1∶1稀釋后備用。注意應(yīng)在15分鐘內(nèi)接種完配制好的接種物，并取一份接種物在非選擇性瓊脂平板上傳代培養(yǎng)，以檢查接種物純度。

4. 稀釋抗菌藥物的制備及菌液接種

取無菌試管（13x100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉湯外，其余每管加入MH肉湯1ml，在第1管加入式I抗菌藥物原液（如1200μg/ml）0.4ml混勻，然后吸取1ml至第2管，混勻后再吸取1ml至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第11管，并從第11管中吸取1ml棄去，第12管為不含藥物的生長對照。此時各管藥物濃度依次為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管內(nèi)加入上述制備好的接種物各1ml，使每管最終菌液濃度約為5×105CFU/ml。第1管至第11管藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 、0.125μg/ml. 同樣，式II低聚酚類化合物和陽性對照萬古霉素如上同樣操作。將接種好的稀釋管塞好塞子孵育，置35℃普通空氣孵箱中孵育滿24h。

5、結(jié)果判斷與解釋

在讀取和報告所測試菌株的MIC前，應(yīng)檢查生長對照管的細(xì)菌生長情況是否良好，同時還應(yīng)檢查接種物的傳代培養(yǎng)情況以確定其是否污染，質(zhì)控菌株的MIC值是否處于質(zhì)控范圍。以肉眼觀察，藥物最低濃度管無細(xì)菌生長者，即為受試菌的MIC。與陽性生長對照管比較抑制80%細(xì)菌生長管藥物濃度為受試菌MIC值。

本實(shí)施例所得兩個化合物抗耐藥菌MIC值測試結(jié)果如表 1所示。

實(shí)施例2. 從鳳丹白牡丹籽中提取化合物I和II及抗耐藥菌測定

（1）化合物I和II的提?。?/p>

購置鳳丹白牡丹籽7公斤，干燥脫殼。將牡丹籽殼粉碎用70%乙醇常溫浸泡，持續(xù)3天，重復(fù)兩次。將得到的浸出液減壓蒸餾，得到乙醇浸膏400 g。取300 g乙醇浸膏，將乙醇浸膏用溶劑溶解后，取大孔樹脂脫色后，再用800 g硅膠（100-200目）拌樣裝住。首先用5倍柱體積的乙酸乙酯進(jìn)行洗脫，然后用5倍柱體積的丙酮進(jìn)行洗脫。洗脫液分別做減壓蒸餾，得到乙酸乙酯浸膏110 g和丙酮150 g浸膏。

取丙酮提取物，通過Waters高效液相制備色譜（甲醇：水55:45，流速8ml/min，YMC ODS C18，250*20mm）, 得組分F1 ，F(xiàn)2，F(xiàn)3和F4. 組分F1通過Waters高效液相色譜（甲醇：水50:50，流速8ml/min，YMC ODS C18，250*20mm），得化合物II（Gnetin H）；組分F3通過Waters高效液相色譜（甲醇：水45:55，流速8ml/min，YMC ODS C18，250*20mm），得化合物I （Trans-ε-Viniferin反式-D-葡萄素）。

（2）化合物I和II的抗耐藥菌測定：

1．抗菌藥物貯存液制備

陽性對照抗生素萬古霉素和所有菌株，直接購自北京中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所。

具體配置參考NCCLS抗菌藥物敏感性試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)，被測抗菌藥物式I和式II兩個低聚酚類配置濃度為不應(yīng)低于1000μg/ml。如需配制100 ml濃度為1150μg/ml的抗生素貯存液，設(shè)定其藥物的有效力為750μg/mg。用分析天平精確稱取抗生素粉劑的量為164.1mg。根據(jù)公式計(jì)算所需稀釋劑用量為：（164.1mg×750μg/ml）/1150μg/ml=107.0ml，然后將164.1 mg抗生素粉劑溶解于107.0ml稀釋劑中。配制好的抗菌藥物貯存液應(yīng)貯存于-60℃以下環(huán)境，保存期不超過4-6個月。

2.藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基制備

根據(jù)NCCLS抗菌藥物敏感性試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)，培養(yǎng)基使用Mueller-Hinton（MH）肉湯，pH7.2~7.4。另外在肉湯中加入2%（W/V）氯化鈉。按制造廠家的要求配制需要量的MH肉湯。

3. 接種物的制備采用直接菌落懸液配制法。耐甲氧西林葡萄球菌直接取培養(yǎng)18~24h。即取1-2個耐甲氧西林葡萄球菌菌落置上述2的培養(yǎng)液中，調(diào)配成0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液。

取用MH肉湯將上述菌懸液進(jìn)行1∶1稀釋后備用。注意應(yīng)在15分鐘內(nèi)接種完配制好的接種物，并取一份接種物在非選擇性瓊脂平板上傳代培養(yǎng)，以檢查接種物純度。

4. 稀釋抗菌藥物的制備及菌液接種

取無菌試管（13x100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉湯外，其余每管加入MH肉湯1ml，在第1管加入式I抗菌藥物原液（如1150μg/ml）0.4ml混勻，然后吸取1ml至第2管，混勻后再吸取1ml至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第11管，并從第11管中吸取1ml棄去，第12管為不含藥物的生長對照。此時各管藥物濃度依次為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管內(nèi)加入上述制備好的接種物各1ml，使每管最終菌液濃度約為5×105CFU/ml。第1管至第11管藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 、0.125μg/ml. 同樣，式II低聚酚類化合物和陽性對照萬古霉素如上同樣操作。將接種好的稀釋管塞好塞子孵育，置35℃普通空氣孵箱中孵育滿24h。

5.結(jié)果判斷與解釋

在讀取和報告所測試菌株的MIC前，應(yīng)檢查生長對照管的細(xì)菌生長情況是否良好，同時還應(yīng)檢查接種物的傳代培養(yǎng)情況以確定其是否污染，質(zhì)控菌株的MIC值是否處于質(zhì)控范圍。以肉眼觀察，藥物最低濃度管無細(xì)菌生長者，即為受試菌的MIC。與陽性生長對照管比較抑制80%細(xì)菌生長管藥物濃度為受試菌MIC值。

本實(shí)施例所得兩個化合物抗耐藥菌MIC值測試結(jié)果如表 1所示。

實(shí)施例3. 從紫斑牡丹籽中提取化合物I和II及抗耐藥菌測定

（1）化合物I和II的提?。?/p>

購置鳳丹牡丹籽7公斤，干燥脫殼。將牡丹籽殼粉碎用70%乙醇常溫浸泡，持續(xù)3天，重復(fù)兩次。將得到的浸出液減壓蒸餾，得到乙醇浸膏400 g。取300 g乙醇浸膏，將乙醇浸膏用溶劑溶解后，取大孔樹脂脫色后，再用800 g硅膠（100-200目）拌樣裝住。首先用5倍柱體積的乙酸乙酯進(jìn)行洗脫，然后用5倍柱體積的丙酮進(jìn)行洗脫。洗脫液分別做減壓蒸餾，得到乙酸乙酯浸膏110 g和丙酮150 g浸膏。

取丙酮提取物，通過Waters高效液相制備色譜（甲醇：水55:45，流速8ml/min，YMC ODS C18，250*20mm）, 得組分F1 ，F(xiàn)2，F(xiàn)3和F4. 組分F1通過Waters高效液相色譜（甲醇：水50:50，流速8ml/min，YMC ODS C18，250*20mm），得化合物II龍膽H（Gnetin H）； 組分F3通過Waters高效液相色譜（甲醇：水45:55，流速8ml/min，YMC ODS C18，250*20mm），得化合物I 反式-D-葡萄素（Trans-ε-Viniferin）。

（2）化合物I和II的抗耐藥菌測定：

1．抗菌藥物貯存液制備

陽性對照抗生素萬古霉素和所有菌株，直接購自北京中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所。

具體配置參考NCCLS抗菌藥物敏感性試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)，被測抗菌藥物式I和式II兩個低聚酚類配置濃度為不應(yīng)低于1000μg/mL。如需配制100 mL濃度為1150μg/mL的抗生素貯存液，設(shè)定其藥物的有效力為750μg/mg。用分析天平精確稱取抗生素粉劑的量為164.1μg。根據(jù)公式計(jì)算所需稀釋劑用量為：（164.1μg×750μg/mL）/1150μg/mL=107.0mL，然后將164.1μg抗生素粉劑溶解于107.0mL稀釋劑中。配制好的抗菌藥物貯存液應(yīng)貯存于-60℃以下環(huán)境，保存期不超過4-6個月。

2.藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基制備

根據(jù)NCCLS抗菌藥物敏感性試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)，培養(yǎng)基使用Mueller-Hinton（MH）肉湯，pH7.2~7.4。另外在肉湯中加入2%（W/V）氯化鈉。按制造廠家的要求配制需要量的MH肉湯。

3. 接種物的制備采用直接菌落懸液配制法。耐甲氧西林葡萄球菌直接取培養(yǎng)18~24h。即取1-2個耐甲氧西林葡萄球菌菌落置上述2的培養(yǎng)液中，調(diào)配成0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液。

取用MH肉湯將上述菌懸液進(jìn)行1∶1稀釋后備用。注意應(yīng)在15分鐘內(nèi)接種完配制好的接種物，并取一份接種物在非選擇性瓊脂平板上傳代培養(yǎng)，以檢查接種物純度。

4. 稀釋抗菌藥物的制備及菌液接種

取無菌試管（13x100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉湯外，其余每管加入MH肉湯1mLl，在第1管加入式I抗菌藥物原液（如1150μg/mL）0.4ml混勻，然后吸取1mL至第2管，混勻后再吸取1mL至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第11管，并從第11管中吸取1mL棄去，第12管為不含藥物的生長對照。此時各管藥物濃度依次為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/mL。然后在每管內(nèi)加入上述制備好的接種物各1ml，使每管最終菌液濃度約為5×105CFU/mL。第1管至第11管藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 、0.125μg/mL. 同樣，式II低聚酚類化合物和陽性對照萬古霉素如上同樣操作。將接種好的稀釋管塞好塞子孵育，置35℃普通空氣孵箱中孵育滿24h。

5.結(jié)果判斷與解釋

在讀取和報告所測試菌株的MIC前，應(yīng)檢查生長對照管的細(xì)菌生長情況是否良好，同時還應(yīng)檢查接種物的傳代培養(yǎng)情況以確定其是否污染，質(zhì)控菌株的MIC值是否處于質(zhì)控范圍。以肉眼觀察，藥物最低濃度管無細(xì)菌生長者，即為受試菌的MIC。與陽性生長對照管比較抑制80%細(xì)菌生長管藥物濃度為受試菌MIC值。

本實(shí)施例所得兩個化合物抗耐藥菌MIC值測試結(jié)果如表 1所示。