本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明提供了一種化合物(L6H3)在制備用于治療帕金森病等的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

帕金森病(Parkinson’s disease，簡(jiǎn)稱(chēng)為PD)是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，又稱(chēng)震顫麻痹，常見(jiàn)于中老年人。PD的病理特征主要是中腦黑質(zhì)多巴胺(Dopamine，簡(jiǎn)稱(chēng)為DA)系統(tǒng)神經(jīng)元喪失、多巴胺含量顯著下降，神經(jīng)元細(xì)胞有路易小體(Lewy body)出現(xiàn)。臨床上的癥狀表現(xiàn)為靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)徐緩、肌肉強(qiáng)直、姿勢(shì)步態(tài)障礙等不自主的異常運(yùn)動(dòng)行為。

PD病變復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，可能的致病機(jī)理包括：PD患者紋狀體中DA含量減少，紋狀體的抑制性作用降低，而乙酰膽堿(Aacetylcholine，Ach)含量卻無(wú)改變，則Ach的興奮性作用相對(duì)增強(qiáng)，紋狀體DA含量降低而使膽堿(Ach)能系統(tǒng)的功能相對(duì)亢進(jìn)；Glu的異常增高對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有毒性作用，不僅PD病人在運(yùn)動(dòng)環(huán)路中存在繼發(fā)的Glu能傳導(dǎo)障礙，而且Glu作為興奮性氨基酸可造成神經(jīng)元的損傷；紋狀體的GABA水平的增高，輸出到蒼白球外側(cè)部的GABA增加，使得基底節(jié)核團(tuán)活性紊亂，抑制運(yùn)動(dòng)功能發(fā)揮。

外科治療PD主要采用蒼白球和丘腦的射頻毀損術(shù)，這在10年前比較推崇，但由于其為破壞性手術(shù)，且復(fù)發(fā)率較高、并發(fā)癥多，目前已較少采用。目前臨床上治療PD的方法包括多巴胺替代治療、單胺氧化酶抑制劑、金剛烷胺、抗膽堿能藥物及多巴胺受體激動(dòng)劑等，但是這些藥物只能暫時(shí)減輕或緩解癥狀，而不能阻止PD的進(jìn)程，而且長(zhǎng)期應(yīng)用抗PD藥物會(huì)相繼出現(xiàn)多種并發(fā)癥。現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)逐漸將注意力轉(zhuǎn)移到紋狀體內(nèi)干細(xì)胞移植上，以修復(fù)神經(jīng)元來(lái)對(duì)PD治本。

本發(fā)明人沒(méi)有受現(xiàn)有技術(shù)的啟示去采用流行的干細(xì)胞移植，而是通過(guò)自身的長(zhǎng)期研究和實(shí)驗(yàn)，尤其是憑了些運(yùn)氣，令人意外地從天文數(shù)字般多的現(xiàn)有化合物中發(fā)現(xiàn)了一種化合物(L6H3)，其不僅能改善PD癥狀，而且對(duì)神經(jīng)元有修護(hù)作用，既治標(biāo)又治本，效果遠(yuǎn)優(yōu)于其類(lèi)似物，具備作為新一代PD藥物的前景。另外，該化合物合成步驟簡(jiǎn)單，適合大規(guī)模制備，從而方便推廣應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供新的L6H3的用途，用于治療帕金森病等，尤其是其不但能改善帕金森病癥狀，而且能修復(fù)腦神經(jīng)元損傷，從而從根本上治療帕金森病。

具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了L6H3在制備用于改善帕金森病癥狀的藥物中的應(yīng)用。在本文中，改善具有其常規(guī)含義，尤其指的是將帕金森病癥狀往癥狀消失的方向修正或調(diào)整，包括癥狀的嚴(yán)重程度降低。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，帕金森病癥狀是APO誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，L6H3對(duì)帕金森病癥狀的改善具有持續(xù)性，即停藥后(至少停藥后約一周的時(shí)間)仍舊在改善帕金森病癥狀，不僅僅是維持已有的癥狀，更遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于現(xiàn)有藥物停藥后帕金森病癥狀出現(xiàn)的惡化反彈(加重)。因此優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的應(yīng)用中，改善包括用藥時(shí)改善和停藥后改善。更優(yōu)選其中，停藥是停藥3-10天，優(yōu)選是5-7天。這樣無(wú)需連續(xù)不斷用藥的特性對(duì)于患者的順應(yīng)性是非常有利的。

在第二方面，本發(fā)明提供了L6H3在制備用于修復(fù)腦神經(jīng)元損傷的藥物中的應(yīng)用。在本文中，修復(fù)具有其常規(guī)含義，尤其指的是腦神經(jīng)元損傷后進(jìn)行的修補(bǔ)恢復(fù)。腦神經(jīng)元通常被認(rèn)為是不可再生的，即使有少量再生，但是其再生量極少。而本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，L6H3能對(duì)6-OHDA引起的多巴胺能神經(jīng)元損傷起到恢復(fù)功能，使得該神經(jīng)元的數(shù)量得以恢復(fù)。

優(yōu)選在本發(fā)明第二方面的應(yīng)用中，神經(jīng)元是多巴胺能神經(jīng)元。

也優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的應(yīng)用中，損傷是由6-OHDA引起的。

在第三方面，本發(fā)明提供了L6H3在制備用于治療帕金森病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，對(duì)于帕金森病的治療，L6H3不但能治標(biāo)，而且有治本的作用。

L6H3可以單獨(dú)作為有效成分來(lái)改善帕金森病癥狀和修復(fù)腦神經(jīng)元損傷，用于治療帕金森病。因此優(yōu)選本發(fā)明第一、二和/或三方面的應(yīng)用是L6H3單獨(dú)作為有效成分的應(yīng)用，即L6H3單獨(dú)作為有效成分在制備用于改善帕金森病癥狀、修復(fù)腦神經(jīng)元損傷和/或治療帕金森病的藥物中的應(yīng)用。

L6H3通常與藥學(xué)上可接受的輔料配置為藥物制劑來(lái)給藥。在本文中，藥學(xué)上可接受的輔料指無(wú)毒的填充劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、載體、溶劑或其他制劑輔料。例如，稀釋劑、賦形劑，如微晶纖維素、甘露醇等；表面活性劑，如十六烷醇；溶劑，如水、緩沖液、生理鹽水等。另外，優(yōu)選在本發(fā)明第一、二和/或三方面的應(yīng)用中，藥物是腦輸注制劑。

本發(fā)明取得的有益效果在于：L6H3不但能改善帕金森病癥狀，而且能從根本上修復(fù)腦神經(jīng)元損傷，效果優(yōu)于其類(lèi)似物，具有治療帕金森病的前景，另外它制備簡(jiǎn)便，方便推廣應(yīng)用。

以下將通過(guò)具體的附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說(shuō)明書(shū)的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對(duì)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)都是顯而易見(jiàn)了。

附圖說(shuō)明

圖1顯示了APO誘發(fā)的大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)，其中，^**表示與假手術(shù)組(Sham)相比，P<0.01；^##表示與PD組相比，P<0.01；^#表示與PD組相比，P<0.05；^&表示與給藥后第2周(圖中第6周)的PD+Madopar組相比，P<0.05。

圖2顯示了多巴胺能陽(yáng)性神經(jīng)元的免疫組化染色結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)具體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容。如未詳盡之處，可以參見(jiàn)《現(xiàn)代藥學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》、《中國(guó)藥典》以及藥物監(jiān)管部門(mén)(如，CFDA)的相關(guān)規(guī)定和指引等。

實(shí)施例1 L6H3的合成

將1mmol相應(yīng)的取代香草醛和4-乙基苯乙酮溶于30mL無(wú)水乙醇中，加入5滴濃硫酸，60℃反應(yīng)10h后，用TLC檢測(cè)反應(yīng)的進(jìn)行。反應(yīng)完后，加入3倍反應(yīng)液體積的水析出沉淀，干燥后得淡黃色粉末狀產(chǎn)物，再經(jīng)硅膠柱色譜純化得到純度98％的化合物(orange crystal,20.1％yield)，其理化參數(shù)如下：mp 156.4～158.7℃.¹H-NMR(CDCl₃),δ:8.014(d,J＝8.4Hz,2H,H-2’,H-6’),7.772(d,J＝15.6Hz,1H,H-β),7.537(d,J＝9Hz,2H,H-2,H-6),7.342(d,J＝15.6Hz,1H,H-α),6.960(d,J＝9Hz,2H,H-3,H-5),6.686(d,J＝8.4Hz,2H,H-3’,H-5’),3.052(s,6H,N(CH₃)₂-4’).ESI-MS m/z:285.3(M+1)⁺。

實(shí)施例2大鼠帕金森病模型的構(gòu)建

將大鼠用10％水合氯醛腹腔注射(0.3mL/l00g)麻醉后，應(yīng)用耳桿將其頭部固定在立體定位儀上，剪毛消毒，在頭背中部縱向切口，暴露前囟和人字點(diǎn)。選右側(cè)紋狀體為注射區(qū)，定位坐標(biāo)：前囟0.7mm，中線右旁3.0mm，硬膜下5.5mm。微量注射器吸取含有2.0g/L維生素C的生理鹽水配制而成的1.5μg/μL 6-羥多巴胺(6-OHDA)溶液10μL，使用微量注射泵以10nL/sec的速度進(jìn)行注射，且為能使藥物充分彌散，每注射5μL留針5min，注射完畢再留針10min，最后緩慢退出注射針，縫合傷口，待其清醒。另取15只假手術(shù)組大鼠，按上述同樣方法和坐標(biāo)操作，注射等體積含有2.0g/L維生素C的生理鹽水。操作過(guò)程按無(wú)菌手術(shù)規(guī)程進(jìn)行，留針后肌肉注射青霉素20萬(wàn)單位/只，縫合，清醒后正常飼養(yǎng)。

術(shù)后第1周開(kāi)始對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，每周1次，連續(xù)4周，每次用0.1g/L的阿樸嗎啡(APO)溶液腹腔注射(0.5mg/kg)誘發(fā)大鼠旋轉(zhuǎn)行為，觀察記錄每分鐘向健側(cè)旋轉(zhuǎn)次數(shù)及40min旋轉(zhuǎn)的總次數(shù)。旋轉(zhuǎn)360度為一轉(zhuǎn)(r)，以大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)≥7r/min且旋轉(zhuǎn)圈數(shù)穩(wěn)定在該水平時(shí)認(rèn)定PD大鼠模型建立成功。

本次造模共成功45只。另取大鼠施行以上手術(shù)，但是不注射6-OHDA，作為假手術(shù)組(SHAM)，即正常對(duì)照。

實(shí)施例3 L6H3對(duì)PD模型大鼠的藥效實(shí)驗(yàn)

將造模成功的大鼠隨機(jī)分成PD組、PD+L6H3組和PD+Madopar組，每組15只。其中，PD+L6H3組大鼠用10％水合氯醛(0.3mL/l00g)腹腔注射麻醉后，將其頭部固定在大鼠腦立體定位儀上，剪毛消毒，在頭背中部縱向切口，暴露顱骨，去除骨膜后，將其鉆孔并將引導(dǎo)管插入原造模位點(diǎn)5mm深處。并在引導(dǎo)管周?chē)潭?個(gè)螺絲，與引導(dǎo)管呈三角形排列，最后用牙科水泥固定。將大鼠頭部的引導(dǎo)管與給藥管芯相連，每天給予配置好的L6H3溶液(1.5μg/μL)10μL，設(shè)定1uL/100sec的給藥速率進(jìn)行給藥，此時(shí)大鼠可在一定范圍內(nèi)自由活動(dòng)，連續(xù)給藥14天。

另外，作為模型對(duì)照的PD組實(shí)施與以上基本相同的步驟，但是給藥的溶液中不含L6H3；作為陽(yáng)性對(duì)照的PD+Madopar組，連續(xù)灌胃給藥美多巴(Madopar，50mg/Kg)14天。

分別于造模后第1-4周、給藥后第1、2周和停藥后1周，大鼠用APO溶液誘導(dǎo)進(jìn)行大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖1(其中依次為造模后第1-4周、給藥后第1-2周(圖中第5-6周)及停藥后第1周(圖中第7周))所示，假手術(shù)組無(wú)旋轉(zhuǎn)行為，而PD組、PD+L6H3組和PD+Madopar組大鼠都表現(xiàn)出以健側(cè)前肢或后肢為支點(diǎn)、身體環(huán)曲、首尾相接地原地旋轉(zhuǎn)，伴覓食樣動(dòng)作，在造模后3周內(nèi)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)有上升趨勢(shì)，第3周至第4周旋轉(zhuǎn)圈數(shù)基本穩(wěn)定，且轉(zhuǎn)圈數(shù)≥7r/min，部分動(dòng)物尾僵直、震顫、好斗、對(duì)外界刺激敏感、易于激惹及步態(tài)不穩(wěn)現(xiàn)象，旋轉(zhuǎn)行為在給藥后15-30min內(nèi)最為迅速，30min后旋轉(zhuǎn)明顯變慢；給藥后的第1周，與PD組相比，PD+L6H3組和PD+Madopar組大鼠的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)有下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；給藥后的第2周，PD+L6H3組和PD+Madopar組與陽(yáng)性對(duì)照PD+Madopar組相似，與PD組相比，均顯示出對(duì)阿撲嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為的明顯抑制作用(P<0.05)；而停藥后1周，PD+L6H3組大鼠的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)仍舊有下降趨勢(shì)，明顯比PD+Madopar組降低(P<0.05)；而PD+Madopar組大鼠的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)與給藥后的第2周同組比呈明顯上升趨勢(shì)(P<0.05)。所以，用L6H3和美多芭治療2周后均明顯改善PD癥狀(大鼠的旋轉(zhuǎn)行為)，尤其是停藥1周后，PD+L6H3組大鼠的PD癥狀繼續(xù)得到改善，而PD+Madopar組大鼠的療效沒(méi)有持續(xù)性。

然后，假手術(shù)組、PD組、PD+L6H3組和PD+Madopar組每組隨機(jī)各取5只大鼠，用水合氯醛腹腔注射麻醉后，開(kāi)胸腔充分暴露心臟，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，由左心室心尖處插入輸液管，先快速滴注溫生理鹽水，使組織內(nèi)的血液被沖洗干凈，至肝、肺等組織完全泛白為止。接著以4％多聚甲醛(250mL-500mL)左右，灌注固定30min-60min，直至大鼠肝臟變硬、肢體僵硬即完成固定。接著斷頭，取整個(gè)腦組織，置于4％多聚甲醛溶液中，4℃固定3天。再冠狀切取中腦黑質(zhì)部約5mm組織，梯度脫水，透明，石蠟包埋。最后，進(jìn)行連續(xù)冠狀切片(6μm)，進(jìn)行免疫組化染色，于顯微鏡下觀察大鼠黑質(zhì)中多巴胺能陽(yáng)性神經(jīng)元(即酪氨酸羥化酶，TH)神經(jīng)纖維。結(jié)果如圖2所示，假手術(shù)組大鼠黑質(zhì)中的TH免疫陽(yáng)性神經(jīng)元清晰可見(jiàn)，DA能神經(jīng)元的胞體和纖維染色較深，有明顯可見(jiàn)的免疫陽(yáng)性突起；對(duì)于PD模型大鼠，TH免疫陽(yáng)性神經(jīng)元損傷嚴(yán)重，僅剩少量殘余的神經(jīng)纖維，損傷程度高達(dá)90％左右，經(jīng)過(guò)L6H3處理后，黑質(zhì)區(qū)的TH含量增多，表明L6H3對(duì)PD模型大鼠的多巴胺能神經(jīng)元嚴(yán)重?fù)p害有明顯的修復(fù)作用，減少了受損的神經(jīng)元；而美多巴對(duì)PD模型大鼠的多巴胺能神經(jīng)元嚴(yán)重?fù)p害并無(wú)改善作用。