本發(fā)明涉及醫(yī)學領(lǐng)域，具體的說是涉及一種脂肪間充質(zhì)干細胞組合物及其應用。
背景技術(shù)：
：骨性關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病，發(fā)病率高，在老年人口中十分常見，60歲以上的人群中患病率可達50％，75歲以上的人群中則達80％。骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)疼痛常使患者難以忍受，患者發(fā)病后致殘率高。骨關(guān)節(jié)炎常發(fā)生軟骨缺損，但軟骨的自身修復能力有限，通?？梢詫④浌切迯妥鳛楣顷P(guān)節(jié)炎治療的最重要評價指標?，F(xiàn)有的治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物能在一定程度上延緩病程、改善患者癥狀，緩解患者疼痛，但不能逆轉(zhuǎn)病理過程，不能根治骨關(guān)節(jié)炎，且大部分藥物副作用明顯。而外科手術(shù)治療主要通過關(guān)節(jié)鏡(窺鏡)、開放手術(shù)或人工關(guān)節(jié)置換，雖然能暫時緩解疼痛，但長遠效果(10年左右)并不理想。干細胞等細胞治療法是目前最有希望徹底解決骨關(guān)節(jié)炎治療的新方法。近十年來，干細胞移植治療骨關(guān)節(jié)炎已有大量研究報道。干細胞注入骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)后，能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，炎癥反應調(diào)節(jié)作用，減少疼痛；分泌抗凋亡因子和抗纖維化因子抑制病情進展；分泌TGF-β、BMP-4等因子，促進內(nèi)源性干細胞軟骨修復；還能分化為軟骨細胞幫助修復軟骨。中國專利CN105796600A公開了使用干細胞治療骨關(guān)節(jié)炎的方法和組合物，該組合物包括間充質(zhì)干細胞、透明質(zhì)酸或其藥用鹽、氯化鈉和水，雖然其記載了凍存后細胞存活率較好的有益效果，但是采用該組合物治療骨關(guān)節(jié)炎的效果卻具有一定的缺陷，主要是治療后復發(fā)率較高。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于一種脂肪間充質(zhì)干細胞組合物及其應用，使得所述組合物對骨關(guān)節(jié)炎有顯著的療效，且治療后復發(fā)率較低。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種脂肪間充質(zhì)干細胞組合物，包括脂肪間充質(zhì)干細胞、透明質(zhì)酸或其藥用鹽、生理鹽水、人血白蛋白、胰島素生長因子。針對現(xiàn)有間充質(zhì)干細胞制劑在治療骨關(guān)節(jié)炎方面存在復發(fā)率較高的問題，本發(fā)明選用脂肪間充質(zhì)干細胞、透明質(zhì)酸或其藥用鹽、生理鹽水、人血白蛋白、胰島素生長因子組成新型組合物，對骨關(guān)節(jié)炎具有較為顯著的療效并且復發(fā)率較低。其中，作為優(yōu)選，脂肪間充質(zhì)干細胞濃度為(1-2)×106個/mL，透明質(zhì)酸或其藥用鹽體積百分比為5-10％，人血白蛋白體積百分比10-15％，胰島素生長因子體積百分比為5-10％，其余為生理鹽水。在本發(fā)明具體實施過程中，所述組合物中各成分組成可任意選擇如下：(1)脂肪間充質(zhì)干細胞濃度為1.5×106個/mL，透明質(zhì)酸或其藥用鹽體積百分比為8％，人血白蛋白體積百分比10％，胰島素生長因子體積百分比為8％，其余為生理鹽水；(2)脂肪間充質(zhì)干細胞濃度為2×106個/mL，透明質(zhì)酸或其藥用鹽體積百分比為5％，人血白蛋白體積百分比13％，胰島素生長因子體積百分比為10％，其余為生理鹽水；(3)脂肪間充質(zhì)干細胞濃度為1×106個/mL，透明質(zhì)酸或其藥用鹽體積百分比為10％，人血白蛋白體積百分比15％，胰島素生長因子體積百分比為5％，其余為生理鹽水；本發(fā)明所述脂肪間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)可按照常規(guī)方法進行，在具體制備時可采用患者自體脂肪進行分離培養(yǎng)，本發(fā)明提供了如下方法：抽取30ml新鮮脂肪，將脂肪轉(zhuǎn)移到無菌儲液瓶中用等體積PBS劇烈搖晃，靜止分層棄去下層液體，重復一次；將清洗好的脂肪轉(zhuǎn)移到50ml離心管中補加加PBS至體積50ml，用1500rpm離心5分鐘，離心后用移液管將上層脂肪油和下層液體棄置，再加入等體積的I型膠原酶，蓋上蓋子封口；轉(zhuǎn)移到恒溫震蕩儀中以37度、200轉(zhuǎn)每分進行消化，大概30-50分鐘，至脂肪完全消化，再轉(zhuǎn)移到離心機中以1500rpm離心5分鐘；用移液管吸掉上層脂肪油，倒棄剩余液體，再用40mlPBS重懸細胞沉淀，繼續(xù)以1500rpm離心5分鐘；倒棄液體，用Lonza無血清完全培養(yǎng)基重懸，分到3個10cm的培養(yǎng)皿中，每個皿10ml，再在每個皿中加入EGF調(diào)整后EGF為10ng/ml，放置37度、5％二氧化碳、濕度95％的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)2天后，給細胞換液，每天觀察細胞，待細胞貼壁匯合度達到80％給細胞傳代。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述脂肪間充質(zhì)干細胞選擇傳代5代以內(nèi)的細胞。作為優(yōu)選，所述人血白蛋白的濃度為20％。本發(fā)明組合物在治療兔骨關(guān)節(jié)炎的實驗中，破壞的軟骨表層恢復完好，軟骨正常未發(fā)生空泡樣變性，成熟軟骨細胞柱狀線恢復；軟骨含量、TNF-α含量和Mankin評分結(jié)果與正常組無顯著差異，表明本發(fā)明組合物對骨關(guān)節(jié)炎具有顯著的療效。同時以本發(fā)明所述組合物為試驗對象，以現(xiàn)有專利CN105796600A實施例8的臍帶間充質(zhì)干細胞組合物為第一組對照，同時在其基礎(chǔ)上用脂肪間充質(zhì)干細胞替換臍帶間充質(zhì)干細胞設(shè)置第二組對照，分別治療按臨床標準劃分為相同程度的骨關(guān)節(jié)炎疾病志愿者，結(jié)果顯示，采用本發(fā)明組合物治療的志愿者，復發(fā)率只有36％，而另外兩組對照組的復發(fā)率均為68％，此外其中一組還有1例無效?；谏鲜鰞?yōu)異的技術(shù)效果，本發(fā)明提供了所述組合物在制備治療骨關(guān)節(jié)炎產(chǎn)品中的應用。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明組合物選擇脂肪間充質(zhì)干細胞、透明質(zhì)酸或其藥用鹽、生理鹽水、人血白蛋白、胰島素生長因子作為治療骨關(guān)節(jié)炎的成分，組合物組成簡單，脂肪間充質(zhì)干細胞為自體細胞，取材不受限制，并且在治療復發(fā)率上明顯低于其他干細胞制劑，具有廣闊的應用前景。附圖說明圖1所示為正常兔關(guān)節(jié)石蠟切片圖；圖2所示為骨關(guān)節(jié)炎兔模型關(guān)節(jié)石蠟切片圖；圖3所示為經(jīng)過本發(fā)明組合物治療后的骨關(guān)節(jié)炎兔模型關(guān)節(jié)石蠟切片圖。具體實施方式本發(fā)明實施例公開了一種脂肪間充質(zhì)干細胞組合物及其應用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明產(chǎn)品和應用已通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的產(chǎn)品和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明所述組合物將各組分按照要求的比例輕微振蕩混勻即可獲得所述組合物。在本發(fā)明兔骨關(guān)節(jié)炎的實驗中，脂肪來源為模型兔自體脂肪，同樣，在骨關(guān)節(jié)炎志愿者臨床治療實驗中，脂肪來源為志愿者自體脂肪，所用脂肪間充質(zhì)干細胞均經(jīng)過流式細胞儀檢測細胞表面標志物符合要求，實施方式中采用傳代至第4代的細胞。以下就本發(fā)明所提供的一種脂肪間充質(zhì)干細胞組合物及其應用做進一步說明。實施例1：脂肪間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)抽取30ml新鮮脂肪，將脂肪轉(zhuǎn)移到無菌儲液瓶中用等體積PBS劇烈搖晃，靜止分層棄去下層液體，重復一次；將清洗好的脂肪轉(zhuǎn)移到50ml離心管中補加加PBS至體積50ml，用1500rpm離心5分鐘，離心后用移液管將上層脂肪油和下層液體棄置，再加入等體積的I型膠原酶，蓋上蓋子封口；轉(zhuǎn)移到恒溫震蕩儀中以37度、200轉(zhuǎn)每分進行消化，大概30-50分鐘，至脂肪完全消化，再轉(zhuǎn)移到離心機中以1500rpm離心5分鐘；用移液管吸掉上層脂肪油，倒棄剩余液體，再用40mlPBS重懸細胞沉淀，繼續(xù)以1500rpm離心5分鐘；倒棄液體，用Lonza無血清完全培養(yǎng)基重懸，分到3個10cm的培養(yǎng)皿中，每個皿10ml，再在每個皿中加入EGF調(diào)整后EGF為10ng/ml，放置37度、5％二氧化碳、濕度95％的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)2天后，給細胞換液，每天觀察細胞，待細胞貼壁匯合度達到80％給細胞傳代。實施例2：本發(fā)明所述脂肪間充質(zhì)干細胞組合物脂肪間充質(zhì)干細胞濃度為1.5×106個/mL，透明質(zhì)酸或其藥用鹽體積百分比為8％，人血白蛋白(濃度為20％)體積百分比10％，胰島素生長因子體積百分比為8％，其余為生理鹽水。實施例3：本發(fā)明所述脂肪間充質(zhì)干細胞組合物脂肪間充質(zhì)干細胞濃度為2×106個/mL，透明質(zhì)酸或其藥用鹽體積百分比為5％，人血白蛋白(濃度為20％)體積百分比13％，胰島素生長因子體積百分比為10％，其余為生理鹽水。實施例4：本發(fā)明所述脂肪間充質(zhì)干細胞組合物脂肪間充質(zhì)干細胞濃度為1×106個/mL，透明質(zhì)酸或其藥用鹽體積百分比為10％，人血白蛋白(濃度為20％)體積百分比15％，胰島素生長因子體積百分比為5％，其余為生理鹽水。實施例5：治療兔骨關(guān)節(jié)炎的實驗1、兔骨關(guān)節(jié)炎造模選用健康成年新西蘭大耳白兔，體重5到8千克。將兔后左膝關(guān)節(jié)進行前交叉韌帶切斷術(shù)與內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)聯(lián)合造模，右膝作為對照側(cè)，手術(shù)4周后，病理評價骨關(guān)節(jié)炎造模效果。2、兔骨關(guān)節(jié)炎治療在評價造模成功后第4周，在超聲引導下使用注射器向患骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)處注射0.4mL組合物(實施例2組合物)，緩慢推注。3、治療效果評價在接受治療后第10周，進行檢測：(1)關(guān)節(jié)病理觀察關(guān)節(jié)去除遠端股骨和脛骨平臺后，用10％甲醛固定，樣本脫鈣后，石蠟包埋后切片，進行HE染色。結(jié)果如圖1-圖3所示，正常膝關(guān)節(jié)軟骨表層完好，軟骨細胞正常(圖1)；對照組未治療的膝關(guān)節(jié)軟骨表層明顯破壞，剝脫現(xiàn)象明顯，表層軟骨空泡樣變性，成熟軟骨細胞柱狀線消失，結(jié)構(gòu)破壞明顯(圖2)；經(jīng)細胞治療后的軟骨，破壞的軟骨表層恢復完好，軟骨正常未發(fā)生空泡樣變性，成熟軟骨細胞柱狀線恢復(圖3)。(2)Mankin評分關(guān)節(jié)去除遠端股骨和脛骨平臺后，用10％甲醛固定，樣本脫鈣后，石蠟包埋后切片，進行HE染色、甲苯胺藍和番紅O染色。采用Mankin評分法對關(guān)節(jié)進行評分，結(jié)果如表1所示。表1Mankin評分結(jié)果正常對照組治療組模型組0.31.55.5(3)ELISA法檢測TNF-α含量取關(guān)節(jié)液，采用ELISA法檢測TNF-α炎性因子表達，含量檢測如表2所示。表2ELISA法檢測TNF-α結(jié)果(單位：μg/ml)天數(shù)正常對照組治療組模型組第1天303030第20天30100100第40天3035105(4)軟骨總量變化將兔關(guān)節(jié)進行核磁共振成像MRI觀察，檢測關(guān)節(jié)恢復狀況及軟骨體積。治療10周后關(guān)節(jié)軟骨含量如表3所示。表3軟骨含量(單位：μg)正常對照組治療組模型組1094根據(jù)上述多項試驗結(jié)果可知，本發(fā)明組合物對骨關(guān)節(jié)炎具有顯著的療效。同樣，實施例3和4組合物進行上述試驗，與模型組相比，在各方面均得到顯著改善。實施例6：臨床療效對比試驗招募骨關(guān)節(jié)病志愿者125名，所有志愿者經(jīng)臨床診斷標準診斷為同等程度的疾病患者，隨機平均分成五組，實驗1-3組采用本發(fā)明實施例2-4組合物，對照1組采用專利CN105796600A實施例8的臍帶間充質(zhì)干細胞組合物，對照2組在對照1組基礎(chǔ)上采用脂肪間充質(zhì)干細胞，跟蹤6個月(2個月注射一次)，無效、有效以及復發(fā)判斷參照臨床標準，結(jié)果見表4。表4骨關(guān)節(jié)炎志愿者6個月后治療情況組別無效有效不復發(fā)有效復發(fā)實驗1組0/25，016/25，64％9/25，36％實驗2組0/25，015/25，60％10/25，40％實驗3組0/25，013/25，52％12/25，48％對照1組0/25，08/25，32％17/25，68％對照2組1/25，4％7/25，28％17/25，68％由表4可知，采用本發(fā)明組合物治療的志愿者均有效，有效不復發(fā)率在50％以上，遠高于兩組對照；而在有效不復發(fā)率上，本發(fā)明只有36％，另外兩組對照組的復發(fā)率均為68％，此外其中對照2組還有1例無效。以上所述只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想，應當指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利的保護范圍。當前第1頁1 2 3