本發(fā)明涉及藏紅花素的藥效作用，特別是對(duì)缺血再灌注引起的腦損傷和缺血性腦卒中的藥效保護(hù)作用。

背景技術(shù)：

腦卒中，又稱腦中風(fēng)或腦血管意外，主要分為缺血性腦卒中(腦梗塞、腦血栓形成)和出血性腦卒中(腦出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血)兩大類。其中，缺血性腦卒中約占全部腦卒中的70％-80％，具有極高的病死率和致殘率，對(duì)患者危害極大，往往造成不可逆的腦部損傷，給家庭和社會(huì)造成極大的負(fù)擔(dān)，且呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)。近年來(lái)，雖然在腦缺血發(fā)生機(jī)理及預(yù)防治療方面取得了許多的新成果，但其治療選擇仍非常有限，臨床治療藥物研發(fā)相對(duì)滯后。因此尋找新的防治缺血性腦卒中的藥物具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值和臨床意義。

近年研究發(fā)現(xiàn)腦缺血后有相當(dāng)部分的血管能夠自然再通或經(jīng)溶栓治療后血流恢復(fù)再通，但隨之而來(lái)的是出現(xiàn)再灌注損傷。腦缺血一定時(shí)間恢復(fù)血液供應(yīng)后，其功能不但未能恢復(fù)，卻出現(xiàn)更加嚴(yán)重的腦機(jī)能障礙。腦缺血再灌注損傷成為缺血性腦卒中的重要病理機(jī)制。

本發(fā)明中的藏紅花素來(lái)源于天然藥物藏紅花和梔子，是一種天然存在稀有的水溶性的類胡蘿卜素植物黃色素(圖1)。藥理研究表明藏紅花素具有保護(hù)心腦血管、清除自由基、改善記憶和學(xué)習(xí)能力、抗炎、抗腫瘤等多種藥理活性，又有很高安全性。依達(dá)拉奉，是第一個(gè)批準(zhǔn)用于臨床的自由基清除型腦保護(hù)劑，主要用于缺血性腦卒中的急性期伴神經(jīng)癥狀的治療。我們的研究發(fā)現(xiàn)藏紅花素在口服給藥時(shí)對(duì)缺血再灌注腦損傷的保護(hù)作用優(yōu)于陽(yáng)性藥依達(dá)拉奉，且明顯優(yōu)于靜注給藥組，有望通過(guò)進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)，用于預(yù)防和治療臨床缺血再灌注所引起的腦損傷和缺血性腦卒中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明人通過(guò)對(duì)sd大鼠建立短暫性大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(mcao)模型，以臨床一線藥物依達(dá)拉奉注射液為陽(yáng)性藥，評(píng)價(jià)了藏紅花素口服和靜注給藥的腦保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)灌胃給予藏紅花素能顯著減小mcao所致的腦組織梗死，減輕神經(jīng)功能障礙，減少腦組織mda含量，提高腦組織總抗氧化能力。同時(shí)，代謝組學(xué)研究表明灌胃給予藏紅花素后對(duì)腦組織內(nèi)源性物質(zhì)整體代謝的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于陽(yáng)性藥依達(dá)拉奉，更趨向于假手術(shù)組。提示藏紅花素具有保護(hù)缺血再灌注腦損傷的作用，有望經(jīng)過(guò)研究用于臨床缺血性腦卒中治療。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明提供了藏紅花素在制備缺血性腦損傷藥物中的應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)證明藏紅花素口服給藥具有更好的腦保護(hù)作用，為制備治療和預(yù)防缺血性腦卒中藥物提供了更多的選擇。

附圖說(shuō)明

附圖1藏紅花素結(jié)構(gòu)式。

附圖2腦組織梗塞體積和行為評(píng)分統(tǒng)計(jì)

a：ttc染色觀察腦梗死面積，其中白色為梗死區(qū)域；

b：各組梗死體積百分率統(tǒng)計(jì)圖；

c：各組神經(jīng)行為評(píng)分統(tǒng)計(jì)圖。其中，sham表示假手術(shù)組，model表示模型組，edarav.為陽(yáng)性藥依達(dá)拉奉組，crocin-i.v為藏紅花素靜注給藥組，crocin-i.g為藏紅花素灌胃給藥組，*p＜0.05，**p＜0.01vsmodel。

附圖3腦組織自由基與抗氧化參數(shù)

a：腦組織丙二醛含量；

b：腦組織總抗氧化能力。#p＜0.05，##p＜0.01vssham；*p＜0.05，**p＜0.01vsmodel。

附圖4腦組織代謝組學(xué)分析pls-da散點(diǎn)圖。

其中，s為假手術(shù)組，m為模型組，e為陽(yáng)性藥依達(dá)拉奉組，v為藏紅花素靜注給藥組，g為藏紅花素灌胃給藥組。

附圖5各組對(duì)比分析

a：假手術(shù)組和模型組opls-da分析圖；

b：假手術(shù)組和模型組s-plot圖；

c：模型組和藏紅花素灌胃給藥組opls-da分析圖；

d：模型組和藏紅花素灌胃給藥組s-plot圖。

其中，s為假手術(shù)組，m為模型組，g為藏紅花素灌胃給藥組。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明通過(guò)下面的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的解釋，但并不意味著本發(fā)明僅限于此。

實(shí)施例1藏紅花素對(duì)腦梗塞體積和行為學(xué)改善作用

采用sd大鼠(50只，雄性，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體重240±20g)進(jìn)行試驗(yàn)。在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)環(huán)境下(自由飲食與飲水，晝夜交替，各12小時(shí))，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。隨后，隨機(jī)分為5組，即假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性藥組、藏紅花素靜注給藥組和藏紅花素灌胃給藥組。所有大鼠實(shí)驗(yàn)前均禁食12h以上，可自由飲水。

動(dòng)物模型的建立：10％水合氯醛(1ml/300g)腹腔注射麻醉動(dòng)物后，參照改良的zealonga線栓法建立大腦中動(dòng)脈阻塞模型。假手術(shù)組不插入線栓，其余操作同模型組。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分組如下：假手術(shù)組和模型組(再灌注時(shí)給予等量生理鹽水)、陽(yáng)性藥組(復(fù)方依達(dá)拉奉注射液，先聲藥業(yè)，再灌注時(shí)給予3mg/kg)、藏紅花素靜注給藥組(再灌注時(shí)給予1mg/kg)、藏紅花素灌胃給藥組(缺血后給予58.6mg/kg，并于實(shí)驗(yàn)前預(yù)給藥3天)，每組6只。大鼠腦缺血2h，再灌注22h后，參考zea-longa的5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分(具體如下：0分：行為正常；1分：對(duì)側(cè)前肢不能完全伸展；2分：向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向左側(cè)傾倒及不能站立；4分：不能行走，意識(shí)不清)，隨后用水合氯醛麻醉，生理鹽水心臟灌流后取腦組織，沿冠狀面切成厚度基本相同的6片，2％ttc(2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride，sigma)于37℃避光染色15min，用掃描儀掃描并使用imageproplus6.0圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)梗死體積。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中剔除死亡及沒(méi)有明顯行為學(xué)變化的大鼠。

對(duì)大鼠腦梗塞體積和行為的影響：結(jié)果表明，假手術(shù)組腦組織未見(jiàn)梗塞，模型組經(jīng)腦水腫矯正后梗塞體積百分率為45.6±13.1％。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組可顯著縮小腦組織梗塞體積，藏紅花素靜注給藥組也可明顯縮小腦組織梗塞體積，但個(gè)體差異較大。藏紅花素灌胃給藥組與模型組比較，腦梗塞體積顯著降低(p＜0.01)(圖2a和2b)。行為學(xué)評(píng)分結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠均無(wú)異常癥狀，行為評(píng)分為0；模型組動(dòng)物出現(xiàn)對(duì)側(cè)前肢不能完全伸展，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈或向?qū)?cè)傾倒等運(yùn)動(dòng)功能障礙，其行為學(xué)評(píng)分為2.3±0.5分。陽(yáng)性藥組與模型組相比可顯著降低行為學(xué)評(píng)分(p＝0.015)，藏紅花素靜注給藥組與模型組相比無(wú)顯著差異(p＝0.122)，藏紅花素灌胃給藥組與模型組相比行為學(xué)評(píng)分顯著改善(p＝0.001)(圖2c)。結(jié)果顯示藏紅花素灌胃給藥對(duì)缺血再灌注腦損傷的保護(hù)作用優(yōu)于陽(yáng)性藥依達(dá)拉奉，且明顯優(yōu)于靜注給藥組。

實(shí)施例2藏紅花素對(duì)腦組織丙二醛含量和總抗氧化能力的影響

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型的建立和分組同實(shí)施例1，大鼠腦缺血2h，再灌注22h后，水合氯醛麻醉，生理鹽水心臟灌流后取腦組織，按質(zhì)量與體積比加入9倍的pbs制成10％的腦勻漿液，按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)腦組織丙二醛(mda)含量和總抗氧化能力(試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司)。

mda檢測(cè)結(jié)果表明，模型組mda含量與假手術(shù)組相比有明顯差異(p＝0.025)。與模型組相比，陽(yáng)性藥組可顯著降低mda水平(p＝0.029)，藏紅花素靜注給藥組無(wú)顯著差異(p＝0.070)，藏紅花素灌胃給藥組mda水平顯著降低(p＝0.007)(圖3a)?？偪寡趸芰z測(cè)結(jié)果表明，模型組總抗氧化能力與假手術(shù)組相比明顯降低(p＝0.001)。與模型組相比，陽(yáng)性藥組可顯著提高總抗氧化水平(p＝0.018)，藏紅花素靜注給藥組無(wú)顯著差異(p＝0.163)，藏紅花素灌胃給藥組總抗氧化水平顯著提高(p＝0.016)(圖3b)。結(jié)果顯示藏紅花素灌胃給藥后可發(fā)揮與陽(yáng)性藥依達(dá)拉奉相似的作用，降低腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化水平，并提高總抗氧化能力，而藏紅花素靜注給藥后并無(wú)此作用。

實(shí)施例3藏紅花素給藥后腦組織代謝組學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型的建立和分組同實(shí)施例1，大鼠腦缺血2h，再灌注22h后，水合氯醛麻醉，生理鹽水心臟灌流后取腦組織，稱取腦組織20mg加入含有內(nèi)標(biāo)1，2-¹³c2-肉寇酸的80％甲醇溶液(2.5μg/ml)800μl勻漿，4℃冰箱靜置1h，20000×g、4℃離心10min。取上清液200μl于gc進(jìn)樣瓶中，減壓揮干，再加入甲氧胺呲啶溶液(10mg/ml)30μl，渦旋振蕩3min，室溫靜置16h進(jìn)行肟化。然后加入衍生化試劑mstfa(含1％tmcs)30μl，渦旋振蕩3min，室溫靜置1h進(jìn)行硅烷化，最后再加入外標(biāo)甲基肉寇酸酯庚烷溶液(15μg/ml)30μl，混勻后采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(shimadzugc/msqp2010ultra/se，kyoto，日本)對(duì)腦組織內(nèi)源性分子進(jìn)行測(cè)定(方法參照jiyea，etal，analchem.2005，77，8086-8094)，采用simca-p13.0(umetrics，瑞典)對(duì)5組多變量數(shù)據(jù)進(jìn)行偏最小二乘法-判別分析(pls-da)分析。對(duì)假手術(shù)組和模型組、模型組和藏紅花素灌胃給藥組分別進(jìn)行正交-偏最小二乘法判別分析(opls-da)，采用t檢驗(yàn)對(duì)鑒定出的化合物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)(p＜0.05，有顯著性差異)，確定組間有明顯差異的化合物。

對(duì)大鼠缺血2h再灌注22h后腦組織代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行pls-da分析顯示：模型組與假手術(shù)組有明顯差異，從空間位置看，陽(yáng)性藥組位于模型組與假手術(shù)組之間，提示陽(yáng)性藥依達(dá)拉奉對(duì)缺血再灌注造成的腦損傷有保護(hù)作用。此外，藏紅花素灌胃給藥組更靠近假手術(shù)組，而藏紅花素靜注給藥組更靠近模型組，提示藏紅花素灌胃給藥后對(duì)腦組織內(nèi)源性小分子物質(zhì)的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于依達(dá)拉奉，而藏紅花素靜注給藥后的這種調(diào)節(jié)作用較弱(圖4)。

采用opls-da結(jié)合s-plot方法分析和鑒定缺血再灌注模型和藏紅花素灌胃給藥后對(duì)腦組織中分子的影響(圖5)。造模及灌胃給予藏紅花素對(duì)腦組織部分物質(zhì)均產(chǎn)生顯著影響(表1)。模型組腦組織中tca中間產(chǎn)物(α-酮戊二酸和延胡索酸)水平降低，丙酮酸含量明顯下降，且乳酸水平升高，提示缺血再灌注后由于線粒體損傷導(dǎo)致有氧呼吸減弱，無(wú)氧呼吸加強(qiáng)生成了大量乳酸。此外，葡萄糖，葡萄糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸和核糖-5-磷酸水平都明顯上升，提示磷酸戊糖通路增強(qiáng)。支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)和酪氨酸、色氨酸、蘇氨酸等氨基酸水平明顯上升，且3-羥基異丁酸含量上升，提示由氨基酸能量動(dòng)員和糖異生加強(qiáng)。脂肪酸(亞油酸、油酸、棕櫚酸)含量上升，同時(shí)3-羥基丁酸含量上升，提示腦組織在缺血之后攝取酮體供能加強(qiáng)。此外，n-乙酰天冬氨酸作為神經(jīng)元損傷程度的指標(biāo)，在模型組含量顯著下降，與模型組腦組織出現(xiàn)大面積梗死相一致。多元醇通路活性增強(qiáng)，山梨醇和果糖堆積，造成細(xì)胞水腫，并干擾肌醇代謝，導(dǎo)致肌醇攝取減少。

灌胃給予藏紅花素，對(duì)腦組織tca循環(huán)物質(zhì)，氨基酸及脂肪酸代謝等產(chǎn)生明顯調(diào)節(jié)作用，且n-乙酰天冬氨酸水平與模型組相比明顯上升，與灌胃給藥后顯著改善腦組織梗死相一致。

表1差異化合物列表

說(shuō)明：↑↑↑，表示含量上升，p＜0.001；↑↑，表示含量上升，p＜0.01；↑，表示含量上升，p＜0.05；↓↓↓，表示含量下降，p＜0.001；↓↓，表示含量下降，p＜0.01；↓，表示含量下降，p＜0.05；0.8表示肌醇含量變化倍數(shù)(模型組與假手術(shù)組相比)，但無(wú)顯著性差異。