本發(fā)明屬于腦癱疾病研究領(lǐng)域，具體是涉及一種鞘內(nèi)注射膽紅素致獼猴腦癱的動物模型建立方法。

背景技術(shù)：

腦性癱瘓(cerebral palsy,CP)簡稱腦癱，是一組持續(xù)存在的中樞性運動和姿勢發(fā)育障礙、活動受限癥候群，這種癥候群是由于發(fā)育中的胎兒或嬰幼兒腦部非進行性損傷所致。腦性癱瘓的運動障礙常伴有感覺、知覺、認(rèn)知、交流和行為障礙，以及癲癇和繼發(fā)性肌肉、骨骼問題。腦癱研究的重要性在于：腦癱是導(dǎo)致兒童時期最主要的運動殘性疾病，嚴(yán)重影響患兒生活、就業(yè)和參與社會活動的能力，應(yīng)該引起社會各界的高度重視。

動物模型是研究重大疾病發(fā)病機制、治療手段的關(guān)鍵技術(shù)和平臺。目前國內(nèi)外關(guān)于腦癱的常用動物模型有鼠、兔、豬和獼猴等動物。常用方法是缺血缺氧、宮內(nèi)感染和膽紅素神經(jīng)毒等?？赡苡捎谀X癱動物模型實驗較少，關(guān)鍵技術(shù)不夠成熟，這些動物模型很少出現(xiàn)腦性癱瘓典型的肢體運動障礙和姿勢異常等癥狀，主要是依靠神經(jīng)行為和病理學(xué)改變來評估模型的建立。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種鞘內(nèi)注射膽紅素致獼猴腦癱的動物模型建立方法，實驗表明通過該方法獼猴腦癱動物模型建立成功，獼猴出現(xiàn)了典型的腦癱癥狀。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

鞘內(nèi)注射膽紅素致獼猴腦癱的動物模型建立方法，包括選擇2月齡、體重在800～900g的健康獼猴進行鞘內(nèi)注射膽紅素溶液，所述注射是在暗室條件下進行，所述膽紅素溶液注射量按獼猴每克體重注射9～11ug進行，注射速度保持在0.8～1.2ul/min；所述注射過程進行3次，每次間隔時間為24小時。

進一步的，所述膽紅素溶液的配置過程為：在暗室條件下，將膽紅素晶體溶解于0.5M的NaOH溶液中并用ddH₂O稀釋至膽紅素含量為10毫克/毫升，之后用0.5M鹽酸調(diào)整溶液PH值為8.5，并將溶液置于-20℃中儲存8～12小時。

進一步的，所述膽紅素溶液注射量按獼猴每克體重注射10ug進行，注射速度保持在1ul/min。

進一步的，所述注射用的注射器密封包裝。

優(yōu)選的，所述注射器外側(cè)包裹有用于遮光避光的錫箔紙。

本發(fā)明的有益效果在于：

(1)本發(fā)明所選的獼猴基因與人類基因相似度約為97.5％，在核酸水平其基因相似度大于93％。獼猴在解剖、基因、生理和行為等方面與人類高度相似，是一個最理想的疾病動物模型。本發(fā)明嚴(yán)格在暗室中進行操作這點非常重要，可以確保膽紅素的穩(wěn)定性，進而確保注射后的膽紅素在獼猴體內(nèi)產(chǎn)生有效作用。另外本發(fā)明中注射速度可以使得膽紅素可以充分融合以及沉積在獼猴腦室周圍，最終產(chǎn)生膽紅素腦病直接引起基底節(jié)損傷而致不隨意運動型腦癱病。另外本發(fā)明中膽紅素溶液的注射量要嚴(yán)格控制，如果注射量小，膽紅素達不到引起基底節(jié)損傷的作用，如果注射量大又會引起獼猴的不良生理反應(yīng)，本發(fā)明注射量適當(dāng)且不會引起獼猴損傷，另外通過手術(shù)后獼猴均表現(xiàn)出明顯的腦癱癥狀，比如運動障礙、姿勢異常、肌張力異常、不隨意運動明顯。即本發(fā)明所獲得的獼猴腦癱模型建立成功。

(2)本發(fā)明提供了所述膽紅素溶液的配置方法，需要指出的是所述膽紅素溶液是在暗室中進行配置的，我們認(rèn)為膽紅素腦病是腦癱的單因素病因，所以如何獲得穩(wěn)定性好的膽紅素溶液對整個模型的建立至關(guān)重要，而暗室操作的作用就在于可以確保膽紅素溶液中膽紅素的穩(wěn)定性，防止其發(fā)生分解。

另外，膽紅素溶液的配置是先以NaOH溶液溶解，之后再用鹽酸去中和PH，這個過程是很短暫的，用鹽酸中和的同時，就是防止被氧化，另外，我們對于溶液經(jīng)過-20℃的儲存，也是要使溶液中的膽紅素穩(wěn)定。

(3)本發(fā)明注射器外側(cè)包裹錫箔紙，所述錫箔紙對注射器內(nèi)的膽紅素溶液具有遮光避光的作用，確保膽紅素溶液中膽紅素處于穩(wěn)定有效的狀態(tài)。

附圖說明

圖1為試驗用獼猴在膽紅素注射前的MRI(磁共振成像)平掃圖。

圖2為試驗用獼猴在膽紅素注射后40天MRI(磁共振成像)平掃圖，可見膽紅素沉積在基底節(jié)區(qū)。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明技術(shù)方案做出更為具體的說明：

實施例所用動物由安徽省盛鵬實驗動物科技有限公司提供，動物許可證SYXK(皖)2013-003。下述注射前準(zhǔn)備以及注射過程的操作均為常規(guī)醫(yī)療操作手段。

實施例1

1.1實驗材料及動物分組

選擇2月齡健康獼猴，雌雄不限；體重質(zhì)量800g，飼養(yǎng)條件為室溫(23±2)℃，光照控制12h(7：00am至7：00pm)，自由飲食水。

膽紅素來自Sigma-Aldrich,USA，膽紅素溶液的配比為：取膽紅素晶體100mg溶解于0.5M NaOH溶液中并用ddH2O中稀釋為膽紅素含量為10毫克/毫升的濃度，再用0.5M鹽酸將PH值調(diào)整為8.5，并將溶液儲存于-20℃冰箱中儲存8小時。

實驗分2組：膽紅素注射組(n＝3)；不進行膽紅素溶液注射的對照組(n＝2)。本實驗研究符合動物保護委員會標(biāo)準(zhǔn)要求，實驗中盡可能減少使用動物的數(shù)量和減輕動物的痛苦。

1.2注射前準(zhǔn)備

檢測獼猴肢體神經(jīng)功能，排除肢體神經(jīng)功能障礙；采用復(fù)合麻:1ml鹽酸氯胺酮+1ml安定+東莨菪堿0.5ml肌肉注射，待動物安靜后，經(jīng)9.4T超高場大口徑動物核磁共振成像系統(tǒng)平掃，排除獼猴腦部占位性病變以及出血性疾病。

獼猴在注射前24h禁食，8h禁水，行氣管插管后誘導(dǎo)麻醉和機械通氣，并監(jiān)測動脈血壓，心率，監(jiān)測評估麻醉的程度。

1.3注射過程：準(zhǔn)備消毒器械及穿刺包，將獼猴側(cè)臥于手術(shù)臺上，背部與床面垂直，將獼猴頭部向前胸部屈曲，使其軀干呈弓形，脊柱盡量后凸以增寬椎間隙。以獼猴髂嵴連線與后背正中線的交點處向下2個椎間盤間隙為穿刺點，常規(guī)消毒皮膚后，戴無菌手套，覆蓋消毒洞巾，用2％利多卡因局部逐層浸潤麻醉。左手固定局部皮膚，右手持穿刺針以垂直背部的方向緩慢刺人，針尖可稍傾向頭部方向，當(dāng)感覺兩次突破感后可將針芯慢慢抽出，即可見腦脊液流出，進針深度0.8cm。接上膽紅素溶液，注射器外用錫箔紙包裹，以9ug/g的量注射，注射速度保持在0.8ul/min。

1.4腦損傷后記錄

注射后每天監(jiān)測兩組動物神經(jīng)功能變化，逐項對實驗組及對照組動物是否出現(xiàn)運動障礙，進行肌張力、不隨意運動、姿勢異常的測試，并獲得神經(jīng)行為學(xué)檢測的評分。

實施例2

2.1實驗材料及動物分組

選擇2月齡健康獼猴，雌雄不限；體重質(zhì)量900g，飼養(yǎng)條件為室溫(23±2)℃，光照控制12h(7：00am至7：00pm)，自由飲食水。

膽紅素來自Sigma-Aldrich,USA，膽紅素溶液的配比為：取膽紅素晶體100mg溶解于0.5M NaOH溶液中并用ddH2O中稀釋為膽紅素含量為10毫克/毫升的濃度，再用0.5M鹽酸將PH值調(diào)整為8.5，并將溶液儲存于-20℃冰箱中儲存12小時。

實驗分2組：膽紅素注射組(n＝3)；對照組(n＝2)。本實驗研究符合動物保護委員會標(biāo)準(zhǔn)要求，實驗中盡可能減少使用動物的數(shù)量和減輕動物的痛苦。

2.2注射前準(zhǔn)備

檢測獼猴肢體神經(jīng)功能，排除肢體神經(jīng)功能障礙；采用復(fù)合麻:1ml鹽酸氯胺酮+1ml安定+東莨菪堿0.5ml肌肉注射，待動物安靜后，經(jīng)9.4T超高場大口徑動物核磁共振成像系統(tǒng)平掃，排除獼猴腦部占位性病變以及出血性疾病。

獼猴在注射注射前24h禁食，8h禁水，行氣管插管后誘導(dǎo)麻醉和機械通氣，并監(jiān)測動脈血壓，心率，監(jiān)測評估麻醉的程度。

2.3注射過程：準(zhǔn)備消毒器械及穿刺包，將獼猴側(cè)臥于手術(shù)臺上，背部與床面垂直，將獼猴頭部向前胸部屈曲，使其軀干呈弓形，脊柱盡量后凸以增寬椎間隙。以獼猴髂嵴連線與后背正中線的交點處向下2個椎間盤間隙為穿刺點，常規(guī)消毒皮膚后，戴無菌手套，覆蓋消毒洞巾，用2％利多卡因局部逐層浸潤麻醉。左手固定局部皮膚，右手持穿刺針以垂直背部的方向緩慢刺人，針尖可稍傾向頭部方向，當(dāng)感覺兩次突破感后可將針芯慢慢抽出，即可見腦脊液流出，進針深度0.5cm。接上膽紅素溶液，注射器外用錫箔紙包裹，以11ug/g的量注射，注射速度保持在1.2ul/min。

2.4腦損傷后記錄

注射后每天監(jiān)測兩組動物神經(jīng)功能變化，逐項對實驗組及對照組動物進行運動障礙、肌張力、不隨意運動、姿勢異常、拒俘反應(yīng)的測試，并獲得神經(jīng)行為學(xué)檢測的評分。

實施例3

3.1實驗材料及動物分組

選擇2月齡健康獼猴，雌雄不限；體重質(zhì)量850g，飼養(yǎng)條件為室溫(23±2)℃，光照控制12h(7：00am至7：00pm)，自由飲食水。

膽紅素來自Sigma-Aldrich,USA，膽紅素溶液的配比為：取膽紅素晶體100mg溶解于0.5M NaOH溶液中并用ddH2O中稀釋為膽紅素含量為10毫克/毫升的濃度，再用0.5M鹽酸將PH值調(diào)整為8.5，并將溶液儲存于-20℃冰箱中儲存10小時。

實驗分2組：膽紅素注射組(n＝3)；對照組(n＝2)。本實驗研究符合動物保護委員會標(biāo)準(zhǔn)要求，實驗中盡可能減少使用動物的數(shù)量和減輕動物的痛苦。

3.2注射前準(zhǔn)備

檢測獼猴肢體神經(jīng)功能，排除肢體神經(jīng)功能障礙；采用復(fù)合麻:1ml鹽酸氯胺酮+1ml安定+東莨菪堿0.5ml肌肉注射，待動物安靜后，經(jīng)9.4T超高場大口徑動物核磁共振成像系統(tǒng)平掃，排除獼猴腦部占位性病變以及出血性疾病。

獼猴在注射前24h禁食，8h禁水，行氣管插管后誘導(dǎo)麻醉和機械通氣，并監(jiān)測動脈血壓，心率，監(jiān)測評估麻醉的程度。

3.3注射過程：準(zhǔn)備消毒器械及穿刺包，將獼猴側(cè)臥于手術(shù)臺上，背部與床面垂直，將獼猴頭部向前胸部屈曲，使其軀干呈弓形，脊柱盡量后凸以增寬椎間隙。以獼猴髂嵴連線與后背正中線的交點處向下2個椎間盤間隙為穿刺點，常規(guī)消毒皮膚后，戴無菌手套，覆蓋消毒洞巾，用2％利多卡因局部逐層浸潤麻醉。左手固定局部皮膚，右手持穿刺針以垂直背部的方向緩慢刺人，針尖可稍傾向頭部方向，當(dāng)感覺兩次突破感后可將針芯慢慢抽出，即可見腦脊液流出，進針深度0.7cm。接上膽紅素溶液，注射器外用錫箔紙包裹，以10ug/g的量注射，注射速度保持在1ul/min。

3.4腦損傷后記錄

注射后每天監(jiān)測兩組動物神經(jīng)功能變化，逐項對實驗組及對照組動物進行運動障礙、肌張力、不隨意運動、姿勢異常測試，并獲得神經(jīng)行為學(xué)檢測的評分。

所述神經(jīng)行為學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)如下：

(1)運動障礙檢測標(biāo)準(zhǔn)以及評價標(biāo)準(zhǔn)

①攝像觀察實驗獼猴行走、攀爬、跳躍等大運動有無障礙；

②應(yīng)用手拿東西吃，以及應(yīng)用手剝香蕉皮、剝花生時有無障礙；

③兩側(cè)肢體有無運動不對稱現(xiàn)象。

(2)肌張力檢測標(biāo)準(zhǔn)以及評價標(biāo)準(zhǔn)

①0級：無肌張力增高，獼猴活動自如；

②1-級：肌張力稍增高，被動活動時患肢在整個范圍內(nèi)無阻力；

③1+級：肌張力稍增高，被動活動時患肢在前1/2ROM中有輕微的卡住感覺，后1/2ROM中有輕微阻力；

④2級：肌張力輕度增高，被動活動時患肢在大部分ROM內(nèi)均有阻力，但仍可活動；

⑤3級：肌張力中度增高，被動活動時患肢在整個ROM內(nèi)均有阻力，活動比較困難；

⑥4級：肌張力高度增加，患肢肢體僵硬，阻力很大，被動活動十分困難。

異常判定標(biāo)準(zhǔn)：具備上述②-⑥任何一項即表現(xiàn)為異常。評分標(biāo)準(zhǔn)：正常者滿分為l0分，出現(xiàn)上述改變②扣除1分，出現(xiàn)上述改變③扣除2分，出現(xiàn)上述改變④扣除3分，出現(xiàn)上述改變⑤扣除4分，出現(xiàn)上述改變⑥扣除5分。

(3)不隨意運動檢測標(biāo)準(zhǔn)以及評價標(biāo)準(zhǔn)

①震顫；②舞動；③抽搐；④徐動；⑧痙攣扭動。

異常判定標(biāo)準(zhǔn)：具備上述任何一項即表現(xiàn)為異常。評分標(biāo)準(zhǔn)：正常者滿分為l0分，出現(xiàn)上述任何一項表現(xiàn)扣除2分。

(4)姿勢異常檢測標(biāo)準(zhǔn)以及評價標(biāo)準(zhǔn)

①主要以四肢支持體重；②主要以三肢支持體重；③主要以雙肢支持體重；④不能站立。

異常判定標(biāo)準(zhǔn)：具備上述任何一項即表現(xiàn)為異常。評分標(biāo)準(zhǔn)：正常者滿分為10分，出現(xiàn)上述改變①扣除2分；出現(xiàn)上述改變②扣除3分，出現(xiàn)上述改變③扣除5分，出現(xiàn)上述改變④扣7分。

本發(fā)明中的獼猴腦癱模型建立符合要求，獼猴在注射膽紅素后，癥狀在1個月后慢慢出現(xiàn)并加重，如圖2中的試驗用獼猴在膽紅素注射后40天MRI(磁共振成像)平掃圖，可見膽紅素沉積在基底節(jié)區(qū)，獼猴的神經(jīng)行為學(xué)檢測也呈現(xiàn)出腦癱癥狀。