本發(fā)明涉及生物化學(xué)和蛋白質(zhì)工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，涉及一種能治療干眼綜合征的藥物及其組合物。
背景技術(shù)：
：干眼癥是指任何原因造成的淚液質(zhì)或量異常或動力學(xué)異常，導(dǎo)致淚膜穩(wěn)定性下降，并伴有眼部不適和(或)眼表組織病變特征的多種疾病的總稱。又稱角結(jié)膜干燥癥。常見癥狀包括眼部干澀、容易疲倦、眼癢、有異物感、灼熱痛感、分泌物黏稠、怕風(fēng)、畏光及對外界刺激敏感;有時因基本淚液不足，眼部過度干澀，反而刺激反射性淚液分泌，而造成經(jīng)常流淚;較嚴重者眼睛會出現(xiàn)紅腫、充血及角質(zhì)化，角膜上皮剝脫而有絲狀物粘附，這種損傷日久則可造成角結(jié)膜病變，并會影響視力。國際干眼工作組于2007年將干眼癥定義為:多種因素所致的一種淚液和眼表疾病，包括眼表不適癥狀，視力變化和淚膜不穩(wěn)定并且伴有潛在的眼表損害，伴隨淚液滲透壓升高和眼表炎癥反應(yīng)。干眼癥臨床表現(xiàn)為干澀、眼紅、易疲勞、燒灼感、異物感、畏光、視疲勞及疼痛，嚴重者可引起視力下降甚至失明。干眼癥的發(fā)病機制主要有炎癥、細胞凋亡、性激素水平失調(diào)等，其中炎癥是導(dǎo)致干眼癥發(fā)病的重要因素。干眼癥治療的終極目標(biāo)是保護患者的視功能，抑制眼表的炎性反應(yīng)，恢復(fù)眼表面的正常結(jié)構(gòu)及功能。目前的干眼癥治療方法有藥物治療和手術(shù)治療，主要以藥物治療為主。常用藥物有人工淚液或自體血清、抗炎藥物等，以滴眼液為主，如重組牛堿性成纖維細胞生長因子滴眼液，玻璃酸鈉滴眼液等。雖然臨床上使用藥物很多，但都不能達到滿意的治療效果。胸腺素β4（以下簡稱Tβ4）是人體內(nèi)天然存在的一種小肽類物質(zhì)，Tβ4在人脾臟、胸腺、肺和腹膜巨噬細胞中的含量最高，其次是腦、肝、腎臟、睪丸和心臟。天然的Tβ4含有43個氨基酸，分子量約5kD，等電點為5.1。近年來胸腺素beta4（Tβ4）為藥物研究的熱點。深入研究已經(jīng)證明：Tβ4是一種多功能分子，在促進創(chuàng)傷和角膜損傷愈合、心肌修復(fù)、促進組織再生、血管生成、抗細胞凋亡和抗炎癥等方面起到重要作用。CN100360174C中公開了胸腺素β4（Tβ4）在促進眼睛退化逆轉(zhuǎn)或抑制眼睛退化的藥物中的應(yīng)用。SosneG等人報道了胸腺素β4在小鼠干眼癥模型能降低干眼癥狀（ExpertOpiniononBiologicalTherapy,15:sup1,155-161），動物試驗劑量為0.1%。已有報道的胸腺素β4是采用化學(xué)合成方法合成的，其結(jié)構(gòu)與天然Tβ4一致，均含有43個氨基酸。其缺點在于化學(xué)合成純度低，含有結(jié)構(gòu)類似的有機雜質(zhì)及無機雜質(zhì)，會產(chǎn)生毒副作用。同時，化學(xué)合成的胸腺素β4臨床上使用劑量大，臨床效果一般。同時，化學(xué)合成的多肽產(chǎn)量低，工業(yè)化生產(chǎn)難度大，不能滿足臨床使用。本發(fā)明人采用基因工程的方法對天然胸腺素β4的N-末端加以定點修飾，易于規(guī)?；苽?，成本較低，對環(huán)境不造成污染，足以滿足臨床需求。同時，我們出乎意料地發(fā)現(xiàn)，獲得的重組人胸腺素β4在治療干眼癥方面活性明顯高于天然胸腺素β4。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明中的重組人胸腺素β4是通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)的多肽類蛋白質(zhì)藥物，其結(jié)構(gòu)與天然結(jié)構(gòu)不同，含有44個氨基酸，其N-端序列和天然氨基酸N-端不同，將天然胸腺素β4的N-末端的乙?；コ?，并添加一個Gly或Ala，得到的天然胸腺素β4的突變體，增加了體內(nèi)生物活性。本發(fā)明所述的重組人胸腺素β4為序列1和序列2，即Gly-rhTβ4和Ala-rhTβ4。CN100582121C中公開了該衍生物及其氨基酸序列。本發(fā)明的一個目的在于，一種含有重組人胸腺素β4的藥物組合物在制備眼科疾病的藥物中的應(yīng)用，優(yōu)選地，是干眼癥方面的應(yīng)用，其特征在于所述的重組人胸腺素β4的濃度為1μg/mL-1000μg/mL。在一些實施方案中，所述的重組人胸腺素β4的濃度為1μg/mL-500μg/mL。在一些實施方案中，所述的重組人胸腺素β4的濃度為10μg/mL-100μg/mL。本發(fā)明的另一個目的在于，所述的藥物組合物含有藥學(xué)上可接受的載體。所述的藥物載體包括pH調(diào)節(jié)劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、促進吸收劑、無菌注射用水的一種或幾種。本發(fā)明中所述的pH調(diào)節(jié)劑包括鹽酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鈉的一種或幾種。本發(fā)明所述的滲透壓調(diào)節(jié)劑為用于調(diào)節(jié)滲透壓的試劑，包括但不限于氯化鈉、葡萄糖、山梨醇、甘油、PEG、丙二醇、甘露醇、硼酸、硼砂、硫酸鈉的一種或幾種。本發(fā)明所述的促進吸收劑包括但不限于亞砜類，吡咯烷酮類、脂肪酸及其酯、表面活性劑、丙二醇、甘油等的一種或幾種，優(yōu)選地為丙二醇，甘油，氮卓，環(huán)糊精，卵磷脂、豆磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺的一種或幾種。本發(fā)明的另一個目的在于，所述的藥物用于局部給藥。本發(fā)明的另一個目的在于，所述的藥物組合物的形式可以為滴眼液、凝膠、溶液、乳膏、軟膏、洗劑、凍干粉，優(yōu)選為滴眼液、凝膠。附圖說明圖1：rh-Tβ4對大鼠干眼癥模型治療后的眼前節(jié)照相結(jié)果圖2：rh-Tβ4對大鼠干眼癥模型治療后的角膜HE和PAS染色結(jié)果以下實施例用來說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明。實施例實施例一通過RT-PCR測定rhTβ4對MUC5AC、MUC1mRNA基因表達的影響藥物來源：本實驗中的天然β4是通過化學(xué)合成獲得，重組人胸腺素β4由北京諾思蘭德生物技術(shù)股份有限公司提供，分別為Gly-rhTβ4和Ala-rhTβ4，每種樣品各兩個規(guī)格（50,100μg/mL）。從眼庫取捐獻眼球分離結(jié)膜細胞，并進行結(jié)膜杯狀細胞體外培養(yǎng)及純化，培養(yǎng)過程中加入不同的胸腺素β4（Gly-rhTβ450μg/mL,Gly-rhTβ4100μg/mL，Ala-rhTβ450μg/mL,Ala-rhTβ4100μg/mL）,天然Tβ4即化學(xué)合成Tβ4（0.1%即1mg/mL，作為陽性對照），陰性對照組(negativecontrol)給予PBS。通過RT-PCR和Westernblot測定了胸腺素β4對黏蛋白表達相關(guān)基因MUC5AC、MUC1mRNA的影響。體外實驗結(jié)果表明：rh-T?4能促進人杯狀細胞的增殖，促進MUC5AC和MUC1mRNA的表達，并促進MUC1黏蛋白的表達。四組試驗組與陽性對照組相比，MUC5AC的表達均有顯著性差異，P<0.05，MUC1的表達也明顯高于陽性對照組。Gly-rhTβ4組和Ala-rhTβ4組MUC5AC、MUC1基因表達結(jié)果相似。檢測結(jié)果見表1。表1RT-PCR測定MUC5AC、MUC1基因的表達分組劑量MUC5AC（2^ΔΔCT）MUC1（2^ΔΔCT）NegativeControl--1±01±0陽性對照組Tβ41mg/mL0.62±0.301.32±0.27Gly-rhTβ450ug/mL1.61±0.77*1.52±0.31Gly-rhTβ4100ug/mL1.65±0.421.57±0.43Ala-rhTβ450ug/mL1.60±0.40*1.54±0.26Ala-rhTβ4100ug/mL1.69±0.25*1.63±0.24注：與陽性對照組相比,*P<0.05。實施例二rh-Tβ4對大鼠干眼癥模型角膜熒光素鈉評分結(jié)果用0.3%苯扎氯銨制備的大鼠干眼癥模型，干眼癥動物隨機分為6組，每組6只，分別給予rh-Tβ4（Gly-rhTβ450μg/mL,Gly-rhTβ4100μg/mL，Ala-rhTβ450μg/mL,Ala-rhTβ4100μg/mL）、天然Tβ4(0.1%即1mg/mL，陽性對照組）和PBS（陰性對照組），每日滴加3次，連續(xù)給藥7天。觀察rh-Tβ4對角膜熒光素鈉評分。結(jié)果顯示，rh-T?4及陽性對照組同陰性對照組比較，評分有下降趨勢，且Gly-rhTβ4100μg/mL劑量組和Ala-rhTβ4100μg/mL劑量組同陰性對照組比較差異顯著（p<0.05）。Ala-rhTβ4100μg/mL劑量組、Gly-rhTβ450μg/mL劑量組和Gly-rhTβ4100μg/mL劑量組同陽性對照組比較，結(jié)果有顯著差異。結(jié)果見表2。表2角膜熒光素鈉評分注：與陰性對照組相比,*P<0.05。實施例三rh-Tβ4對大鼠干眼癥模型治療后裂隙燈眼前節(jié)照相、熒光素鈉染色評分結(jié)果用0.3%苯扎氯銨制備的大鼠干眼癥模型，干眼癥動物隨機分為6組，每組6只，分別給予不同的rh-Tβ4（Gly-rhTβ450μg/mL,Gly-rhTβ4100μg/mL，Ala-rhTβ450μg/mL,Ala-rhTβ4100μg/mL）、天然Tβ4(0.1%即1mg/mL，陽性對照組）和PBS（陰性對照組），每日滴加3次，連續(xù)給藥7天。結(jié)果見圖1。熒光素鈉染色檢查結(jié)果可見，Gly-rhTβ4100μg/mL劑量組和Ala-rhTβ4100μg/mL劑量組角膜修復(fù)作用最明顯，與陽性對照藥有顯著差異，Gly-rhTβ450μg/mL劑量組與陽性對照組基本一致，而Ala-rhTβ450μg/mL和陰性對照組無明顯差異。實施例四病理檢查結(jié)果rh-Tβ4對大鼠干眼癥模型治療后的角膜HE和PAS染色結(jié)果即病理學(xué)檢查結(jié)果見圖2。正常組：HE染色的角膜和結(jié)膜上皮可見正常組織結(jié)構(gòu)，PAS染色中杯狀細胞可見；模型組：角膜和結(jié)膜上皮脫落；陰性對照組：上皮組織有一定程度的修復(fù)，可見少量杯狀細胞；陽性對照組：上皮組織修復(fù)較好，可見杯狀細胞；Ala-rhTβ450ug/mL組：上皮組織有一定程度的修復(fù)，但不明顯；Ala-rhTβ4100ug/mL組：上皮細胞修復(fù)較完善，杯狀細胞分布均勻；Gly-rhTβ450μg/mL組：上皮組織修復(fù)較好，可見杯狀細胞；Gly-rhTβ4100μg/mL組：上皮細胞修復(fù)較完善，杯狀細胞分布均勻；結(jié)論：Gly-rhTβ4100ug/mL組和Ala-rhTβ4100μg/mL組上皮組織修復(fù)較好，基本接近正常，且優(yōu)于陽性對照組。<110>北京諾思蘭德生物技術(shù)股份有限公司<120>一種用于治療眼部疾病的藥物及其組合物<160>2<210>1<211>44<212>PRT<213>人工序列<400>1GlySerAspLysProAspMetAlaGluIleGluLysPheAspLys151015SerLysLeuLysLysThrGluThrGlnGluLysAsnProLeuPro202530SerLysGluThrIleGluGlnGluLysGlnAlaGlyGluSer3540<210>2<211>44<212>PRT<213>人工序列<400>2AlaSerAspLysProAspMetAlaGluIleGluLysPheAspLys151015SerLysLeuLysLysThrGluThrGlnGluLysAsnProLeuPro202530SerLysGluThrIleGluGlnGluLysGlnAlaGlyGluSer3540當(dāng)前第1頁1 2 3