本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)/多肽藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種包含F(xiàn)GF-21的藥物組合物，其用于治療皮膚創(chuàng)面。另外，本發(fā)明還涉及包括該藥物組合物的藥物制劑和應(yīng)用等。

背景技術(shù)：

皮膚，人體最大的器官，不僅作為人體的第一道物理防線，保護(hù)機(jī)體免受外來因素的侵害，同時(shí)具備許多生物學(xué)功能，例如免疫監(jiān)視、自我修復(fù)等。燒傷、燙傷、糖尿病和壓瘡等疾病使皮膚的完整性遭到破壞，引起多種嚴(yán)重不良后果。皮膚損傷是醫(yī)學(xué)界最普遍、最繁重的問題，給患者帶來嚴(yán)重的心理負(fù)擔(dān)和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。在我國，每年有數(shù)百萬急性創(chuàng)傷病例，包括燒燙傷、手術(shù)傷口、外傷等。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年我國創(chuàng)面修復(fù)與再生治療需求高達(dá)1億人次左右。損傷使組織暴露在環(huán)境中，增加病人感染的可能性，造成體液流失，電解質(zhì)紊亂。

皮膚創(chuàng)面愈合也是一個(gè)高度復(fù)雜、需要多因素共同協(xié)調(diào)的動(dòng)態(tài)過程。此過程涉及多個(gè)不同、部分重疊的階段，因此涉及的藥物可能會(huì)非常多。例如，中國專利申請(qǐng)第201310083149號(hào)公開了一種促進(jìn)皮膚組織快速生長修復(fù)的生物制劑，其特征在于，包含如下重量比的組分：活性生長因子群及營養(yǎng)成份20-50份和生物總黃酮1份，所述的活性生長因子群及營養(yǎng)成份包含表皮生長因子、神經(jīng)生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、干細(xì)胞生長因子、肝細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、(堿性)成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、膠原蛋白、透明質(zhì)酸、多肽、核酸、氨基酸。

然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有技術(shù)中的蛋白質(zhì)類藥物(也稱活性生長因子群及營養(yǎng)成份)不但成分復(fù)雜，而且用量大，非常不容易穩(wěn)定生產(chǎn)，難以在實(shí)踐中推廣應(yīng)用。尤其是，現(xiàn)有的成纖維細(xì)胞生長因子(Fibroblast Growth Factor，F(xiàn)GF)家族不同成員的功能和結(jié)構(gòu)各不相同，目前有23種，能確認(rèn)選擇其中之一已屬不易。

本發(fā)明人沒有在現(xiàn)有技術(shù)的困難面前退縮，經(jīng)過長期的艱苦研究，尤其是結(jié)合本發(fā)明人的經(jīng)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了一種包含F(xiàn)GF-21的成分組合，其中蛋白質(zhì)類藥物的用量不但少，而且明確，適合推廣應(yīng)用。更令人意外地，其中的FGF-21用量無需高即可取得更優(yōu)異的藥效，這樣高效而低成本的效果更是預(yù)料之外的。而且，研究之后，本發(fā)明人進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明的成分最接近的現(xiàn)有技術(shù)是蘇仲春等人的論文(中國病理生理雜志2013，29(2):294-301)，然而其是為了培養(yǎng)干細(xì)胞，而不是使用干細(xì)胞，更不是為了治療治療皮膚創(chuàng)面。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，提供一種用于治療皮膚創(chuàng)面的藥物組合物。外，本發(fā)明還提供了包括該藥物組合物的藥物制劑和應(yīng)用等。

具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了用于治療皮膚創(chuàng)面的藥物組合物，其包括成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)、表皮生長因子(EGF)、銀杏葉總黃酮和干細(xì)胞。

FGF21是現(xiàn)有已知的，而且現(xiàn)有技術(shù)熱衷于研究FGF21的非天然突變體，例如中國專利申請(qǐng)200880009653、200980130476、200980150308、201080031036、201180028014、201410150150號(hào)，而本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用人天然FGF21(即未經(jīng)上述突變的FGF21)的效果更好，因此在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，F(xiàn)GF21是人天然FGF21。

EGF也是現(xiàn)有已知的，在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，EGF是人天然EGF，其可以通過重組生產(chǎn)，如可參見中國專利申請(qǐng)00117272號(hào)。另外，本發(fā)明的EGF可以替換成酸性纖維原細(xì)胞生長因子或胰島素樣生長因子。

銀杏葉總黃酮又稱為銀杏葉總黃酮苷提取物，其通常與銀杏葉總內(nèi)酯提取物混合為銀杏葉提取物來組合使用。本發(fā)明單獨(dú)使用銀杏葉總黃酮，其制備方法可參見中國專利申請(qǐng)02129905號(hào)中記載的銀杏葉總黃酮苷提取物的制備方法。

干細(xì)胞可以選自脂肪干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、皮膚源祖細(xì)胞、臍血干細(xì)胞、外周血干細(xì)胞和表皮干細(xì)胞的一種或幾種組合，優(yōu)選是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。盡管本發(fā)明人認(rèn)為自體的干細(xì)胞效果更佳，但是為了穩(wěn)定生產(chǎn)和避免倫理問題，在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，干細(xì)胞是已經(jīng)公開作為商品銷售的Prochymal。

優(yōu)選本發(fā)明第一方面的藥物組合物由成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)、表皮生長因子(EGF)、銀杏葉總黃酮和干細(xì)胞組成。

也優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的藥物組合物中，F(xiàn)GF21、EGF、銀杏葉總黃酮和干細(xì)胞的比例為0.2-20μg：0.2-20μg：10-1000μg：1×10⁵-1×10⁷個(gè)，優(yōu)選為1-3μg：1-3μg：50-150μg：5×10⁵-1.5×10⁶個(gè)，最優(yōu)選為2μg：2μg：100μg：1×10⁶個(gè)。尤其是本發(fā)明人令人意外地發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21不是越多越好，因此最優(yōu)比例的FGF21不但療效好，而且節(jié)約了FGF21的成本。

在第二方面，本發(fā)明提供了用于治療皮膚創(chuàng)面的藥物制劑，其包括本發(fā)明第一方面的藥物組合物和藥學(xué)上可接受的輔料。在本文中，藥學(xué)上可接受的輔料指無毒的填充劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、載體、溶劑或其他制劑輔料。例如，稀釋劑、賦形劑，如微晶纖維素、甘露醇等；填充劑，如淀粉、蔗糖等；粘合劑，如淀粉、纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和/或聚乙烯吡咯烷酮；崩解劑，如碳酸鈣和/或碳酸氫鈉；吸收促進(jìn)劑，如季銨化合物；表面活性劑，如十六烷醇；載體、溶劑，如水、生理鹽水、高嶺土、皂粘土等；潤滑劑，如滑石粉、硬脂酸鈣/鎂、聚乙二醇等。本發(fā)明第一方面的藥物組合物優(yōu)選用生理鹽水溶解或稀釋。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明第一方面的藥物組合物同時(shí)混合于生理鹽水中，容易快速失效，因此其中各成分分別溶于生理鹽水，這樣可以保存更長時(shí)間。優(yōu)選在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，藥學(xué)上可接受的輔料是生理鹽水和/或肝素-泊洛沙姆復(fù)合物。

肝素-泊洛沙姆復(fù)合物是現(xiàn)有已知的，如參見中國專利申請(qǐng)201110280783號(hào)。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，肝素-泊洛沙姆復(fù)合物剛加入到液體中的時(shí)候，在正在形成水凝膠的過程中，加入藥物活性成分。肝素-泊洛沙姆復(fù)合物本身對(duì)創(chuàng)傷修復(fù)沒有療效，但是其能增強(qiáng)本發(fā)明第一方面的藥物組合物的療效。因此優(yōu)選在本發(fā)明第二方面的藥物制劑中，F(xiàn)GF21和肝素-泊洛沙姆復(fù)合物的比例為0.2-20μg：50-5000μg，優(yōu)選為1-3μg：250-750μg，最優(yōu)選為2μg：500μg，其其他物質(zhì)的比例可以通過換算得到。

在第三方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面的藥物組合物在制備用于治療皮膚創(chuàng)面的藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選在本發(fā)明第三方面的應(yīng)用中，皮膚創(chuàng)面是由燒傷、冷傷、擠壓傷、刃器傷、火器傷或沖擊傷造成的。

也優(yōu)選在本發(fā)明第三方面的應(yīng)用中，藥物是本發(fā)明第二方面的藥物制劑。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第二方面的藥物制劑的制備方法，其包括用生理鹽水溶解或稀釋FGF21、EGF、銀杏葉總黃酮和干細(xì)胞，分別形成FGF21溶液、EGF溶液、銀杏葉總黃酮溶液和干細(xì)胞溶液，然后混合入藥學(xué)上可接受的輔料。尤其是當(dāng)使用肝素-泊洛沙姆復(fù)合物的情況下，當(dāng)其剛加入到液體中的時(shí)候，在正在形成水凝膠的過程中，加入FGF21溶液、EGF溶液、銀杏葉總黃酮溶液和干細(xì)胞溶液。

本發(fā)明取得的有益效果在于：所有成分的生物相容性好，無毒性，低免疫原性，可降解，至今未發(fā)現(xiàn)副作用和不良反映；可有效減少創(chuàng)傷的炎癥反應(yīng)，減少創(chuàng)傷面積，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，尤其對(duì)頑固性創(chuàng)傷(如，糖尿病病人的創(chuàng)傷)的治療效果顯著；成分明確，高成本成分的用量少，成本低，有利于其實(shí)際推廣和應(yīng)用。

為了便于理解，本發(fā)明引用了公開文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，其全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考，就好像它們?nèi)脑诒疚闹型暾涊d過一遍了。以下將通過具體的實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對(duì)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見了。

附圖說明

圖1：皮膚創(chuàng)傷治療后傷口愈合情況。

圖2：組織在第17天的HE染色。

圖3：組織在第17天的馬森染色。

圖4：組織在第17天的免疫熒光染色。

具體實(shí)施方式

下文將詳細(xì)描述本發(fā)明具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)注意的是,下述實(shí)施例中描述的技術(shù)特征或者技術(shù)特征的組合不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是孤立的,它們可以被相互組合從而達(dá)到更好的技術(shù)效果。

實(shí)施例1 本發(fā)明的藥物的制備

①成纖維細(xì)胞生長因子21溶液的配制：取天然人成纖維細(xì)胞生長因子21，用生理鹽水溶解，配制成10mg/mL的溶液；

②表皮生長因子溶液的配制：取天然人表皮生長因子，用生理鹽水溶解，配制成10mg/mL的溶液；

③銀杏葉總黃酮溶液的配制：取銀杏葉總黃酮，用生理鹽水溶解，配制成10mg/mL的溶液；

④干細(xì)胞溶液的配制：取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Prochymal(可購自美國Osiris公司)，用生理鹽水稀釋至濃度為1×10⁹/L；

按照表1各組分投料配比，加入18％(w/v)肝素-泊洛沙姆復(fù)合物的水凝膠中(還未形成水凝膠時(shí)立即投料)，攪拌混合，配制得到實(shí)驗(yàn)藥物。

表1不用組別的藥物配方

注：“-”代表此項(xiàng)不添加物質(zhì)。

實(shí)施例2 皮膚全層切除模型的建立和評(píng)價(jià)

取6-7周大的C57BL/6雄性小鼠，以4％水合氯醛腹腔注射麻醉(劑量為0.01ml/g)，用膠布固定小鼠四肢，用剃毛機(jī)剃去老鼠背部毛發(fā)，脫毛膏去除干凈，使用酒精對(duì)其背部皮膚進(jìn)行消毒。將環(huán)形膠圈固定在在背部中線兩側(cè)，距離耳朵2.5cm處的位置上，使環(huán)形膠圈完美貼合在背部。采用圓形皮膚打孔器在其背部做兩個(gè)直徑為6mm的創(chuàng)面，防止皮膚由于皺縮而愈合。

將動(dòng)物隨機(jī)分組(組別見表1)，其中對(duì)照組(實(shí)驗(yàn)組7)：皮膚創(chuàng)傷后，不給藥，只給予相同劑量的生理鹽水；其他組分別給藥實(shí)施例1制備的各種藥物。然后，用3M透明敷料覆蓋在創(chuàng)面上，防止傷口感染。用無菌彈力繃帶環(huán)繞老鼠創(chuàng)面一周，固定，防止老鼠咬硅膠片。

實(shí)施例3 療效評(píng)價(jià)

于17天后，進(jìn)行整體的效果評(píng)價(jià)，其指標(biāo)如下：

a.行為學(xué)：比較實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)的小鼠背部皮膚創(chuàng)面恢復(fù)情況；

b.組織形態(tài)學(xué)：給藥治療17天后，處死各組大鼠，收集損傷的皮膚組織，制作病理切片并進(jìn)行HE染色和Massion染色觀察，其中，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)給藥組(實(shí)驗(yàn)組1C，F(xiàn)GF-21)的再上皮化程度和肉芽組織的厚度明顯高于對(duì)照組(實(shí)驗(yàn)組7，Control)(見附圖2)，與對(duì)照組(實(shí)驗(yàn)組7，Control)相比，給藥組(實(shí)驗(yàn)組1C，F(xiàn)GF-21)的膠原含量表達(dá)更高，并且它的排列更加規(guī)則(見附圖3)；

c.結(jié)構(gòu)和功能蛋白的表達(dá)水平：收集損傷的皮膚組織，運(yùn)用免疫熒光染色和免疫組化染色檢測各組損傷皮膚內(nèi)各內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物(顯示創(chuàng)傷后的血管生成情況)的表達(dá)水平，其中，與對(duì)照組(實(shí)驗(yàn)組7，Control)相比，給藥組(實(shí)驗(yàn)組1C，F(xiàn)GF-21)血管表達(dá)量明顯增加(見附圖4)。

表2：不同實(shí)驗(yàn)組療效評(píng)價(jià)

各試驗(yàn)組從行為學(xué)、組織形態(tài)學(xué)、結(jié)構(gòu)和功能蛋白水平三方面進(jìn)行綜合評(píng)分，將各指標(biāo)分級(jí)，“-”表示無效，“+”表示三項(xiàng)指標(biāo)均有改善或升高，其中，行為學(xué)中的“+”表示創(chuàng)面愈合效率，“+”越多表示各指標(biāo)改善越明顯或表達(dá)越，創(chuàng)面大小越縮小；組織形態(tài)學(xué)中的“+”表示再生膠原增多，排列緊密有序，肉芽組織增生明顯；結(jié)構(gòu)和功能蛋白水平中的“+”表示相應(yīng)蛋白的表達(dá)升高。

整體的效果評(píng)價(jià)結(jié)果如表2所示，其中，使用少量的肝素-泊洛沙姆復(fù)合物本身，對(duì)創(chuàng)傷修復(fù)沒有作用，但是與其他活性成分聯(lián)合使用，能較大幅度增加療效；纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)、表皮生長因子類藥物、銀杏葉總黃酮和干細(xì)胞的四種成分組合能對(duì)創(chuàng)傷愈合顯著起效，缺失其中一種成分都會(huì)使整體效果差一些；尤其令人驚訝的是，F(xiàn)GF21不是用量越多越好，而是以2μg的用量為最佳。

在實(shí)驗(yàn)期間，進(jìn)行創(chuàng)面愈合評(píng)價(jià)，計(jì)算創(chuàng)面愈合率(％)＝(造模第一天創(chuàng)面面積—取材日創(chuàng)面面積)/造模第一天創(chuàng)面面積×100％。分別在第0、3、7、12、17天測量創(chuàng)面面積。通過肉眼觀察，發(fā)現(xiàn)給藥組(實(shí)驗(yàn)組1C，F(xiàn)GF-21)的創(chuàng)面愈合情況顯著優(yōu)于對(duì)照組(實(shí)驗(yàn)組7，Control)(見附圖1)。