本發(fā)明涉及一種放射性標(biāo)記物的制備方法，特別涉及一種RGD靶向樹狀納米粒標(biāo)記物的制備方法。

背景技術(shù)：

近年來癌癥（Cancer）已成為一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)問題和公眾關(guān)心的健康焦點(diǎn)?！?012中國腫瘤登記年報(bào)》顯示，我國近20年來癌癥呈現(xiàn)年輕化及發(fā)病率和死亡率“三線”走高的趨勢(shì)。全國腫瘤死亡率為180.54/10萬，每年因癌癥死亡病例達(dá)270萬例。包括乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌等發(fā)病年齡均低于此前年齡。目前，新型腫瘤分子探針已成為診斷及治療腫瘤的重要工具。各類腫瘤分子探針介導(dǎo)的靶向診斷與治療，已成為分子影像研究中的熱點(diǎn)。

在以往的研究中，以放射性標(biāo)記分子探針為代表的放射性分子靶向治療一直是腫瘤治療的研究方向之一。而在目前投放在臨床的放射性藥物中主要以^99mTc-MDP、^99mTc-MIBI、¹⁸F-FDG、 ¹⁸F-Fallypride、 ¹¹C-蛋氨酸、¹¹C-膽堿、¹¹C-乙酸鹽等SPECT/PET顯像藥物為主。各種各樣的腫瘤分子探針也正在研究階段，有待進(jìn)一步開發(fā)完善。但在目前來說，放射性的藥物探針有待解決及提高的主要有以下這三個(gè)問題：第一，穩(wěn)定性難以持續(xù)；第二，特異性靶向不高；第三，顯像和治療不能同時(shí)兼顧。

迄今，納米粒子作為載體運(yùn)載和遞送的物質(zhì)已經(jīng)涉及核酸、多肽、蛋白質(zhì)、放射性核素、化療藥物、光敏性分子、熒光探針分子等眾多種類，在疾病的早期檢測(cè)與診斷和治療方面展示出巨大的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前正在研究的應(yīng)用于分子診斷的納米探針包括金納米顆粒、量子點(diǎn)、磁性納米顆粒、樹狀納米粒、DNA納米機(jī)器、發(fā)射近紅外的聚合體和納米生物傳感器等。這些探針主要集中在腫瘤的顯像診斷和放射治療方面。樹狀納米?？捎糜谒幬镙斔?，檢測(cè)癌細(xì)胞凋亡，靶向用藥和腫瘤成像。這類形狀、大小完全可控的單擴(kuò)散性的聚合物納米粒子的經(jīng)典代表是聚酰胺-胺(PAMAM)。PAPAM 分子表面存在大量的氨基，可以很容易的和各種化合物反應(yīng)連接，如靶向分子、藥物分子等。PAMAM 內(nèi)部還含有大量的疏水空腔，可以通過非共價(jià)作用包裹疏水的藥物分子。PAMAM 的分子量較大，不會(huì)像小分子一樣很快通過腎代謝掉，可以在血液中停留較長(zhǎng)的時(shí)間，增加各器官的吸收。由于PAMAM表面具有大量的活性基團(tuán)，可以通過雙功能螯合劑連接多個(gè)放射性核素和靶向分子，因此在低濃度條件下可形成對(duì)比度很高的診斷影像。近來，PAMAM在腫瘤診斷和治療中的應(yīng)用研究吸引了越來越多的研究者的關(guān)注，目前這個(gè)方向已經(jīng)發(fā)展成為納米醫(yī)藥，是藥物運(yùn)輸系統(tǒng)以及制藥科學(xué)中的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

在目前的以RGD為靶向的納米分子藥物當(dāng)中，RGD要與納米分子結(jié)合所必須要通過一個(gè)“橋梁”，如NHS-PEG-MAL、HYNIC（hydrazinonicotinic acid, 肼基煙酸）等雙功能螯合劑。RGD只是作為一個(gè)靶向分子，當(dāng)它需要與納米粒相連前，大多數(shù)需要進(jìn)行硫醇化才能與所謂的“橋梁”連接，從而連接到納米粒上，不僅增加了反應(yīng)步驟，還降低藥物合成的穩(wěn)定性。再者，目前合成的靶向納米粒要不大多只有單一的顯像功能（如¹⁸F、^99mTc、Cy5.5等），要不就只是通過載藥（DOX、PTX等）進(jìn)行腫瘤靶向治療，同時(shí)具有兩種功能的納米粒研究較少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種RGD靶向樹狀納米粒標(biāo)記物的制備方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種RGD靶向樹狀納米粒的制備方法，包括如下步驟：

將RGDyC和雙功能PEG與溶劑中混合，通過點(diǎn)擊反應(yīng)生成NHS-PEG-RGDyC，其中雙功能PEG中乙二醇單元數(shù)n為40～120之間的整數(shù)；

將NHS-PEG-RGDyC、PAMAM納米?；旌希筃HS-PEG-RGDyC與PAMAM納米粒上的胺基反應(yīng)共價(jià)連接，得到PAMAM-PEG-RGDyC。

作為上述制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)，RGDyC與雙功能PEG反應(yīng)的pH為5～7。更佳的，RGDyC與雙功能PEG反應(yīng)的pH為6。

作為上述制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)，RGDyC與雙功能PEG反應(yīng)的溶液為NaAc-HAc溶液。

作為上述制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)，NHS-PEG-RGDyC和PAMAM納米粒反應(yīng)的pH為8～10。

作為上述制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)，NHS-PEG-RGDyC和PAMAM納米粒反應(yīng)的溶液為硼砂-NaOH溶液。

作為上述制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)，NHS-PEG-RGDyC和PAMAM納米粒反應(yīng)的時(shí)間為8～14 h。

一種RGD靶向樹狀納米粒標(biāo)記物，由上述制備方法制備得到的PAMAM-PEG-RGDyC與放射性核素鹽反應(yīng)得到。

作為上述RGD靶向樹狀納米粒標(biāo)記物的進(jìn)一步改進(jìn)，放射性核素鹽為NaI或KI，PAMAM-PEG-RGDyC與NaI或KI通過氯胺-T法將放射性核素共價(jià)連接在PAMAM-PEG-RGDyC上。特別的，I為¹³¹I。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明方法反應(yīng)過程更加高效，反應(yīng)時(shí)間更短，操作簡(jiǎn)便，標(biāo)記率、產(chǎn)物純度更高。

本發(fā)明方法制備得到的RGD靶向樹狀納米粒標(biāo)記物，可作為SPECT分子探針，該方法為臨床SPECT分子探針的合成提供了新的思路。

本發(fā)明方法制備得到的RGD靶向樹狀納米粒標(biāo)記物還可以攜帶有效量的藥物分子，可達(dá)到對(duì)腫瘤的特異顯像以及靶向治療的目的，使惡性腫瘤的治療過程有可能處于一種“可視化”狀態(tài)。

發(fā)明人根據(jù)所需要的功能，進(jìn)而有目的性地設(shè)計(jì)RGD的序列——RGDyC，其中的半胱氨酸（C）帶有巰基（-SH）基團(tuán)——能與PEG進(jìn)行快速點(diǎn)擊反應(yīng)；另外當(dāng)中的酪氨酸是¹³¹I標(biāo)記的重要條件?？偟膩碚f，本發(fā)明中的RGDyC具有3個(gè)重要的作用，充分利用了RGDyC的功能。合成的RGD靶向納米粒通過一步¹³¹I放射性核素標(biāo)記，達(dá)到了雙重效果——不僅具有靶向顯像的作用，也可進(jìn)行放射性的治療。

附圖說明

圖1是標(biāo)記前體PAMAM-PEG-RGDyC的¹H NMR結(jié)果圖；

圖2是合成產(chǎn)物PAMAM-RGDyC-¹³¹I的Radio-TLC圖，其中在比移值Rf為0的位置的峰為合成的產(chǎn)物峰，在Rf為0.9～1的位置的峰為游離¹³¹I^-的峰；

圖3是PAMAM-PEG-RGDyC-¹³¹I的體外穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果；

圖4是PAMAM-PEG-RGDyC-131I在正常小鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布；

圖5是荷A549人肺腺癌裸鼠注射PAMAM-RGDyC-131I后SPECT顯像情況；

圖6是PAMAM-RGDyC-131I的對(duì)A549細(xì)胞的毒性作用；

圖7是PAMAM-RGDyC-131I的細(xì)胞攝取情況；

圖8 是PAMAM-RGDyC-131I的細(xì)胞洗脫情況；

圖9是PAMAM-RGDyC-131I的對(duì)荷A549人肺腺癌裸鼠腫瘤體積的影響。

具體實(shí)施方式

一種RGD靶向樹狀納米粒的制備方法，包括如下步驟：

將RGDyC和雙功能PEG與溶劑中混合，通過點(diǎn)擊反應(yīng)生成NHS-PEG-RGDyC，其中雙功能PEG中乙二醇單元數(shù)n為40～120之間的整數(shù)；

將NHS-PEG-RGDyC、PAMAM納米?；旌希筃HS-PEG-RGDyC與PAMAM納米粒上的胺基反應(yīng)共價(jià)連接，得到PAMAM-PEG-RGDyC。

制備得到的PAMAM-PEG-RGDyC可進(jìn)一步負(fù)載藥物分子或標(biāo)識(shí)物。

作為上述制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)，RGDyC與雙功能PEG反應(yīng)的pH為5～7。更佳的，RGDyC與雙功能PEG反應(yīng)的pH為6。

作為上述制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)，RGDyC與雙功能PEG反應(yīng)的溶液為NaAc-HAc溶液。

作為上述制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)，NHS-PEG-RGDyC和PAMAM納米粒反應(yīng)的pH為8～10。

作為上述制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)，NHS-PEG-RGDyC和PAMAM納米粒反應(yīng)的溶液為硼砂-NaOH溶液。

作為上述制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)，NHS-PEG-RGDyC和PAMAM納米粒反應(yīng)的時(shí)間為8～14 h。

一種RGD靶向樹狀納米粒標(biāo)記物，由上述制備方法制備得到的PAMAM-PEG-RGDyC與放射性核素鹽反應(yīng)得到。

作為上述RGD靶向樹狀納米粒標(biāo)記物的進(jìn)一步改進(jìn)，放射性核素鹽為NaI或KI，PAMAM-PEG-RGDyC與NaI或KI通過氯胺-T法將放射性核素共價(jià)連接在PAMAM-PEG-RGDyC上。特別的，I為¹³¹I。

下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。

的合成：

取雙功能PEG（NHS-PEG-MAL）（40mg，17.22μmol）加入到含有環(huán)狀 RGDyC（2mg，6.72μmol）的乙酸鈉緩沖液（NaAc-HAc 1ml 0.1M pH6.0）中，室溫下在磁力攪拌器中攪拌反應(yīng)30s；再把上一步反應(yīng)中混合產(chǎn)物迅速轉(zhuǎn)移至含有 PAMAM（G5 108μl 4.32mg，0.15μmol）的硼酸(硼砂-NaOH)緩沖液（borate buffer：1ml 0.05M pH9.0）中，用硼酸緩沖液調(diào)節(jié)pH至9.0，繼續(xù)在室溫中反應(yīng)12h。12h后，用冰乙酸將反應(yīng)混合物的pH值調(diào)至7.0，加入β-巰基乙醇（1μL，14μmol）結(jié)合未反應(yīng)的馬來酰亞胺基團(tuán)；反應(yīng)1h后，通過超濾 （Amicon Ultra-4, MWCO 30000; 3500 rpm , 6min, 8 times）去除游離 PEG 和 RGDyC，把水溶液凍干得淺黃色固體。¹H NMR分析產(chǎn)物成分（Ascend，400MHz），見圖1，該圖譜具有的峰型分別代表PAMAM、PEG、RGDyC的特征峰，說明標(biāo)記前體合成成功。

PAMAM-RGDyC-¹³¹I的合成：

稱取PAMAM-PEG-RGDyC 3mg溶于磷酸鹽緩沖液（PBS：100μL pH 7.4）中，置于1.5ml的ep管里；取新鮮的 Na¹³¹I 溶液（5 mCi，50μl），加入管內(nèi)，緊接著加入氯胺-T 1.5mg（5mg/ml, pH 7.4）；3min后，加入1.5mg的Na₂S₂O₅（5mg/ml, pH 7.4）停止碘化反應(yīng)。用紙層析法（Radio-TLC）測(cè)定標(biāo)記產(chǎn)物的放化產(chǎn)率，見圖2?？芍狿AMAM-RGDyC-¹³¹I的Rf值為0，而游離¹³¹I^-的Rf值為0.9~1。所以產(chǎn)物PAMAM-RGDyC-¹³¹I的放化產(chǎn)率為94.68%~98.87%，純度可進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。

放射性納米探針PAMAM-RGDyC-¹³¹I的體外穩(wěn)定性研究

取10 μl經(jīng)純化后的PAMAM-RGDyC-¹³¹I，分別加入到250 μl小牛血清和250 μl PBS中。置于37 ℃水浴箱中孵育0、2、12、24、48、72 h， 分別于不同時(shí)間點(diǎn)取少量樣品紙層析法測(cè)定其放化純度，以鑒定其體外穩(wěn)定性（圖3），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明說明產(chǎn)物在血清與PBS中的穩(wěn)定性較好。

放射性納米探針PAMAM-RGDyC-¹³¹I的的水溶性測(cè)定

在Ep管內(nèi)同時(shí)加入500μl正辛醇和400μl PBS，并取100μl PAMAM-RGDyC-¹³¹I加入該管，用膠封膜密封，搖晃均勻；高速離心3 min（10000 rpm/min），至正辛醇與PBS形成明顯的分隔界面；另取6支塑料試管， 其中3支試管加入上層液體（即正辛醇），每管100 μl，另外3支試管取下層液體（即PBS），亦每管100 μl。分別測(cè)量每管的放射性計(jì)數(shù)。按下式計(jì)算脂水分配系數(shù)（log P）∶log P= log（cts正辛醇/cts PBS），cts正辛醇和cts PBS分別為100 μl正辛醇中和100 μl PBS中的平均放射性計(jì)數(shù)。

實(shí)驗(yàn)測(cè)得Log P =-1.29，具有較強(qiáng)的親水性，符合一般納米粒的結(jié)構(gòu)——外殼親水，內(nèi)核親脂，可為包裹藥物及體內(nèi)的長(zhǎng)時(shí)間循環(huán)提供必要的前提。

放射性納米探針PAMAM-RGDyC-¹³¹I在正常小鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布研究

取實(shí)施例1制備的¹³¹I標(biāo)記的納米探針3.7MBq/0.1mL（100μCi/100μl），將其注射到正常小鼠體內(nèi)，分別在在2h、12h、24h、72h時(shí)間點(diǎn)將裸鼠處死，取不同臟器，稱量臟器體重和各器官或臟器中的放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算臟器的每克組織劑量百分?jǐn)?shù)（%ID/g）。如圖4所示，肝臟與腎臟的%ID/g較高，可知藥物主要被肝腎攝取。圖6的結(jié)果說明藥物主要通過肝、腎排泄。

荷A549人肺腺癌裸鼠注射PAMAM-RGDyC-¹³¹I結(jié)合物后SPECT顯像研究

實(shí)驗(yàn)前 1 周，用 1％的碘化鉀封閉小鼠對(duì)放射性碘的攝取，取直徑為 0.8cm 左右的荷A549人肺腺癌裸鼠，分成兩組，從分別從注射放射性藥物PAMAM-RGDyC-¹³¹I 3.7MBq/50μl（100μCi/50μl）以及游離¹³¹I^- 3.7MBq/50μl（100μCi/50μl），在 4h、24h、72h、144h后進(jìn)行常規(guī) SPECT 儀平面顯像，觀察PAMAM-RGDyC-¹³¹I 及游離¹³¹I^-在荷瘤裸鼠腫瘤部位及體內(nèi)的濃聚情況。圖5為SPECT顯像結(jié)果?？梢娔[瘤上有放射性聚集，證明藥物的能與腫瘤進(jìn)行特異性結(jié)合的能力，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，藥物在腫瘤上的聚集沒有明顯的變化，藥物的作用時(shí)間較長(zhǎng)，具有SPECT臨床腫瘤靶向成像及放射性治療的潛力；而另一方面，由于游離¹³¹I^-并不具有靶向結(jié)合的能力，因此注射后4h，藥物主要通過腎排泄到膀胱的位置，且到了第二天就已經(jīng)基本排泄干凈。

放射性納米探針PAMAM-RGDyC-¹³¹I的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

以A549人肺腺癌細(xì)胞為模型，每孔細(xì)胞數(shù)為5000個(gè)，分別與不同的藥物孵育24、48、72h，然后加入MTT試劑（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽），再孵育4h，去除培養(yǎng)液，加入100μl二甲亞砜（DMSO），37℃振蕩15min，于570nm測(cè)定各個(gè)孔吸光度。結(jié)果如圖6顯示。結(jié)果顯示藥物對(duì)細(xì)胞的殺傷作用PAMAM-PEG-RGDyC-¹³¹I＞PAMAM-PEG-RGDyC＞¹³¹I，在給藥后24h后，可看到藥物組PAMAM-PEG-RGDyC-¹³¹I的細(xì)胞存活率相比其他兩組都比較低，到達(dá)72h后，細(xì)胞存活率低達(dá)29.71%，可說明藥物對(duì)細(xì)胞具有明顯的殺傷抑制作用。

放射性納米探針PAMAM-RGDyC-¹³¹I的細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

將培養(yǎng)的A549細(xì)胞消化，離心并用培養(yǎng)液重懸成1×10⁵ cell/ml，在24孔板中每孔加入500μl細(xì)胞懸液，于37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔夜培養(yǎng)使之貼壁。實(shí)驗(yàn)分兩組，分別加入PAMAM-PEG-RGDyC-¹³¹I（10μCi/50μl/孔）與¹³¹I^-（10μCi/50μl/孔），兩組細(xì)胞分別在孵育1、2、4、6h后結(jié)束孵育，吸去培養(yǎng)液，再用PBS洗三遍，用胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸浮液測(cè)量γ計(jì)數(shù)。計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)PAMAM-PEG-RGDyC-¹³¹I組與¹³¹I^-組的結(jié)合率=（每孔平均γ計(jì)數(shù)/陽性對(duì)照孔計(jì)數(shù)）×100%。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，由圖7可見，藥物PAMAM-PEG-RGDyC-¹³¹I組隨著時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞出現(xiàn)穩(wěn)步上升的攝取趨勢(shì)，說明藥物對(duì)于細(xì)胞具有靶向結(jié)合的特性，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，攝取率逐漸上升；而游離131I-組因?yàn)闆]有具有靶向結(jié)合的性質(zhì)，所以細(xì)胞對(duì)于它是沒有結(jié)合作用的，因此游離131I-與細(xì)胞的結(jié)合率不隨時(shí)間的增長(zhǎng)而出現(xiàn)明顯變化。

放射性納米探針PAMAM-RGDyC-¹³¹I的細(xì)胞洗脫實(shí)驗(yàn)

將培養(yǎng)的A549細(xì)胞消化，離心并用培養(yǎng)液重懸成1×10⁵ cell/ml，在24孔板中每孔加入500μl細(xì)胞懸液，于37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔夜培養(yǎng)使之貼壁。實(shí)驗(yàn)分兩組，分別加入PAMAM-PEG-RGDyC-¹³¹I（10μCi/50μl/孔）與¹³¹I^-（10μCi/50μl/孔），孵育2h后撤掉培養(yǎng)基，用的PBS緩沖液清洗3次，用0.5mL不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液再次孵育，孵育1、2、4、6h后，每孔用1ml PBS緩沖液沖洗3次，用胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸浮液測(cè)量γ計(jì)數(shù)。計(jì)算經(jīng)過洗脫后每個(gè)時(shí)間點(diǎn)PAMAM-PEG-RGDyC-¹³¹I組與¹³¹I^-組所剩藥物的結(jié)合率，從而得知藥物在細(xì)胞中的洗脫情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，由圖8可見，經(jīng)過了1、2、4、6h的洗脫后，藥物PAMAM-PEG-RGDyC-¹³¹I組隨著時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞中的藥物出現(xiàn)少量洗脫出來的現(xiàn)象，但變化不太明顯；另外，游離 ¹³¹I^-組中，由于游離 ¹³¹I^-對(duì)于藥物對(duì)于細(xì)胞來說沒有結(jié)合作用，即A549細(xì)胞沒有主動(dòng)攝取碘的能力，因此游離 ¹³¹I^-在細(xì)胞中的含量一直處于低水平，隨時(shí)間延長(zhǎng)，變化也不明顯。

放射性納米探針PAMAM-RGDyC-¹³¹I的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

取含有1×10⁷個(gè)A549細(xì)胞的懸液注射到4周左右的雄性裸鼠右側(cè)腋下，當(dāng)腫瘤直徑大概為1cm³時(shí)，每周經(jīng)尾靜脈注射給予400μCi的放射性藥物，持續(xù)1個(gè)月，期間沒3天天觀察記錄腫瘤體積，如圖9。由圖可知，PAMAM-RGDyC-¹³¹I可以很好地抑制腫瘤的生長(zhǎng)。