本發(fā)明屬于組織工程皮膚技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種復(fù)合組織工程皮膚的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
皮膚是人體最大的器官，幾乎覆蓋全身，具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和功能。然而，作為人體與環(huán)境接觸的第一道屏障，皮膚卻極易受到損害。各類疾病如大面積燒傷、創(chuàng)傷、慢性皮膚潰瘍及瘢痕切除等均可造成皮膚缺損，需要采用不同方法進(jìn)行修復(fù)。人體本身具有一定的修復(fù)能力，可實(shí)現(xiàn)受損皮膚結(jié)構(gòu)和功能不同程度的自我恢復(fù)。但當(dāng)皮膚受損面積大、受損程度嚴(yán)重時(shí)，必須借助外科手術(shù)才可保證皮膚結(jié)構(gòu)與功能的重建。
皮膚移植需要足夠的皮源，自體移植與異體移植都具有一定的局限性，組織工程皮膚的出現(xiàn)解決了這個(gè)問(wèn)題。皮膚組織工程是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)的原理和技術(shù)，以修復(fù)和重建受損皮膚結(jié)構(gòu)與功能為目的的一門學(xué)科，主要包括支架材料的制備、種子細(xì)胞的體外培養(yǎng)與擴(kuò)增、人工皮膚的復(fù)合構(gòu)建與移植。支架材料作為細(xì)胞外基質(zhì)，為種子細(xì)胞提供獲取營(yíng)養(yǎng)、氣體交換、新陳代謝的環(huán)境，在皮膚組織工程的構(gòu)建中起著關(guān)鍵作用。適宜的支架材料不僅有利于種子細(xì)胞的增殖、分化，而且也影響獲得的組織工程產(chǎn)品能否與機(jī)體良好結(jié)合及發(fā)揮效應(yīng)。到目前為止，實(shí)驗(yàn)室培植的人工皮膚支架材料的各方面功能都不及正常皮膚，導(dǎo)致術(shù)后很容易再次撕壞，隨著傷口的愈合，還可能出現(xiàn)瘢痕攣縮，導(dǎo)致更多次的手術(shù)。
脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(acellular dermal matrix，ADM)是去除了可以引發(fā)宿主排斥反應(yīng)的細(xì)胞成分和可溶性蛋白，從而最大限度降低免疫原性，但卻完整地保留了細(xì)胞外基質(zhì)中纖維網(wǎng)絡(luò)的天然形態(tài)結(jié)構(gòu)和組成成分。ADM力學(xué)性能好，抗原性低，成分、結(jié)構(gòu)與正常細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境極其相似，是目前最有應(yīng)用前景的支架材料。羊皮來(lái)源廣泛，在皮膚結(jié)構(gòu)、生物性狀方面與人皮膚相似，且皮膚膠原種屬差異性較小，不易被異體/異種免疫系統(tǒng)作為異體識(shí)別，適宜用作人體組織的修復(fù)與重建。
在組織工程皮膚的構(gòu)建過(guò)程中，需要在支架材料上種植高密度的、具有增殖活力的種子細(xì)胞。皮膚干細(xì)胞是目前引起廣泛關(guān)注的一類成體干細(xì)胞，當(dāng)皮膚因外傷、疾病等原因?qū)е聯(lián)p傷時(shí)，皮膚干細(xì)胞會(huì)及時(shí)增殖分化生成相關(guān)細(xì)胞，從而修復(fù)機(jī)體受損結(jié)構(gòu)。利用皮膚干細(xì)胞的增殖分化特性制備人工皮膚，是目前重要的研究方向，其中，表皮干細(xì)胞(epidermal stem cells，ESCs)因具有較大的增殖和分化潛能成為近年來(lái)研究的重點(diǎn)之一。表皮干細(xì)胞是角質(zhì)形成細(xì)胞中增殖能力最強(qiáng)的細(xì)胞，是潛在的多能干細(xì)胞。ESCs是皮膚組織特異性干細(xì)胞，增殖能力強(qiáng)，可以增殖分化為各種表皮細(xì)胞，具有維持表皮自我更新、保持正常表皮結(jié)構(gòu)以及促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)等作用，是皮膚發(fā)生、修復(fù)、重塑的關(guān)鍵性源泉，以其作為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚，可獲得與生理皮膚相類似的組織結(jié)構(gòu)。
盡管目前已有許多組織工程皮膚應(yīng)用于臨床，但仍存在著諸多問(wèn)題需要解決。如用于構(gòu)建人工皮膚的種子細(xì)胞的分離、培養(yǎng)所需時(shí)間長(zhǎng)，不能與臨床應(yīng)用相適應(yīng)；目前所構(gòu)建的真皮支架的生物相容性及三維孔隙結(jié)構(gòu)與正常真皮基質(zhì)相比還相差甚遠(yuǎn)；用于臨床的復(fù)合皮膚雖能一次性覆蓋皮膚缺損創(chuàng)面，但帶有皮膚附屬結(jié)構(gòu)的人工皮膚仍在研究中等。隨著各學(xué)科的發(fā)展，人工皮膚的研制和應(yīng)用也將得到進(jìn)一步的發(fā)展與完善，所面臨的各個(gè)問(wèn)題也將逐一被解決。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種復(fù)合組織工程皮膚的構(gòu)建方法，以本發(fā)明方法構(gòu)建的復(fù)合組織工程皮膚具有理想的三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，更接近于天然皮膚結(jié)構(gòu)。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用人表皮干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，羊脫細(xì)胞真皮基質(zhì)作為支架載體，利用氣液界面分離法體外培養(yǎng)構(gòu)建復(fù)合組織工程皮膚。
具體地，本發(fā)明所述復(fù)合組織工程皮膚的構(gòu)建方法是以Disapse—胰蛋白酶兩步消化法從人源性皮膚中分離培養(yǎng)表皮干細(xì)胞，以高滲鹽—NP-40—胰蛋白酶-EDTA法制備羊脫細(xì)胞真皮基質(zhì)支架，將培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞接種于羊脫細(xì)胞真皮基質(zhì)支架上，氣液界面分離培養(yǎng)構(gòu)建復(fù)合組織工程皮膚。
更具體地，本發(fā)明是按照下述步驟構(gòu)建所述復(fù)合組織工程皮膚。
1）表皮干細(xì)胞作為種子細(xì)胞的分離、培養(yǎng)。
以生理鹽水將剔除脂肪及皮下組織的人源性皮膚清洗干凈后，浸入DisapseⅡ中4℃消化；分離出表皮皮片置于胰蛋白酶-EDTA消化液中常溫消化，血清終止消化；過(guò)濾，離心棄上清，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；將重懸細(xì)胞接種在預(yù)先包被有0.5g/L IV型膠原的培養(yǎng)皿內(nèi)，置于體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)15min，吸掉未貼壁細(xì)胞，保留貼壁細(xì)胞，重新加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%滿時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)；收集1～5代培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞作為種子細(xì)胞。
2）羊脫細(xì)胞真皮基質(zhì)支架的制備。
將除去皮下組織、保留表皮與真皮部分的羊皮浸入1mmol/L NaCl溶液中，振蕩24h脫去表皮；再加入到NP-40中，常溫下?lián)u床持續(xù)震搖24h，脫去殘余細(xì)胞及碎片；浸入胰蛋白酶-EDTA消化液中常溫消化20min，取出，以PBS緩沖液反復(fù)沖洗，得到羊脫細(xì)胞真皮基質(zhì)支架。
3）復(fù)合組織工程皮膚的構(gòu)建。
將培養(yǎng)好的表皮干細(xì)胞接種在羊脫細(xì)胞真皮基質(zhì)支架上，用培養(yǎng)基將真皮基質(zhì)支架完全浸沒(méi)，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周后，轉(zhuǎn)移至網(wǎng)架上，添加新鮮培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基液面與真皮基質(zhì)支架底部平齊，從而使表皮干細(xì)胞部分暴露于空氣中，氣液界面分離培養(yǎng)1周，得到復(fù)合組織工程皮膚。
本發(fā)明上述構(gòu)建方法中，所使用的胰蛋白酶-EDTA消化液是含0.01wt% EDTA的0.125wt%胰蛋白酶消化液。
本發(fā)明上述構(gòu)建方法中，所使用的培養(yǎng)基是含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的K-SFM培養(yǎng)基。
本發(fā)明上述構(gòu)建方法中，作為種子細(xì)胞用于構(gòu)建復(fù)合組織工程皮膚的表皮干細(xì)胞的傳代代數(shù)一般為1～5代。作為優(yōu)選，本發(fā)明使用的種子細(xì)胞是傳代代數(shù)未2～3代的表皮干細(xì)胞。
本發(fā)明上述構(gòu)建方法中，構(gòu)建復(fù)合組織工程皮膚所用表皮干細(xì)胞適宜的接種密度為1×104/cm2～1×109/cm2。優(yōu)選地，本發(fā)明使用的表皮干細(xì)胞接種密度為1×106/cm2。
本發(fā)明上述構(gòu)建方法中，所涉及到的在培養(yǎng)基中培養(yǎng)表皮干細(xì)胞的過(guò)程中，均應(yīng)每2～3天更換一次新鮮培養(yǎng)基。
本發(fā)明所述構(gòu)建方法的特點(diǎn)之一是表皮干細(xì)胞分離培養(yǎng)使用的消化液中胰蛋白酶含量低，減少了胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的損傷。同時(shí)，采用胰蛋白酶與EDTA混合，EDTA可以螯合Ca2+，抑制Ca2+依賴型鈣粘蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞間的黏附，縮短了消化時(shí)間。胰蛋白酶濃度的降低，也減少了中和血清的用量，從而降低了血清對(duì)表皮干細(xì)胞分化的影響。進(jìn)而，本發(fā)明采用常溫消化，進(jìn)一步降低了胰蛋白酶的活性。
本發(fā)明所述構(gòu)建方法的特點(diǎn)之二是利用了表皮干細(xì)胞對(duì)IV型膠原的黏附速度比其他細(xì)胞快的特點(diǎn)，快速分離出了表皮干細(xì)胞。本發(fā)明所述構(gòu)建方法中，使用的IV型膠原的濃度為0.25～0.5g/L，優(yōu)選地，所用的IV型膠原的濃度為0.5g/L。
本發(fā)明所述構(gòu)建方法的特點(diǎn)之三是利用NP-40非離子性去垢劑來(lái)洗脫羊皮細(xì)胞。單用胰蛋白酶對(duì)羊皮細(xì)胞的洗脫效果較差，但胰蛋白酶處理聯(lián)合非離子性去垢劑NP-40，能有效溶解膜蛋白，達(dá)到更好的脫細(xì)胞效果。且與SDS和Triton X-100相比，NP-40的性狀溫和，能夠有效保留細(xì)胞外基質(zhì)中的生長(zhǎng)因子成分。
本發(fā)明所述構(gòu)建方法的特點(diǎn)之四是采用氣液界面體外培養(yǎng)技術(shù)，模擬在體條件，使表皮細(xì)胞處于氣液分離的界面上，實(shí)現(xiàn)逐步分化的狀態(tài)，使人工皮膚培養(yǎng)技術(shù)成為可能。
本發(fā)明所述構(gòu)建方法的特點(diǎn)之五是利用異種羊皮進(jìn)行脫細(xì)胞處理作為支架材料，拓展和豐富了豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)支架以外的其它種屬脫細(xì)胞支架的應(yīng)用。且羊皮來(lái)源廣泛，適用于特殊人群(穆斯林)。
本發(fā)明所構(gòu)建的復(fù)合組織工程皮膚具有理想的三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和形成新的膠原纖維，構(gòu)建時(shí)間短，組織學(xué)結(jié)構(gòu)完整，更接近于天然皮膚，達(dá)到了組織工程皮膚形態(tài)學(xué)的要求。
本發(fā)明復(fù)合組織工程皮膚原料來(lái)源廣泛，在臨床應(yīng)用中有巨大潛能。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，并不用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行任何限制。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
實(shí)施例1：表皮干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定。
種子細(xì)胞來(lái)源于小兒包皮環(huán)切手術(shù)或燒傷整形植皮手術(shù)的剩余皮片。
無(wú)菌條件下，將皮片盡可能徹底地剔除掉脂肪及皮下組織后，以生理鹽水反復(fù)清洗干凈，剪成2mm×2mm大小，浸入5g/L DisapseⅡ中，4℃下消化16～18h。將表皮與真皮分離，挑出表皮皮片置于含0.01wt% EDTA的0.125wt%胰蛋白酶消化液中，室溫下消化15min，血清終止消化。過(guò)濾，離心(1000rpm，5min)后棄上清，用含10wt%胎牛血清的K-SFM培養(yǎng)基作為表皮干細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞。將重懸細(xì)胞以4×105個(gè)/ml的濃度接種在預(yù)先包被有0.5g/L IV型膠原的培養(yǎng)皿內(nèi)，置于5% CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)15min，吸掉未貼壁的細(xì)胞，保留貼壁細(xì)胞，重新加入新的表皮干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)期間2天更換一次培養(yǎng)基。
待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%滿時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，最終得到第2代表皮干細(xì)胞。
表皮干細(xì)胞形態(tài)觀察：將原代培養(yǎng)及第二次傳代培養(yǎng)得到的表皮干細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)。3天后，有部分細(xì)胞形成較小克隆，胞體緊密相靠，胞膜互相銜接，呈典型“鋪路石樣”生長(zhǎng)，是典型的表皮干細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)。
表皮干細(xì)胞鑒定：取增殖活力好的傳代培養(yǎng)的第2代表皮干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片，免疫組化染色檢測(cè)表皮干細(xì)胞的K19和β1整合素表達(dá)，并以同一標(biāo)本培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞做對(duì)照。結(jié)果顯示95%以上的細(xì)胞K19和β1整合素陽(yáng)性表達(dá)，呈棕黃染色，表明該細(xì)胞為表皮干細(xì)胞。
實(shí)施例2：羊脫細(xì)胞真皮基質(zhì)支架的制備。
選用健康成年白羊的羊皮，除去皮下組織，保留表皮與真皮部分，并去除皮膚中的毛發(fā)成分，制成0.4mm厚的皮片。將皮片裁剪成3cm×3cm 大小的方塊狀，取小方塊浸入1mmol/L NaCl溶液中，37℃恒溫振蕩24h脫去表皮，以PBS緩沖液反復(fù)沖洗干凈。再加入到0.1wt%的NP-40中，常溫下?lián)u床持續(xù)震搖24h，脫去殘余的細(xì)胞及其碎片后，以PBS緩沖液反復(fù)沖洗干凈。然后再浸入0.25wt%的胰蛋白酶-EDTA消化液中20min，用PBS緩沖液中反復(fù)沖洗干凈，得到羊脫細(xì)胞真皮基質(zhì)支架。
得到的羊脫細(xì)胞真皮基質(zhì)支架儲(chǔ)存于無(wú)菌PBS緩沖液中，密封，4℃保存，或置于-80℃超低溫冰箱中保存。
掃描電鏡觀察：取脫細(xì)胞真皮基質(zhì)支架，以0.1mol/L PBS緩沖液清洗后，固定于2wt%多聚甲醛與2.5wt%戊二醛中，乙醇梯度脫水，用加有無(wú)水CaCl2的丙酮脫水3次，再用加有無(wú)水CaCl2的乙酸異戊酯置換3次后，放置在樣品盒中臨界點(diǎn)干燥，真空噴金。掃描電鏡下觀察顯示，未見(jiàn)細(xì)胞成分殘存，膠原纖維保持良好的天然三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。
將羊脫細(xì)胞真皮基質(zhì)支架的石蠟切片以蘇木精-伊紅染色后，顯示表皮已去除，真皮內(nèi)未見(jiàn)細(xì)胞、細(xì)胞碎屑存在，可見(jiàn)細(xì)胞外基質(zhì)樣結(jié)構(gòu)存在，膠原完整，排列規(guī)則。
實(shí)施例3：復(fù)合組織工程皮膚的構(gòu)建。
將實(shí)施例2制備的羊脫細(xì)胞真皮基質(zhì)支架真皮面朝上，平鋪在35mm培養(yǎng)皿內(nèi)，取實(shí)施例1擴(kuò)增的第2代增殖力強(qiáng)的表皮干細(xì)胞，用胰蛋白酶消化20min，血清終止，以1×106/cm2的密度接種于上述鋪好的羊脫細(xì)胞真皮基質(zhì)支架上，添加足量含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的K-SFM培養(yǎng)基，使真皮基質(zhì)支架完全浸沒(méi)，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中浸沒(méi)式培養(yǎng)1周，期間每2天換液一次。之后，將浸沒(méi)式培養(yǎng)得到的組織工程皮膚轉(zhuǎn)移至不銹鋼網(wǎng)架上，添加新鮮的含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的K-SFM培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基的液面與真皮基質(zhì)支架底部平齊，從而使表皮干細(xì)胞部分暴露于空氣中，氣液界面分離培養(yǎng)，每2天換液一次，繼續(xù)培養(yǎng)1周左右，得到復(fù)合組織工程皮膚。
倒置顯微鏡下連續(xù)觀察，開(kāi)始培養(yǎng)基清澈透明無(wú)污染，并可見(jiàn)真皮基質(zhì)支架周圍細(xì)胞增殖明顯，培養(yǎng)2～3天后，培養(yǎng)基變黃，提示細(xì)胞增殖代謝旺盛。
分別對(duì)浸沒(méi)式培養(yǎng)和氣液分離培養(yǎng)的工程皮膚進(jìn)行蘇木精-伊紅染色檢測(cè)。浸沒(méi)式培養(yǎng)1周時(shí)，脫細(xì)胞真皮基質(zhì)支架表面覆蓋一層融合的表皮細(xì)胞，但很薄，細(xì)胞分層少，以后表皮逐漸增厚。將樣品轉(zhuǎn)至氣液分離界面再培養(yǎng)1周后觀察可見(jiàn)，表皮干細(xì)胞分裂增殖為多層，并與真皮的膠原纖維緊密連接，具有理想的三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，組織學(xué)結(jié)構(gòu)完整，更接近于天然皮膚，達(dá)到了組織工程皮膚形態(tài)學(xué)的要求。