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發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑作為提高細(xì)胞內(nèi)cgmp產(chǎn)量的方法，在治療上的用途。該激動(dòng)劑可以單獨(dú)使用或者與cgmp-特異的磷酸二酯酶的抑制劑聯(lián)合使用，以預(yù)防或治療癌變的、癌變前的以及轉(zhuǎn)移性的腫瘤生長(zhǎng)，尤其是在胃腸道及肺部。除此以外，該激動(dòng)劑還可以用于治療炎癥，如潰瘍性結(jié)腸炎和哮喘。

發(fā)明背景

尿鳥苷蛋白、鳥苷蛋白和細(xì)菌st肽是在結(jié)構(gòu)上相關(guān)的肽，它們與鳥苷酸環(huán)化酶受體結(jié)合并刺激細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生環(huán)化鳥嘌呤核苷單磷酸(cgmp)(1-6)。這導(dǎo)致了囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(cftr)的激活，cftr是一個(gè)頂端膜通道，用于氯從沿腸道排列的腸細(xì)胞外排(1-6)。cftr的激活以及隨后的氯的跨上皮分泌的增加導(dǎo)致激發(fā)鈉和水向腸腔內(nèi)的分泌。因此，cgmp受體激動(dòng)劑通過(guò)作為cftr的旁分泌調(diào)控因子，可以調(diào)控胃腸道內(nèi)液體和電解質(zhì)的運(yùn)輸(1-6,美國(guó)專利5,489,670)。

上皮的更新過(guò)程包括胃腸道細(xì)胞在胃腸腔內(nèi)的增殖、遷移、分化、衰老以及最終的喪失(7,8)。根據(jù)上皮細(xì)胞的增殖指數(shù)，胃腸粘膜可以分為三個(gè)明顯的區(qū)帶。其中的一個(gè)區(qū)帶——增殖區(qū)帶，由未分化的干細(xì)胞組成，這些干細(xì)胞提供新生細(xì)胞的持續(xù)來(lái)源。干細(xì)胞向腸腔方向遷移，并被擠壓進(jìn)入腸腔。在遷移時(shí)，細(xì)胞失去其分裂的能力，并分化為執(zhí)行胃腸粘膜特異功能的細(xì)胞(9)。胃腸粘膜的更新非常迅速，其在24到48小時(shí)以內(nèi)完全更新一次(9)。在這一過(guò)程中，突變的和不需要的細(xì)胞被新的細(xì)胞補(bǔ)充。因此，胃腸粘膜的穩(wěn)態(tài)由增殖速率和細(xì)胞凋亡速率之間的平衡的連續(xù)維來(lái)調(diào)控(8)。

消化道上皮細(xì)胞的細(xì)胞增殖速率和凋亡速率可以由于多種不同的情況被增加或降低，例如對(duì)于生理刺激如衰老、炎癥信號(hào)、激素、肽、生長(zhǎng)因子、化學(xué)物質(zhì)和飲食習(xí)慣的反應(yīng)。除此以外，提高的增殖速率常常與全更新時(shí)間的減少和增殖區(qū)帶的擴(kuò)張有關(guān)(10)。據(jù)觀察，增殖指數(shù)在潰瘍性結(jié)腸炎和其他胃腸疾病的病理情況下要高很多(11)。因此，腸增生是胃腸炎癥和癌癥發(fā)生的主要促進(jìn)原因。

尿鳥苷蛋白和鳥苷蛋白除了具有對(duì)腸內(nèi)液體和離子分泌的調(diào)節(jié)作用以外，這些肽還可能參與胃腸道粘膜的持續(xù)更新。以前在wo01/25266中公開的數(shù)據(jù)提示，具有尿鳥苷蛋白活性結(jié)構(gòu)域的肽可能具有結(jié)腸息肉生長(zhǎng)抑制劑的功能，并可能成為結(jié)腸癌的一種治療方法。但是，該功能出現(xiàn)所依據(jù)的機(jī)制還不能確定，因?yàn)閣o01/25266中教導(dǎo)尿鳥苷蛋白激動(dòng)肽與稱為gc-c的鳥苷酸環(huán)化酶受體特異結(jié)合，該鳥苷酸環(huán)化酶受體最早被描述為大腸桿菌(e.coli)中熱穩(wěn)定的腸毒素(st)受體(4)。缺失這個(gè)鳥苷酸環(huán)化酶受體的基因敲除小鼠在腸內(nèi)對(duì)st表現(xiàn)出抗性，但在腎臟體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，尿鳥苷蛋白和st的作用沒有受到影響(3)。這些結(jié)果受到下面事實(shí)的進(jìn)一步支持：鳥苷蛋白引起的膜的去極化被酪氨酸激酶抑制劑——染料木黃酮(5,7,4'－三羥基異黃酮)阻斷，而尿鳥苷蛋白引起的膜的超極化不受影響(12,13)。這些數(shù)據(jù)一起，提示尿鳥苷蛋白也與一個(gè)目前還不清楚的、與gc-c不同的受體結(jié)合。

另外一些文章也報(bào)道了在癌變?cè)缙诘慕Y(jié)腸息肉和腫瘤組織中，尿鳥苷蛋白和鳥苷蛋白的產(chǎn)量顯著降低(14-17)。除此以外，還發(fā)現(xiàn)編碼尿鳥苷蛋白和鳥苷蛋白的基因定位在常常與人結(jié)腸腫瘤中雜合性的喪失有關(guān)的基因組區(qū)域內(nèi)(18-20)。這些發(fā)現(xiàn)一起表明尿鳥苷蛋白、鳥苷蛋白以及其他有相似活性的肽可以用于結(jié)腸異常性生長(zhǎng)的預(yù)防和治療。這個(gè)提議得到了最近一項(xiàng)研究的支持，該研究證明了鳥苷蛋白的口服給藥抑制了小鼠中息肉的形成(15,16)。

尿鳥苷蛋白和鳥苷蛋白肽看起來(lái)也通過(guò)控制細(xì)胞的離子流而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡的改變與腫瘤發(fā)展為轉(zhuǎn)移性表型有關(guān)。原發(fā)性的胃腸癌只限于小腸、結(jié)腸和直腸，但癌變可以轉(zhuǎn)移并擴(kuò)張至骨、淋巴結(jié)、肝臟、肺、腹膜、卵巢、大腦等部位。通過(guò)提高鉀離子的外流和鈣離子的內(nèi)流，尿鳥苷蛋白和相關(guān)肽可以促進(jìn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的死亡，從而抑制癌變轉(zhuǎn)移。

降低的cftr活性的一項(xiàng)臨床表現(xiàn)是呼吸道的炎癥(21)。這一結(jié)果可能歸因于ctfr調(diào)控nf-kb、趨化因子和細(xì)胞因子的表達(dá)(22-25)。最近的報(bào)道也提示cftr通道與還原型谷胱甘肽的運(yùn)輸和維持有關(guān)。還原型谷胱甘肽是抗氧化劑，在防止因氧化脅迫而產(chǎn)生的炎癥方面起著重要作用(39)。通過(guò)激活鳥苷酸環(huán)化酶或抑制cgmp特異的磷酸二酯酶這兩條途徑而產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)cgmp水平的提高，可預(yù)計(jì)對(duì)這些炎癥刺激有減量調(diào)節(jié)的作用。因此，尿鳥苷蛋白型的激動(dòng)劑應(yīng)該在肺(如哮喘)、腸[如潰瘍性結(jié)腸炎和節(jié)段性回腸炎(克羅恩氏病)]、胰腺和其他器官炎癥的預(yù)防和治療中有用。

總之可以得出結(jié)論，鳥苷酸環(huán)化酶受體的激動(dòng)劑如尿鳥苷蛋白，在多種炎癥、癌癥(特別是結(jié)腸癌)的治療中以及作為抗轉(zhuǎn)移藥物，都具有潛在的治療價(jià)值。因此，新型激動(dòng)劑的開發(fā)在臨床上具有實(shí)質(zhì)的重要性。

發(fā)明概述

本發(fā)明基于新型鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑的開發(fā)和天然存在的激動(dòng)劑的新用途。這些激動(dòng)劑是尿鳥苷蛋白的類似物，其中許多具有很優(yōu)良的性質(zhì)，在低ph下具有提高的受體激活能力、穩(wěn)定性、活性或者降低的副作用。這些肽可以用于治療任何對(duì)細(xì)胞內(nèi)提高的cgmp水平反應(yīng)的情況。提高細(xì)胞內(nèi)cgmp的產(chǎn)量和/或通過(guò)cgmp特異的磷酸二酯酶抑制cgmp的降解都可以提高細(xì)胞內(nèi)的cgmp水平。在能夠被預(yù)防或治療的具體情況中有炎癥、癌癥、息肉和癌轉(zhuǎn)移。

首先，本發(fā)明針對(duì)基本由seqidno：2-21中任意一個(gè)氨基酸序列組成的肽以及含有這些肽的治療用組合物。術(shù)語(yǔ)“基本由…組成”包括肽，其序列與上面列舉的帶有標(biāo)識(shí)序號(hào)的序列相同以及在結(jié)構(gòu)或功能上與這些序列沒有根本區(qū)別的其他序列。對(duì)于本申請(qǐng)的目的，如果一個(gè)肽在結(jié)構(gòu)上相對(duì)于seqidno：2-21中的肽有三個(gè)以上氨基酸的變化，或者其激活細(xì)胞內(nèi)cgmp產(chǎn)生的能力有50％的增加或減少，則該肽有根本的區(qū)別。優(yōu)選，基本相似的肽不應(yīng)該有兩個(gè)以上氨基酸的差異，并且在激活cgmp產(chǎn)生方面的差異不應(yīng)該大于25％。最優(yōu)選的肽是具有seqidno：20序列的雙環(huán)肽。

這些肽可以與一或多種賦形劑一起，以單位劑量形式出現(xiàn)在藥物組合物中。術(shù)語(yǔ)“單位劑量形式”指一個(gè)單一給藥實(shí)體，如片劑、膠囊、溶液或吸入制劑。加入的肽量應(yīng)該為在給患者用藥時(shí)，足以產(chǎn)生有效的治療作用(一般在100微克與3克之間)。“有效的治療作用”的建立取決于被治療的特定情況，而且包括本領(lǐng)域技術(shù)人員容易識(shí)別的狀況的任何顯著改善。例如，有效的治療作用可以包括炎癥的減少、息肉或腫瘤的縮小、轉(zhuǎn)移性損害的減少等等。

本發(fā)明還包含了聯(lián)合療法，使用鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑單獨(dú)給藥或與cgmp依賴的磷酸二酯酶的抑制劑、抗炎癥藥劑或抗癌藥劑一起給藥。這些藥劑的量應(yīng)當(dāng)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的給患者服用后有治療效果的量?？鼓[瘤藥劑可以包括烷基化試劑、表鬼臼毒素、亞硝基脲、抗代謝物、長(zhǎng)春花生物堿、蒽環(huán)類抗生素、氮芥試劑以及類似的物質(zhì)。具體的抗腫瘤藥劑可以包括三苯氧胺(它莫西芬)、紫杉醇、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷和5-氟尿嘧啶。在設(shè)計(jì)適合于患者具體需要的治療方案時(shí)，抗病毒和單克隆抗體療法可以與包括至少一種鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑的化療組合物聯(lián)合使用。

另一方面，本發(fā)明針對(duì)通過(guò)給患者服用含有效量鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑——優(yōu)選合成的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑的組合物來(lái)預(yù)防、治療或減緩受治療者的癌癥，特別是上皮細(xì)胞癌癥或息肉發(fā)作的方法。術(shù)語(yǔ)“有效量”是指能夠可測(cè)量地提高細(xì)胞內(nèi)cgmp水平的足量的激動(dòng)劑。術(shù)語(yǔ)“合成的”是指制造的與鳥苷酸環(huán)化酶受體結(jié)合的肽，但該肽含有某些在已知的內(nèi)源鳥苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑——如尿鳥苷蛋白中不存在的氨基酸序列替換。該激動(dòng)劑應(yīng)當(dāng)選自由seqidno：2-21限定的，并且列在表2和表3中的肽。本發(fā)明還包括了通過(guò)給患者服用有效劑量的選自尿鳥苷蛋白、鳥苷蛋白和大腸桿菌st肽的肽來(lái)治療原發(fā)性癌癥而非原發(fā)性結(jié)腸癌的方法。盡管優(yōu)選使用人類的肽，但是任何已知形式的尿鳥苷蛋白或鳥苷蛋白都可以用于此目的。

本發(fā)明還包括預(yù)防或治療來(lái)源于原發(fā)性腫瘤塊的腫瘤轉(zhuǎn)移。依據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的肽可以靶向具有鳥苷酸環(huán)化酶受體的轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在胃腸癌細(xì)胞上和源自這些癌的轉(zhuǎn)移細(xì)胞上，會(huì)發(fā)現(xiàn)被靶向的受體。這種受體一般是跨膜蛋白，具有細(xì)胞外配基結(jié)合結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域和具有鳥苷酸環(huán)化酶活性的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。盡管本發(fā)明沒有任何特殊作用機(jī)制的限制，但是一般認(rèn)為這些肽通過(guò)與這些細(xì)胞受體相結(jié)合并引發(fā)細(xì)胞凋亡而發(fā)生作用。轉(zhuǎn)移性的腫瘤也可以通過(guò)給藥任意已知形式的尿鳥苷蛋白或鳥苷蛋白(優(yōu)選人源的)或給藥大腸桿菌st肽進(jìn)行治療。

肽可以單獨(dú)給藥或者與一或多種cgmp依賴的磷酸二酯酶的抑制劑一起給藥。cgmp依賴的磷酸二酯酶的抑制劑的例子有suldinac砜，苯氮嘌呤酮和motapizone?？梢灾委煹陌┌Y形式包括乳腺癌、直腸癌，肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌和睪丸癌。可以施用根據(jù)本發(fā)明的組合物通過(guò)抑制癌變?cè)缙谥蹦c息肉的發(fā)育而預(yù)防結(jié)腸癌的發(fā)生。可以認(rèn)為這些肽對(duì)治療結(jié)腸癌和預(yù)防結(jié)腸腫瘤轉(zhuǎn)移應(yīng)該非常有效。

第三方面，本發(fā)明針對(duì)通過(guò)施用含有可以提高細(xì)胞內(nèi)cgmp產(chǎn)量的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑的組合物來(lái)治療、防治或延緩受治療者器官炎癥(如與胃腸道、哮喘、腎炎、肝炎、胰腺炎、支氣管炎或囊腫性纖維化有關(guān)的炎癥)發(fā)作的方法。優(yōu)選的肽激動(dòng)劑選自表2和表3所示的seqidno：2-21定義的肽，或者是尿鳥苷蛋白、鳥苷蛋白或大腸桿菌st肽。這些肽可選與一或多種cgmp依賴的磷酸二酯酶的抑制劑，如suldinac砜，苯氮嘌呤酮或motapizone一起給患者服用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明針對(duì)治療哺乳動(dòng)物的胃腸道炎癥的方法。炎癥可以歸為發(fā)炎性腸部疾病，更為具體地可以是節(jié)段性回腸炎(克羅恩氏病)或潰瘍性結(jié)腸炎。給藥方式可以是腸溶性的，并使用適于靶向腸細(xì)胞的制劑。

從更廣義的意義上講，本發(fā)明包括通過(guò)給患者施用有效量的具有seqidno：2-21中任一序列的肽，或者尿鳥苷蛋白、鳥苷蛋白或大腸桿菌st肽來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法。在這一意義上，“有效量”的肽所指足以在目標(biāo)組織中提高細(xì)胞凋亡的量。例如，在腫瘤生長(zhǎng)中可以給予足量的肽以誘導(dǎo)提高速率的細(xì)胞死亡。

最優(yōu)選用于上述方法的肽是seqidno：20所限定的肽。其序列如下(也請(qǐng)參見表3)：

且其中在第4位的半胱氨酸和第12位的半胱氨酸之間有一個(gè)二硫鍵；第二個(gè)二硫鍵位于第7位的半胱氨酸和第15位的半胱氨酸之間(seqidno：20)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)由于該肽對(duì)于鳥苷酸環(huán)化酶受體提高的結(jié)合常數(shù)，作為cgmp產(chǎn)生的激動(dòng)劑，它具有增強(qiáng)的生物活性。在溫度和蛋白酶穩(wěn)定性方面以及在大腸中生理適宜ph值(ph6-7)時(shí)的生物活性方面，該肽優(yōu)于尿鳥苷蛋白。

上述方法中使用的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑可以口服、全身或局部方式給藥。劑量形式包括吸入或注射的制劑、溶液、懸浮液、乳劑、片劑、膠囊、局部軟膏和洗劑、透皮組合物，其他已知的肽劑型和pegylated肽類似物。組合物的有效劑量一般在約1微克到約10毫克每千克體重之間，優(yōu)選在約10微克到5毫克每千克體重之間。使用本領(lǐng)域的常規(guī)方法并依據(jù)具體的組合物和臨床的考慮調(diào)整劑量。激動(dòng)劑可以以單一活性藥劑的形式給藥，或者與其他藥物如cgmp依賴的磷酸二酯酶的抑制劑一起給藥。在所有情況下，其他藥物的給藥劑量應(yīng)當(dāng)以本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)為指導(dǎo)的治療有效劑量。可以以單一組合物或逐一給藥的方式給藥。

發(fā)明詳述

本發(fā)明建立在多種原理上。首先是依賴cgmp的機(jī)制，其調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡之間的平衡，并且由于尿鳥苷蛋白/鳥苷蛋白的缺乏和/或cgmp特異的磷酸二酯酶的激活而導(dǎo)致的cgmp水平的降低，這是腫瘤轉(zhuǎn)化中早期且至關(guān)重要的一步。第二個(gè)原理是花生四烯酸從膜磷脂上的釋放將導(dǎo)致在發(fā)炎過(guò)程中cpla2、cox-2及可能還有5-脂氧合酶的激活，該釋放受到依賴cgmp機(jī)制的負(fù)調(diào)控，這會(huì)導(dǎo)致前列腺素和白三烯水平的降低，并且提高胞內(nèi)的cgmp水平因此可以產(chǎn)生抗炎癥反應(yīng)。除此以外，依賴cgmp的機(jī)制被認(rèn)為參與促炎過(guò)程的調(diào)控。因此，升高胞內(nèi)cgmp水平可以用作治療和控制腸部發(fā)炎性疾病如潰瘍性結(jié)腸炎和節(jié)段性回腸炎(克羅恩氏病)及其他器官炎癥(例如與哮喘、腎炎、肝炎、胰腺炎、支氣管炎、囊腫性纖維化有關(guān)的炎癥)的一種方法。

并非局限于任何理論，預(yù)想離子跨細(xì)胞膜的運(yùn)輸可以被證明是細(xì)胞增殖和凋亡之間平衡的重要調(diào)控因子，這個(gè)平衡會(huì)受到能夠改變cgmp濃度的組合物的影響。已有證據(jù)顯示尿苷蛋白促進(jìn)胃腸道中鉀離子外流，鈣離子內(nèi)流以及水的運(yùn)輸(3)。此外，已發(fā)現(xiàn)心房肽(anp),一個(gè)也可以與特異的鳥苷酸環(huán)化酶受體結(jié)合的肽，誘導(dǎo)大鼠血管系膜細(xì)胞的凋亡，并通過(guò)依賴cgmp的機(jī)制誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡(26-29)。可以認(rèn)為本發(fā)明的激動(dòng)劑與鳥苷酸環(huán)化酶受體的結(jié)合促進(jìn)cgmp的產(chǎn)生。這種配基－受體相互作用，通過(guò)激活依賴cgmp的蛋白激酶和cftr的級(jí)聯(lián)作用，預(yù)期會(huì)誘導(dǎo)目標(biāo)細(xì)胞的凋亡。因此，施用如表2和表3中所示的seqidno：2-21所限定的新型肽，或者尿鳥苷蛋白、或鳥苷蛋白或大腸桿菌st肽，預(yù)期會(huì)消除，或至少延緩，胃腸道炎癥的發(fā)作和普通器官發(fā)炎(如哮喘、腎炎、肝炎、胰腺炎、支氣管炎和囊腫性纖維化)。

在第二方面，本發(fā)明針對(duì)通過(guò)施用含有有效量的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑的組合物，優(yōu)選合成的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑，來(lái)治療、防治或延緩受治療者的癌癥，特別是上皮細(xì)胞癌癥發(fā)作的方法。術(shù)語(yǔ)“有效量”指可以使胞內(nèi)cgmp水平產(chǎn)生可測(cè)量增加的足量的激動(dòng)劑。術(shù)語(yǔ)“合成的”指制造出來(lái)與鳥苷酸環(huán)化酶受體結(jié)合的肽，卻含有某些已知的內(nèi)源鳥苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑——如尿鳥苷蛋白中不存在的氨基酸序列替換。該激動(dòng)劑應(yīng)當(dāng)是選自seqidno：2-21所限定的，及在表2和表3中列出的肽。本發(fā)明還包括了通過(guò)施用有效劑量的選自尿鳥苷蛋白、鳥苷蛋白和大腸桿菌st肽的肽，來(lái)治療除原發(fā)性結(jié)腸癌以外的原發(fā)癌癥的方法。盡管優(yōu)選使用人源的肽，但是任何已知形式的尿鳥苷蛋白或鳥苷蛋白都可以用于此目的。

調(diào)控轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞增殖和凋亡之間平衡的依賴cgmp的機(jī)制可以作為靶向和治療轉(zhuǎn)移性腫瘤的機(jī)制。肝臟是最常見的從原發(fā)性結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的位置。在癌癥的后期，結(jié)直腸的轉(zhuǎn)移性細(xì)胞也可以侵襲身體的其他部位。應(yīng)重點(diǎn)注意的是來(lái)源于胃腸道中原發(fā)位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移性細(xì)胞一般會(huì)繼續(xù)表達(dá)鳥苷酸環(huán)化酶受體，因此，這些細(xì)胞應(yīng)當(dāng)對(duì)由腸部鳥苷酸環(huán)化酶受體介導(dǎo)的凋亡療法敏感。具有尿鳥苷蛋白活性的肽，在單獨(dú)使用或與cgmp-磷酸二酯酶的特異抑制劑一起使用時(shí)，也會(huì)通過(guò)cgmp介導(dǎo)的機(jī)制，恢復(fù)細(xì)胞增殖和凋亡間的健康平衡，而延緩消化道上皮的癌癥發(fā)生。

這里使用的術(shù)語(yǔ)“鳥苷酸環(huán)化酶受體”指位于任何細(xì)胞類型上的鳥苷酸環(huán)化酶受體，在此所述的發(fā)明的激動(dòng)劑肽或天然激動(dòng)劑與這些受體結(jié)合。

這里使用的術(shù)語(yǔ)“鳥苷酸環(huán)化酶受體－激動(dòng)劑”指與鳥苷酸環(huán)化酶受體結(jié)合并促進(jìn)cgmp產(chǎn)生的肽和/或其他化合物。該術(shù)語(yǔ)還包括所有這樣的肽，它們具有與包含seqidno：1的3-15號(hào)氨基酸殘基結(jié)合結(jié)構(gòu)域的至少一部分基本上相同的序列。該術(shù)語(yǔ)還涵蓋了與鳥苷酸環(huán)化酶受體結(jié)合并促進(jìn)cgmp產(chǎn)生的片段和前肽。術(shù)語(yǔ)“基本上相同”指具有與結(jié)合結(jié)構(gòu)域相同氨基酸序列的肽，序列中某些殘基可以被刪除，或被其他氨基酸替代而不影響該肽結(jié)合鳥苷酸環(huán)化酶受體并促進(jìn)cgmp產(chǎn)生的能力。

新型鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑的策略和設(shè)計(jì)

尿鳥苷蛋白由杯狀突和其他排列為胃腸粘膜的上皮細(xì)胞以功能上無(wú)活性的尿鳥苷蛋白原的形式分泌。人類的肽原隨后在腸腔內(nèi)通過(guò)內(nèi)源蛋白酶的作用被轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苌嫌谢钚缘?，由seqidno：1所表示的16氨基酸肽(人尿鳥苷蛋白序列，參見表2)。因?yàn)槟蝤B苷蛋白是一種耐熱、耐酸和耐蛋白酶水解的肽，在治療方法中可以有效地采用這種肽和/或其他與seqidno：1的序列相似的功能上有活性的16氨基酸肽的口服或全身性給藥。

下面討論與尿鳥苷蛋白相似但不同的肽，包括一些具有優(yōu)異的cgmp增強(qiáng)性質(zhì)，和/或其他與以前知道的尿鳥苷蛋白肽相比有利的性質(zhì)。這些肽可以用于抑制胃腸炎癥，以及治療或預(yù)防與消化道炎癥有關(guān)的息肉形成。也可以治療易于形成癌細(xì)胞的上皮組織。這里描述的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑具有表2和3中所示的氨基酸序列。激動(dòng)劑－受體相互作用的“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”包含seqidno：1的3-15號(hào)氨基酸殘基。

應(yīng)用分子模擬設(shè)計(jì)新型的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑，具體方法見(30)。分子模擬設(shè)計(jì)包括對(duì)三個(gè)已知與鳥苷酸環(huán)化酶受體相互作用的化合物的能量計(jì)算，這三個(gè)化合物為人尿鳥苷蛋白，雙環(huán)[4,12；7,15]

asn¹-asp²-asp³-cys⁴-glu⁵-leu⁶-cys⁷-val⁸-asn⁹-val¹⁰-ala¹¹-cys¹²-thr¹³-gly¹⁴-cys¹⁵-leu¹⁶(ug，seqidno：1)、人鳥苷蛋白，雙環(huán)[4,12；7,15]

pro¹-gly²-thr³-cys⁴-glu⁵-ile⁶-cys⁷-ala⁸-tyr⁹-ala¹⁰-ala¹¹-cys¹²-thr¹³-gly¹⁴-cys¹⁵(gu，seqidno：22)、和大腸桿菌小的熱穩(wěn)定腸毒素，三環(huán)[6,10；7,15；11-18]asn¹-ser²-ser³-asn⁴-tyr⁵-cys⁶-cys⁷-glu⁸-leu⁹-cys¹⁰-cys¹¹-asn¹²-pro¹³-ala¹⁴-cys¹⁵-thr¹⁶-gly¹⁷-cys¹⁸-thr¹⁹-(st，seqidno：23)。對(duì)這三個(gè)化合物所有可能的低能量構(gòu)象進(jìn)行幾何比較，以揭示出作為生物活性構(gòu)象(即在與受體相互作用的過(guò)程中g(shù)u,ug和st所采用的構(gòu)象)“模板”的共有的3-d結(jié)構(gòu)。分子模型設(shè)計(jì)允許在以其他低能量構(gòu)象為代價(jià)的情況下，通過(guò)選擇對(duì)于多種氨基酸殘基的單獨(dú)替代，設(shè)計(jì)具有生物活性構(gòu)象顯著增加的構(gòu)象群體的新型類似物。

利用堆積(build-up)步驟進(jìn)行能量計(jì)算(30)。用平面順式肽鍵(包括st中的pro¹³的平面順式肽鍵)用剛性化合價(jià)幾何結(jié)構(gòu)，使用ecepp/2勢(shì)場(chǎng)(31,32)。pro¹³的ω角允許變動(dòng)。脂肪族和芳香族的氫一般被包括在chn類型的聯(lián)合原子中心中；對(duì)α氫原子和酰胺的氫進(jìn)行明確的描述。

主要的計(jì)算方案涉及許多相連續(xù)的步驟。首先要考慮兩個(gè)單環(huán)的模型片段(對(duì)于st是三個(gè)片段)，ac-環(huán)(cysⁱ-...-cys^j)-nme的序列，其中除了cys、gly和pro以外的所有殘基都由丙氨酸替代；i和j的值與gu、ug和st的序列對(duì)應(yīng)。在這一步，要考慮每一個(gè)氨基酸殘基對(duì)肽骨架的局部最小量的所有可能組合，即對(duì)ala殘基，e,f,c,d,a和a*類型[按照(33)中的符號(hào)系統(tǒng)]的ramachandran圖中的最小量；對(duì)gly殘基，e*,f*,c*,d*,a,e,f,c,d,和a*類型的ramachandran圖中的最小量；對(duì)pro殘基，f,c和a類型的ramachandran圖中的最小量。對(duì)于每一個(gè)骨架構(gòu)象，通過(guò)檢查d-cys殘基沿二面角χ1旋轉(zhuǎn)的能量性質(zhì)，找到使用ecepp力場(chǎng)內(nèi)在的拋物線勢(shì)能函數(shù)關(guān)閉環(huán)的最適可能性。

總計(jì)，對(duì)每一個(gè)環(huán)部分，至少考慮大約180,000個(gè)構(gòu)象。然后，滿足e－emin<δe＝15kcal/mol標(biāo)準(zhǔn)，且在任意骨架二面角的至少一個(gè)值上有40°以上差異的構(gòu)象(對(duì)不同的模型片段，從約3000到8000個(gè)構(gòu)象中)被挑選出來(lái)。在下一步，將相配的單環(huán)片段中所選出來(lái)的構(gòu)象進(jìn)行疊加，以產(chǎn)生雙環(huán)模型片段的可能構(gòu)象(對(duì)于st是三環(huán)片段)。這一步一般得到20,000到30,000個(gè)構(gòu)象。所有這些構(gòu)象進(jìn)入新一輪能量計(jì)算的循環(huán)，產(chǎn)生出對(duì)于st模型片段滿足e－emin<δe＝20kcal/mol標(biāo)準(zhǔn)的191個(gè)構(gòu)象和對(duì)于gu/ug模型片段滿足同樣條件的6,965個(gè)構(gòu)象。此后，恢復(fù)在模型片段中漏掉的側(cè)鏈，再次進(jìn)行能量計(jì)算，在能量最小化之前，利用前述算法(34)，對(duì)側(cè)鏈基團(tuán)的二面角值(除了cys殘基的χ1角以外)和骨架末端基團(tuán)的二面角值進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到這些基團(tuán)最適宜的空間排列。對(duì)于ug4-15片段，632個(gè)構(gòu)象滿足δe＝20kcal/mol的標(biāo)準(zhǔn)；其中164個(gè)滿足更為嚴(yán)格的δe＝12kcal/mol的標(biāo)準(zhǔn)，這符合已接受的1kcal/mol/殘基的標(biāo)準(zhǔn)(30)。接下來(lái)由ug4-15片段向3-16片段的延長(zhǎng)，以及延長(zhǎng)為整個(gè)ug分子，以同樣的堆積步驟進(jìn)行。最終找到滿足δe＝16kcal/mol標(biāo)準(zhǔn)的31個(gè)ug的骨架構(gòu)象。

用以下方法對(duì)每一個(gè)構(gòu)象進(jìn)行幾何比較。根據(jù)(35)，確定一個(gè)構(gòu)象對(duì)中原子中心重疊的最適度，以檢查兩個(gè)構(gòu)象之間幾何相似性的水平。幾何相似性的標(biāo)準(zhǔn)是rms值，對(duì)于一對(duì)構(gòu)象a和b，rms值計(jì)算如下：

rms＝(1/n)σⁿi＝1[(x^ai–x^bi)²+(y^ai–y^bi)²+(z^ai–z^bi)²]^1/2

其中n是選擇用于重疊的α碳原子對(duì)的數(shù)目，x、y和z是笛卡爾坐標(biāo)。根據(jù)的幾何相似性標(biāo)準(zhǔn)，剛性構(gòu)象片段ug4-15的低能量構(gòu)象歸入七個(gè)構(gòu)象家族。其中的一個(gè)家族由與1uya和1etn都相似的相同的六個(gè)構(gòu)象組成；該家族還包含ug的最低能量構(gòu)象。(1uya和1etn由實(shí)驗(yàn)限定為ug和st分別的3d結(jié)構(gòu)，已知它們具有高生物活性(36,37)；從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中可以獲得3d結(jié)構(gòu)。)

表1在ug的“模板”構(gòu)象中，肽骨架的二面角(用度表示)值

確定這個(gè)ug片段總體3d形狀的二面角φ和ψ的值是相似的(表1)。它允許進(jìn)行新型類似物的初級(jí)設(shè)計(jì)，其目的是利用已知的由于多種類型氨基酸施加的局部構(gòu)象限制，穩(wěn)定這個(gè)特殊的構(gòu)象家族。

例如，已知gly與其他l－氨基酸殘基相比，由于可以采用φ和ψ的四種符號(hào)組合中的任意一種，即－,+；－,－；+,+；和+,－，因此在構(gòu)象上更靈活。最后一種組合對(duì)于l－氨基酸如ala來(lái)說(shuō)，是空間上禁止的。因此，用ala¹⁴替代gly¹⁴會(huì)限制14位的構(gòu)象靈活性，保持表1所描述構(gòu)象。但是，用aib(α-me-ala，雙α甲基丙氨酸)替代，只會(huì)在兩個(gè)區(qū)域，即－,－和+,+，限制局部構(gòu)象的靈活性，第一個(gè)區(qū)域(－,－)與表1中ala¹¹的構(gòu)象相容。因此，另一個(gè)合意的替代是aib¹¹。在pro中，φ的值固定在－75°；該殘基與纈氨酸具有相似的疏水性質(zhì)。因此，val¹⁰可以用pro¹⁰替代，向表1中的ug構(gòu)象加入了更多的局部構(gòu)象限制。被pro替代還要求它的前一個(gè)殘基只具有正ψ值；表1中的asn⁹滿足這個(gè)要求。pro殘基已經(jīng)存在于st的相應(yīng)位置處。下面表示的seqidno：1內(nèi)所有建議的替代(如pro¹⁰,aib¹¹或ala¹⁴)并不改變非脂肪族氨基酸(如asn,asp或thr)的化學(xué)性質(zhì)，這些性質(zhì)在與受體的實(shí)際相互作用中非常重要。前述的替代應(yīng)該只導(dǎo)致使ug的構(gòu)象平衡向所建議的“模板”3-d結(jié)構(gòu)方向移動(dòng)的構(gòu)象限制。

根據(jù)表1中限定的3d結(jié)構(gòu)，對(duì)尿鳥苷蛋白定義了一個(gè)三維的藥效團(tuán)，使得可能確定被認(rèn)為直接與受體相互作用的尿鳥苷蛋白官能團(tuán)之間的距離。那些被認(rèn)為與受體直接相互作用的官能團(tuán)是位于骨架序列3,5,9和13位的殘基側(cè)鏈基團(tuán)。這些殘基優(yōu)選是glu3,glu5,asn9和thr13，如seqidno：2和seqidno：20所示。因此，描述出尿鳥苷蛋白的三維藥效團(tuán)，其中在3,5,9和13位殘基的四條側(cè)鏈的空間排列可以產(chǎn)生為使得這些側(cè)鏈之間的距離使可選的生物活性成為可能。那些距離(用相應(yīng)殘基的β碳原子之間的距離來(lái)量度)如下：對(duì)于3-5的距離從5.7到對(duì)于3-9的距離從4.0到對(duì)于3-13的距離從7.7到對(duì)于5-9的距離從9.4到對(duì)于5-13的距離從9.4到且對(duì)于9-13的距離從5.8到

以上距離只取決于蛋白骨架的構(gòu)象。但在某些情況中，側(cè)鏈自身的構(gòu)象也同樣重要。例如，計(jì)算顯示出在低能量構(gòu)象方面，ug(sp301)，[glu²]-ug(sp303)，[glu³]-ug(sp304)，和[glu²，glu3]-ug(sp302)的骨架之間沒有構(gòu)象差異。但是，在第三位asp的β羧基和glu的γ羧基之間，在空間位置上有顯著的差異。即第三位glu殘基的γ羧基明顯比相應(yīng)asp殘基的β羧基向分子堆積“以外”伸出得更遠(yuǎn)。以上的觀察強(qiáng)烈暗示第三位上帶有負(fù)電的羧基基團(tuán)與受體上帶有正電的結(jié)合位點(diǎn)之間有特異的相互作用；因此，含有g(shù)lu3而不是asp3的類似物活性應(yīng)該更高。同時(shí)，為了保證這種特殊相互作用的有效性，配基和受體之間的遠(yuǎn)程靜電相互作用的整體系統(tǒng)必須保持十分平衡。因?yàn)榕casp²側(cè)鏈相比，glu²側(cè)鏈呈現(xiàn)出更多的構(gòu)象可能性，所以與sp304(asp3單替換為glu3)相比，這一平衡在sp302(兩個(gè)asp被替換為glu)中可能有微小的改變。

能夠采用表1中所述低能量構(gòu)象的化合物列在表2中。所有的化合物都是[4，12；7，15]雙環(huán)。

表2

1.母體化合物：尿鳥苷蛋白

seqidno：1

asn¹-asp²-asp³-cys⁴-glu⁵-leu⁶-cys⁷-val⁸-asn⁹-val¹⁰-ala¹¹-cys¹²-thr¹³-gly¹⁴-cys¹⁵-leu¹⁶

2.沒有半胱氨酸修飾的化合物：

共有序列(seqidno：2)：

asn¹-aaa²-bbb³-cys⁴-glu⁵-leu⁶-cys⁷-yal⁸-asn⁹-xxx¹⁰-yyy¹¹-cys¹²-thr¹³-zzz¹⁴-cys¹⁵-leu¹⁶

其中aaa＝asp，glu；bbb＝asp，glu

例外：同一分子中，aaa和bbb不同時(shí)都是asp

且其中xxx＝val，pro；yyy＝ala，aib；zzz＝gly，ala

3.第七位的半胱氨酸被替代為巰基脯氨酸的化合物：

共有序列(seqidno：3)：

asn¹-aaa²-bbb³-cys⁴-glu⁵-leu⁶-mpt⁷-val⁸-asn⁹-xxx¹⁰-yyy¹¹-cys¹²-thr¹³-zzz¹⁴-cys¹⁵-leu¹⁶

其中aaa＝asp，glu；bbb＝asp，glu

其中xxx＝val，pro；yyy＝ala，aib；zzz＝gly，ala

4.半胱氨酸被替代為青霉胺(β，β-二甲基半胱氨酸，pen)的化合物：

共有序列(seqidno：4)：

asn¹-aaa²-bbb³-kkk⁴-glu⁵-leu⁶-lll⁷-val⁸-asn⁹-xxx¹⁰-yyy¹¹-mmm¹²-thr¹³-zzz¹⁴-nnn¹⁵-leu¹⁶

其中aaa＝asp，glu；bbb＝asp，glu

其中xxx＝val，pro；yyy＝ala，aib；zzz＝gly，ala

且kkk，l11，mmm和nnn是cys，或pen(例外：同一分子中，所有的這些殘基不能都是cys)

5.二硫鍵被內(nèi)酰胺鍵替代的化合物：

共有序列(seqidno：5)：

asn¹-aaa²-bbb³-kkk⁴-glu⁵-leu⁶-lll⁷-val⁸-asn⁹-xxx¹⁰-yyy¹¹-mmm¹²-thr¹³-zzz¹⁴-nnn¹⁵-leu¹⁶

其中aaa＝asp，glu；bbb＝asp，glu

其中xxx＝val，pro；yyy＝ala，aib；zzz＝gly，ala

以及所有下面的組合(dpr是二氨基丙酸)：

kkk是dpr，且mmm是asp或glu

kkk是asp或glu，且mmm是dpr

l11是cys或pen

nnn是cys或pen

或：

l11是dpr，且nnn是asp或glu

l11是asp或glu，且nnn是dpr

kkk是cys或pen

mmm是cys或pen

表2所示的一些肽含有16個(gè)氨基酸殘基，其中在cys⁴和cys¹²以及cys⁷和cys¹⁵半胱氨酸殘基之間分別形成二硫鍵。這些肽與wo01/25266中描述的肽不同，而且是根據(jù)肽構(gòu)象和能量計(jì)算設(shè)計(jì)的。

除此以外，表3所示的長(zhǎng)度在13到16個(gè)氨基酸變化的肽，根據(jù)能量計(jì)算和三維結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，以促進(jìn)生物活性構(gòu)象的穩(wěn)定性，并向消除生物學(xué)上無(wú)活性構(gòu)象的互變現(xiàn)象或使其最小化。這些肽的設(shè)計(jì)目的還在于增加對(duì)于蛋白酶水解和較高溫度的穩(wěn)定性。這些肽的設(shè)計(jì)包括了氨基酸的修飾，這些氨基酸含有在較低ph值時(shí)帶有離子電荷，如谷氨酸和天冬氨酸。

表3

x1到x9可以是任意氨基酸。在4和12以及7和15位的半胱氨酸殘基之間分別形成二硫鍵。seqidno：18代表了使這些肽與鳥苷酸環(huán)化酶受體結(jié)合時(shí)的最小長(zhǎng)度要求。

藥物組合物和制劑

本發(fā)明的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑(表2；seqidno：2-5和表3；seqidno：6-21)，以及尿鳥苷蛋白、鳥苷蛋白和/或細(xì)菌腸毒素st，可以聯(lián)合使用或與不同的賦形劑、載體或佐劑一起配制，用于口服、局部或全身的給藥。肽組合物可以以溶液、粉末、懸浮液、乳劑、片劑、膠囊、透皮膠布、藥膏或其他制劑形式給藥。制劑和劑型形式，可以使用本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的方法制得。(參見，例如，remington’spharmaceuticalsciences,16^th版,a.oslo編,easton,pa(1980))

依賴cgmp的磷酸二酯酶的抑制劑可以是小分子、肽、蛋白質(zhì)或其他特異阻止cgmp降解的化合物。抑制性化合物包括suldinac砜、苯氮嘌呤酮、motapizone和其他阻斷cgmp特異的磷酸二酯酶的酶活性的化合物。這些化合物中的一或多個(gè)可以與seqidno：2-21所示例的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑、尿鳥苷蛋白、鳥苷蛋白和大腸桿菌st肽聯(lián)合使用。

載體(如磷酸緩沖鹽溶液或pbs)以及其他可用于組合物組分的選擇，完全處于本領(lǐng)域技術(shù)水平以內(nèi)。除了含有一或幾種鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑以外，這種組合物還可以結(jié)合已知能幫助給藥和/或提高藥物吸收的藥學(xué)可接受的載體和其他成分。其他制劑，如微球體、納米顆粒、脂質(zhì)體、pegylated蛋白或肽，以及以免疫為基礎(chǔ)的系統(tǒng)也可以使用。實(shí)例包括使用聚合物(例如20％w/v聚乙二醇)或纖維素的制劑、或內(nèi)服制劑和pegylated肽類似物，以提高在全身的半壽期和穩(wěn)定性。

治療方法

術(shù)語(yǔ)“治療”指減少或減輕受治療者的癥狀，防止癥狀的惡化或發(fā)展，或防止疾病的發(fā)展。對(duì)于給定的受治療者，癥狀的改善、惡化、恢復(fù)或發(fā)展可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通常采用的主或客觀測(cè)量方法來(lái)確定。對(duì)于治療癌癥的功效可以用發(fā)病率或死亡率的改善(例如對(duì)所選群體的存活曲線的延長(zhǎng))來(lái)量度。因此，有效的治療應(yīng)該包括對(duì)已有疾病的治療、通過(guò)減緩疾病的發(fā)展或使其停止來(lái)控制疾病、預(yù)防疾病的出現(xiàn)、降低癥狀數(shù)量或嚴(yán)重程度或其組合。使用一或多個(gè)統(tǒng)計(jì)上顯著的標(biāo)準(zhǔn)，治療效果可以在有對(duì)照的研究中表現(xiàn)出來(lái)。

具有一項(xiàng)或多項(xiàng)內(nèi)科/外科的程序和/或至少一種其他化療藥劑的聯(lián)合療法可以與本發(fā)明一起實(shí)施。其他在組合療法中有用的合適藥劑包括抗炎藥物如類固醇，或非類固醇抗炎癥藥物(nsaids)如阿司匹林或類似物。防治或降低復(fù)發(fā)率的預(yù)防方法也被認(rèn)為是治療。

預(yù)期對(duì)于組合物有反應(yīng)的癌癥包括乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、食道癌和睪丸癌。更多的涉及癌變組織或者早期癌變組織、應(yīng)當(dāng)對(duì)至少含有一種鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑的治療產(chǎn)生反應(yīng)的疾病包括：腫瘤(例如基底細(xì)胞、嗜堿性鱗狀細(xì)胞(basosquamous)、brown-pearce、管道(ductal)、艾利希氏腫瘤、原位、克雷布斯、梅克爾細(xì)胞、小型或非小型細(xì)胞肺、燕麥細(xì)胞、乳頭狀的、細(xì)支氣管、鱗狀細(xì)胞、移行細(xì)胞、沃克)、白血病(例如b細(xì)胞、t細(xì)胞、htlv、急性或慢性淋巴細(xì)胞的、肥大細(xì)胞、骨髓的)、組織細(xì)胞瘤、多發(fā)性組織細(xì)胞瘤、何杰金氏疾病、非何杰金氏淋巴瘤、漿細(xì)胞瘤、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖、腺瘤、腺癌、腺纖維瘤、腺淋巴瘤、造釉細(xì)胞瘤、血管角皮瘤、具嗜曙紅性細(xì)胞增多的淋巴增生、硬化性血管瘤、多發(fā)性血管瘤、胺前體攝取脫羧細(xì)胞瘤、鰓瘤、惡性生長(zhǎng)類癌綜合征、類癌心臟疾病、乳腺癌肉瘤、牙骨質(zhì)瘤、膽管瘤、膽脂瘤、軟骨肉瘤、成軟骨細(xì)胞瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、迷芽瘤、顱咽管瘤、軟骨瘤、圓柱瘤、囊腺癌、囊腺瘤、葉狀囊肉瘤、無(wú)性細(xì)胞瘤、室管膜細(xì)胞瘤、尤文氏肉瘤、纖維瘤、纖維肉瘤、巨大細(xì)胞腫瘤、節(jié)狀神經(jīng)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、血管球瘤、顆粒性細(xì)胞腫瘤、成雌雄嵌合細(xì)胞瘤、錯(cuò)構(gòu)瘤、血管內(nèi)皮瘤、血管瘤、血管外皮肉瘤、血管肉瘤、肝細(xì)胞瘤、島細(xì)胞腫瘤、卡波西肉瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、白細(xì)胞肉瘤、萊迪希氏細(xì)胞腫瘤、脂瘤、脂肪肉瘤、淋巴管瘤、淋巴管肌瘤、淋巴管肉瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、腦膜瘤、間充質(zhì)細(xì)胞瘤、中腎瘤、間皮細(xì)胞瘤、成肌細(xì)胞瘤、肌瘤、肌肉瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、神經(jīng)鞘瘤、神經(jīng)瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)上皮細(xì)胞瘤、神經(jīng)纖維瘤、多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤、牙瘤、骨瘤、骨肉瘤、乳頭狀瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤、非嗜鉻性副神經(jīng)節(jié)瘤、松果體瘤、橫紋肌瘤、橫紋肌肉瘤、足細(xì)胞肉瘤、畸胎瘤、卵泡膜細(xì)胞腫瘤，以及其他細(xì)胞變得發(fā)育異常、永生化或轉(zhuǎn)化的疾病。

發(fā)明的組合物的大丸(片)劑可以在短時(shí)間內(nèi)給藥。一天一次是很方便的給藥計(jì)劃，特別是治療以上提到的疾病時(shí)。另一種方法是，為給藥目的，有效的日劑量可以分為多重劑量，例如每天2至12劑量。選擇使用的劑量水平取決于化合物的生物有效性、活性和穩(wěn)定性，給藥途徑，被治療疾病的嚴(yán)重程度，以及需要接受治療的受治療者的情況。預(yù)期日劑量一般在約10微克到約2毫克(例如約100微克到1毫克)化合物每千克體重。施用的組合物的量取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的因素，例如組合物的化學(xué)性質(zhì)、給藥途徑、癌癥的位置和類型及其他類似因素。接受治療的哺乳動(dòng)物可以是任何動(dòng)物或人類患者。因此，根據(jù)本發(fā)明包括既有獸醫(yī)的又有醫(yī)療的治療。

本發(fā)明將在下面的非限制性實(shí)施例中作進(jìn)一步描述。

實(shí)施例

材料與方法

細(xì)胞培養(yǎng)：人t84結(jié)腸腫瘤細(xì)胞從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏所(atcc)獲得,在通道52。細(xì)胞生長(zhǎng)在ham'sf-12培養(yǎng)基和dulbecco's改良eagle's培養(yǎng)基(dmem)的1:1混合物中，混合物添加了10％胎牛血清、100單位每毫升的青霉素、100微克每毫升的鏈霉素。每隔兩天更換新鮮培養(yǎng)基，在鋪滿率大約為80％時(shí)分瓶。

基于t84細(xì)胞的確定胞內(nèi)cgmp水平的測(cè)定法：肽類似物由multiplepeptidesystems,sandiego,ca和princetonbiomoleculeslanghorne,pa定制合成。合成肽的生物活性根據(jù)以前的報(bào)道(15)測(cè)定。簡(jiǎn)要步驟如下，24孔培養(yǎng)板中鋪滿的單層t-84細(xì)胞用250微升含50mmhepes(ph7.4)的dmem洗兩次，在37℃用250微升含50mmhepes(ph7.4)和1mm異丁基甲基黃嘌呤(ibmx)的dmem預(yù)溫浴10分鐘，接下來(lái)用肽類似物(0.1nm到10μm)溫浴30分鐘。將培養(yǎng)基重懸，用3％的高氯酸終止反應(yīng)。離心后用0.1n氫氧化鈉中和，上清直接用elisa試劑盒(caymenchemical,annarbor,mi)測(cè)定cgmp含量。

結(jié)果

表4所示的肽定制合成，并用已發(fā)表的步驟(38)純化(大于95％的純度)。在基于t84細(xì)胞的測(cè)定中，對(duì)肽類似物提高細(xì)胞內(nèi)cgmp水平的能力進(jìn)行測(cè)定。如表4所示，在所有被檢測(cè)的類似物中，sp304(seqidno：20)使胞內(nèi)cgmp的含量增加得最多。sp316(seqidno：21)的有效性排在第二，而sp301、sp302和sp303的生物活性全部較弱。在該測(cè)定中，肽類似物sp306和sp310沒有活性。這些結(jié)果表明sp304是增加cgmp最有效的肽。這些結(jié)果還提示在第7位的甲硫氨酸參與[7,15]二硫鍵的形成，不能被青霉胺替換，且第9位的天冬酰胺殘基不能替換為谷氨酰胺。

表4:在t84細(xì)胞生物測(cè)定中評(píng)價(jià)肽激動(dòng)劑的生物活性。

*sp301、sp304和sp316的序列的標(biāo)識(shí)所表示的序列就是與文中給出的這些類似物的氨基酸序列。

**在用1μm相應(yīng)的肽激動(dòng)劑處理30分鐘后，觀察到的t84細(xì)胞的胞內(nèi)cgmp水平。sp304的數(shù)值在統(tǒng)計(jì)上顯著，其p大于0.5。

為了檢查熱穩(wěn)定性，10μm的肽類似物溶液在95℃加熱達(dá)90分鐘。在處理過(guò)程中的特定時(shí)刻，用t84細(xì)胞測(cè)定法檢測(cè)樣品的生物活性。加熱60分鐘后，sp301、sp302、sp303和sp304的生物活性沒有明顯改變。90分鐘后，sp301、sp302和sp303的生物活性降低至他們?cè)谢钚缘?0％，而sp304的生物活性保持不變。這表明，與其他被檢測(cè)的肽相比，sp304對(duì)于熱變性更為穩(wěn)定。根據(jù)能量計(jì)算和3d結(jié)構(gòu)，我們預(yù)期seqidno：1第三位帶負(fù)電的側(cè)鏈羧基基團(tuán)，與受體上帶有正電的結(jié)合位點(diǎn)特異地相互作用。在這種相互作用可以被增強(qiáng)的情況中，含有g(shù)lu3而非asp3的類似物的活性應(yīng)更高，這正是sp304的情況。同時(shí)，為了保證這種特殊相互作用的有效作用，配基和受體之間的遠(yuǎn)程靜電相互作用的整體系統(tǒng)必須保持良好的平衡。因?yàn)榕casp²側(cè)鏈相比，glu²側(cè)鏈呈現(xiàn)出更多的構(gòu)象可能性，所以與sp304(asp³單替換為glu³)相比，這一平衡在sp302(兩個(gè)asp被替換為glu)中可能有微小的改變。的確，在測(cè)定的類似物中，sp304的生物活性最好。

用t84細(xì)胞測(cè)定法，還檢測(cè)了合成的肽sp301、sp302、sp303和sp304在不同ph值時(shí)的活性。盡管所有這些肽在ph值5和7之間時(shí)都使胞內(nèi)cgmp產(chǎn)量增加，但是sp304在ph6.5和7之間使cgmp的增加最大。應(yīng)重點(diǎn)引起注意的是大腸的生理ph也處于相似的范圍內(nèi)，因此預(yù)期sp304對(duì)于結(jié)腸癌的治療應(yīng)非常有效。

我們還評(píng)價(jià)了單獨(dú)使用肽或者與依賴cgmp的磷酸二酯酶的抑制劑(如苯氮嘌呤酮或sulindac砜)聯(lián)合使用在t84細(xì)胞測(cè)定法中提高胞內(nèi)cgmp水平的量。在這些實(shí)驗(yàn)中，sp304與依賴cgmp的磷酸二酯酶抑制劑聯(lián)合使用，對(duì)于cgmp水平的增加具有強(qiáng)烈的效果。與只有苯氮嘌呤酮或sulindac砜單獨(dú)存在時(shí)cgmp的水平相比，合成肽sp304顯著提高了cgmp水平。sp304與苯氮嘌呤酮或sulindac砜聯(lián)合使用處理細(xì)胞，會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)cgmp的協(xié)同性增加。這些增加在統(tǒng)計(jì)上顯著，p值小于0.5。這些數(shù)據(jù)表明鳥苷酸環(huán)化酶受體的肽激動(dòng)劑和一或多種依賴cgmp的磷酸二酯酶抑制劑聯(lián)合使用，會(huì)得到比加和性增加值更高的cgmp的濃度。

盡管對(duì)于本發(fā)明已經(jīng)進(jìn)行了詳細(xì)描述，并且提供了關(guān)于本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但是對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)那些具有一般技術(shù)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的本質(zhì)精神和范圍的前提下，顯然可以作多方面的改動(dòng)和調(diào)整。

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序列表

<110>synergypharmaceuticals

<120>用于治療組織炎癥和癌變的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑

<130>81361/141030

<140>

<141>

<160>23

<170>patentinver.2.1

<210>1

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<213>人

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<213>人工序列

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<223>人工序列的描述：合成的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑肽

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<222>(1)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(5)..(6)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(8)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(10)..(11)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(13)..(14)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(16)

<223>任何氨基酸

<400>12

xaagluaspcysxaaxaacysxaatyrxaaxaacysxaaxaacysxaa

151015

<210>13

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑肽

<220>

<221>disulfid

<222>(4)..(12)

<220>

<221>disulfid

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<220>

<221>mod_res

<222>(1)

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<220>

<221>mod_res

<222>(5)..(6)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(8)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(10)..(11)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(13)..(14)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(16)

<223>任何氨基酸

<400>13

xaaaspaspcysxaaxaacysxaaglnxaaxaacysxaaxaacysxaa

151015

<210>14

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑肽

<220>

<221>disulfid

<222>(4)..(12)

<220>

<221>disulfid

<222>(7)..(15)

<220>

<221>mod_res

<222>(1)

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<220>

<221>mod_res

<222>(5)..(6)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(8)

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<220>

<221>mod_res

<222>(10)..(11)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(13)..(14)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(16)

<223>任何氨基酸

<400>14

xaagluglucysxaaxaacysxaaglnxaaxaacysxaaxaacysxaa

151015

<210>15

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑肽

<220>

<221>disulfid

<222>(4)..(12)

<220>

<221>disulfid

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<220>

<221>mod_res

<222>(1)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(5)..(6)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(8)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(10)..(11)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

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<220>

<221>mod_res

<222>(16)

<223>任何氨基酸

<400>15

xaaaspglucysxaaxaacysxaaglnxaaxaacysxaaxaacysxaa

151015

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<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑肽

<220>

<221>disulfid

<222>(4)..(12)

<220>

<221>disulfid

<222>(7)..(15)

<220>

<221>mod_res

<222>(1)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(5)..(6)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(8)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(10)..(11)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(13)..(14)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(16)

<223>任何氨基酸

<400>16

xaagluaspcysxaaxaacysxaaglnxaaxaacysxaaxaacysxaa

151015

<210>17

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑肽

<220>

<221>disulfid

<222>(2)..(10)

<220>

<221>disulfid

<222>(5)..(13)

<220>

<221>mod_res

<222>(3)..(4)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(6)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(8)..(9)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(12)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(14)

<223>任何氨基酸

<400>17

glucysxaaxaacysxaaasnxaaxaacysxaaxaacysxaa

1510

<210>18

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑肽

<220>

<221>disulfid

<222>(2)..(10)

<220>

<221>disulfid

<222>(5)..(13)

<220>

<221>mod_res

<222>(3)..(4)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(6)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(8)..(9)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(11)..(12)

<223>任何氨基酸

<400>18

glucysxaaxaacysxaaasnxaaxaacysxaaxaacys

1510

<210>19

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑肽

<220>

<221>disulfid

<222>(3)..(11)

<220>

<221>disulfid

<222>(6)..(14)

<220>

<221>mod_res

<222>(1)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(4)..(5)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(7)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(9)..(10)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(12)..(13)

<223>任何氨基酸

<220>

<221>mod_res

<222>(15)

<223>任何氨基酸

<400>19

xaaglucysxaaxaacysxaaasnxaaxaacysxaaxaacysxaa

151015

<210>20

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑肽

<220>

<221>disulfid

<222>(4)..(12)

<220>

<221>disulfid

<222>(7)..(15)

<400>20

asnaspglucysgluleucysvalasnvalalacysthrglycysleu

151015

<210>21

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動(dòng)劑肽

<220>

<221>disulfid

<222>(2)..(10)

<220>

<221>disulfid

<222>(5)..(13)

<400>21

glucysgluleucysvalasnvalalacysthrglycysleu

1510

<210>22

<211>15

<212>prt

<213>人

<220>

<221>disulfid

<222>(4)..(12)

<220>

<221>disulfid

<222>(7)..(15)

<400>22

proglythrcysgluilecysalatyralaalacysthrglycys

151015

<210>23

<211>19

<212>prt

<213>大腸桿菌

<220>

<221>disulfid

<222>(6)..(10)

<220>

<221>disulfid

<222>(7)..(15)

<220>

<221>disulfid

<222>(11)..(18)

<400>23

asnserserasntyrcyscysgluleucyscysasnproalacysthrglycystyr

151015