本發(fā)明屬于動(dòng)物疾病模型
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地，涉及一種改進(jìn)的SD大鼠克羅恩病造模方法，該方法可更好地用于初篩治療克羅恩病的藥物。
背景技術(shù)：
：克羅恩?。–rohn’sdisease,CD）是一種主要由免疫反應(yīng)失調(diào)引起的胃腸道慢性肉芽腫性炎癥性疾病。目前在我國(guó)，其發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，腸道的慢性炎癥及損傷可導(dǎo)致腸纖維化乃至腸梗阻等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生。目前，CD治療尙缺乏特異有效的藥物，因此，探討CD的發(fā)病機(jī)制，以尋求新型治療靶點(diǎn)的研究成為熱門方向。三硝基苯磺酸（TNBS）與乙醇合用進(jìn)行動(dòng)物克羅恩?。–rohn’sDisease,CD）造模是目前研究CD的常用模型。該模型的機(jī)制是乙醇破壞腸黏膜屏障，TNBS作為一種有機(jī)酸半抗原滲入結(jié)腸組織，與組織蛋白等高分子物質(zhì)結(jié)合，形成全抗原，使T淋巴細(xì)胞致敏，溶解與半抗原結(jié)合的動(dòng)物自身細(xì)胞，引起腸壁一系列免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，隨著組織的逐漸修復(fù)，可出現(xiàn)一系列腸壁的增生性改變。該法的優(yōu)點(diǎn)是炎癥癥狀與人類CD相似，而且可以維持較長(zhǎng)時(shí)間，方法簡(jiǎn)便，重復(fù)性也較好。但缺點(diǎn)是無(wú)急性期表現(xiàn)，動(dòng)物的死亡率較高。因此，如何在現(xiàn)有克羅恩病研究模型上加以改進(jìn)，提供更安全更有效的動(dòng)物疾病模型就顯得尤為重要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)中克羅恩病模型的缺陷和不足，提供一種改進(jìn)的SD大鼠克羅恩病造模方法，使該模型符合臨床人類疾病特征，且造模成功率高，動(dòng)物死亡率低；該改進(jìn)模型可用于研究克羅恩病的發(fā)病機(jī)制以及篩選該病的治療藥物。本發(fā)明的目的是提供一種改進(jìn)的SD大鼠克羅恩病造模方法。本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案給予實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明前期研究結(jié)果表明，影響造模成功率和動(dòng)物死亡率的因素主要是手術(shù)操作和造模藥TNBS劑量及造模溶液配比的選擇。因此，本發(fā)明通過(guò)對(duì)造模液配比的選擇來(lái)尋求更安全有效的動(dòng)物模型。一種改進(jìn)的SD大鼠克羅恩病造模方法，所述方法具體包括如下步驟：將SD大鼠禁食，麻醉后，將造模藥物灌腸，在導(dǎo)入造模藥物后采取頭低尾高的體位，防止灌注液體外溢，并倒提大鼠1～2min；所述造模藥物為5%的TNBS水溶液與無(wú)水乙醇按1:1體積比混合；所述造模藥物的劑量為50mg/kg。優(yōu)選地，所述SD大鼠的禁食時(shí)間為24小時(shí)。優(yōu)選地，所述麻醉為用8～10%水合氯醛按0.3ml/l00g腹腔注射。優(yōu)選地，所述灌腸為用灌胃針自肛門插入距肛門6～8cm處，灌入造模藥物。優(yōu)選地，在灌腸之前用PBS緩沖液清洗腸道。另外，上述造模方法在研究克羅恩病中的應(yīng)用亦在本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：（1）本發(fā)明所述模型符合臨床人類克羅恩病特征：腹瀉、血便、腸梗阻及體重減輕，結(jié)腸潰瘍并且腸管與腸管、腸管與臟器或組織之間發(fā)生粘連和膿腫；（2）本發(fā)明所述方法造模成功率高；（3）本發(fā)明所述造模方法動(dòng)物死亡率低；（4）本發(fā)明所述造模方法簡(jiǎn)便，重復(fù)性較好。附圖說(shuō)明圖1為實(shí)施例1建立的造模組與對(duì)照組大鼠體質(zhì)量變化圖。圖2為實(shí)施例1建立的造模組與對(duì)照組大鼠DAI評(píng)分。圖3為實(shí)施例1建立的對(duì)照組大鼠結(jié)腸組織病理圖。圖4為實(shí)施例1建立的造模組大鼠結(jié)腸組織病理圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合說(shuō)明書附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實(shí)施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。實(shí)施例1改進(jìn)的SD大鼠克羅恩病造模方法1.造模藥配制取一定體積5%TNBS水溶液與等體積無(wú)水乙醇混勻，置于4℃保存待用。2.造模方法（1）SD大鼠體重160g～220g，造模前禁食24h。（2）造模前稱重并記錄體重，腹腔內(nèi)注射0.3ml/l00g10%水合氯醛麻醉后，注入PBS清洗腸道。（3）將灌胃針自肛門插入距肛門8cm處，灌入造模藥物50mg/kg（5%TNBS與無(wú)水乙醇按1:1體積比混合，0.2ml/100g體質(zhì)量）。在導(dǎo)入造模藥液后采取頭低尾高的體位，防止灌注液體外溢，并倒提大鼠1～2min。對(duì)照組SD大鼠以同體積生理鹽水灌腸。（4）造模后大鼠平躺，自然清醒，常規(guī)飼養(yǎng)。（5）考察造模成功率，觀察指標(biāo)如下：一般情況觀察和記錄每天記錄大鼠進(jìn)食、毛色、活動(dòng)情況、稱量和記錄大鼠體質(zhì)量、記錄評(píng)價(jià)大便性狀：正常大便，成形大便；腹瀉，松散大便或是稀便，不粘附于肛門的糊狀、半成形大便或是可粘附于肛門的稀水樣便。肉眼觀察大便隱血情況。體重變化如圖1所示。按照Murthy等制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行DAI評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1，評(píng)分結(jié)果如圖2所示。結(jié)腸標(biāo)本大體觀察與評(píng)分取出距肛門10cm的結(jié)腸組織，沿腸系膜縱行切開，用冰生理鹽水沖洗，將黏膜向上展開，觀察豁膜損傷，并按照Walloce和Keenan1990年的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)腸黏膜的大體損傷評(píng)分，見表2。組織切片觀察與記錄觀察大鼠腸道粘膜改變（光鏡下，HE染色），與空白對(duì)照組比較，記錄組織學(xué)評(píng)分：將石蠟標(biāo)本經(jīng)4m連續(xù)切片后常規(guī)HE染色，觀察形態(tài)學(xué)改變。對(duì)照組和造模組組織病理切片圖如圖3、4所示。根據(jù)Cooper等的研究觀察組織學(xué)改變并評(píng)分，見表3，平均觀察3個(gè)100倍視野，取平均值。表1TNBS誘導(dǎo)大鼠IBD的DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)體重下降（%）糞便性狀便血評(píng)分0正常無(wú)便血01-5%稀便無(wú)便血15-10%稀便少量210-15%腹瀉少量3>15%腹瀉大量4DAI=（體重下降分?jǐn)?shù)+糞便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù)）/3正常糞便：成形的顆粒狀糞便稀便：不會(huì)粘在肛門上的糊狀便腹瀉：粘在肛門上的水樣便表2大體標(biāo)本形態(tài)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)大體標(biāo)本形態(tài)表現(xiàn)評(píng)分無(wú)炎癥和潰瘍0局部充血但無(wú)潰瘍1潰瘍但無(wú)充血21處潰瘍及炎癥32處或2處以上潰瘍及炎癥4潰瘍延伸超過(guò)2cm5表3組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)光鏡下表現(xiàn)評(píng)分正常結(jié)腸黏膜0為隱窩腺體丟失1/31為隱窩腺體丟失2/32為隱窩腺體全部丟失，黏膜上皮完整,伴有輕度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)3黏膜上皮糜爛、破壞，伴有明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)43.結(jié)果對(duì)照組SD大鼠精神佳，進(jìn)食飲水量正常，排黃色成形軟便。試驗(yàn)組SD大鼠灌腸24h后精神狀態(tài)一般，食欲下降，出現(xiàn)腹瀉、血便、腸梗阻及體重減輕，結(jié)腸潰瘍并且腸管與腸管、腸管與臟器或組織之間發(fā)生粘連和膿腫，與臨床人類克羅恩病特征接近，且生存率高。實(shí)施例2改進(jìn)的SD大鼠克羅恩病造模方法1.造模藥配制取一定體積1%TNBS水溶液與等體積無(wú)水乙醇混勻，置于4℃保存待用。2.造模方法（1）SD大鼠體重160g～220g，造模前禁食24h。（2）造模前稱重并記錄體重，腹腔內(nèi)注射0.3ml/l00g10%水合氯醛麻醉后，注入PBS清洗腸道。（3）將灌胃針自肛門插入距肛門8cm處，灌入造模藥物50mg/kg（1%TNBS與無(wú)水乙醇按1:1體積比混合，0.2ml/100g體質(zhì)量）。在導(dǎo)入造模藥液后采取頭低尾高的體位，防止灌注液體外溢，并倒提大鼠1～2min；對(duì)照組SD大鼠以同體積生理鹽水灌腸。（4）造模后大鼠平躺，自然清醒，常規(guī)飼養(yǎng)。（5）考察造模成功率，觀察指標(biāo)和實(shí)施例1一致。3.結(jié)果對(duì)照組SD大鼠精神佳，進(jìn)食飲水量正常，排黃色成形軟便。試驗(yàn)組SD大鼠灌腸24h后精神狀態(tài)一般，食欲下降，但腸道和粘膜形態(tài)及組織結(jié)構(gòu)均正常，未表現(xiàn)出克羅恩病癥狀。實(shí)施例3改進(jìn)的SD大鼠克羅恩病造模方法1.造模藥配制取一定體積10%TNBS水溶液與等體積無(wú)水乙醇混勻，置于4℃保存待用。2.造模方法（1）SD大鼠體重160g～220g，造模前禁食24h。（2）造模前稱重并記錄體重，腹腔內(nèi)注射0.3ml/l00g10%水合氯醛麻醉后，注入PBS清洗腸道。（3）將灌胃針自肛門插入距肛門8cm處，灌入造模藥物50mg/kg（5%TNBS與無(wú)水乙醇按1:1體積比混合，0.1ml/100g體質(zhì)量）。在導(dǎo)入造模藥液后采取頭低尾高的體位，防止灌注液體外溢，并倒提大鼠1～2min；對(duì)照組SD大鼠以同體積生理鹽水灌腸。（4）造模后大鼠平躺，自然清醒，常規(guī)飼養(yǎng)。（5）考察造模成功率，觀察指標(biāo)和實(shí)施例1一致。3.結(jié)果對(duì)照組SD大鼠精神佳，進(jìn)食飲水量正常，排黃色成形軟便。試驗(yàn)組SD大鼠灌腸24h后精神狀態(tài)較差、厭食、懶動(dòng)、消瘦，部分大鼠排粘液膿血便，結(jié)腸潰瘍并且腸管與腸管、腸管與臟器或組織之間發(fā)生粘連和膿腫，伴有明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，生存率低。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3