本發(fā)明涉及貝母素乙應用技術領域，是一種貝母素乙作為制備提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性藥物的應用。

背景技術：

惡性腫瘤是危害人類健康的重大疾病之一。對于惡性腫瘤的治療,主要采取以手術治療、放射治療、化學治療等相結(jié)合的綜合治療方式。臨床上目前治療腫瘤的藥物主要是化學藥物，但是由于化學藥物毒性大，在殺死腫瘤細胞的同時也可殺死人體自身免疫細胞，患者不良反應大，在臨床使用中有很大的局限性。

化療增敏劑是指采用微小劑量的該種物質(zhì)與化療藥物合用即能使化療效果有顯著提高的藥物。此類藥物本身或在低劑量下無明顯抗腫瘤作用，與化療藥物聯(lián)用卻能提高化療藥物療效，且自身毒副作用小。目前，由于有些藥物用量大，則對機體的毒性也隨之增加，所以尋找低毒和不良反應少的化療增敏劑對提高化療治療效果具有重要意義。

中醫(yī)藥治療腫瘤是中國在腫瘤治療領域的一大特色，現(xiàn)今中藥方劑，中藥提取物，中藥單體等抗腫瘤作用越來越受到重視。由于有些藥物用量大，則對機體的毒性也隨之增加，近年研究發(fā)現(xiàn)，許多中藥提取物及單體對腫瘤化療有增敏作用，這類藥物大多毒性較低，作用靶點多樣，機體耐受性好，具有一定臨床應用價值。

現(xiàn)今，許多中藥都證明具有化療增敏作用。白藜蘆醇是非黃酮類多酚化合物，是植物為抵抗外界刺激如紫外線、真菌或機械損傷而產(chǎn)生的一種植物抗毒素。權芳等（白藜蘆醇對缺氧環(huán)境中鼻咽癌細胞株CNE2的化療增敏作用，中西醫(yī)結(jié)合學報）研究發(fā)現(xiàn)，非細胞毒性劑量的白藜蘆醇能夠明顯提高紫杉醇、順鉑和氟尿嘧啶對CNE2的細胞毒性作用，且具有劑量依賴性。葡萄籽多酚(grape seed polyphenols,GSP)是從葡萄籽中提取的一種天然植物多酚物質(zhì)。體外研究表明,GSP具有清除自由基、抗氧化等多種生物活性。李麗等（葡萄籽多酚逆轉(zhuǎn)人乳腺癌多藥耐藥性及其機制研究，中華普通外科雜志）發(fā)現(xiàn)葡萄籽多酚有明顯的化療增敏作用。許多天然多糖類化合物被認為具有抗腫瘤活性,侯華新等（銀杏葉多糖在腫瘤放射、化療治療中的增敏作用研究，廣西醫(yī)科大學學報）研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉多糖對常用的化療藥物具有明顯的協(xié)同效應,能提高它們對腫瘤細胞的抑制生長作用。另外，康萊特注射液、槲皮素、藻藍蛋白也被證明有潛在的化療增敏作用。甲基蓮心堿是一種雙節(jié)基異喹啉類生物堿,石書紅等（甲基蓮心堿對長春新堿抑制人胃癌細胞增值作用的影響，臨床腫瘤學雜志）研究發(fā)現(xiàn)甲基蓮心堿能從抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡兩個方面來增強長春新堿（VCR）的抗腫瘤作用,且甲基蓮心堿本身對胃癌細胞無明顯毒性作用,是潛在的胃癌化療增敏藥物。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種貝母素乙作為制備提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性藥物的應用；本發(fā)明首次提出了貝母素乙作為制備提高食管癌細胞、肝癌細胞、乳腺癌細胞、宮頸癌細胞和肺癌細胞對化療藥物的敏感性藥物的應用。

本發(fā)明的技術方案是通過以下措施來實現(xiàn)的：一種貝母素乙作為制備提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性藥物的應用，腫瘤細胞為食管癌細胞或/和肝癌細胞或/和乳腺癌細胞或/和宮頸癌細胞或/和肺癌細胞。

下面是對上述發(fā)明技術方案的進一步優(yōu)化或/和改進：

上述食管癌細胞為食管癌Eca109細胞。

上述肝癌細胞為肝癌HepG2細胞。

上述乳腺癌細胞為人乳腺癌MCF7細胞。

上述宮頸癌細胞為人宮頸癌Hela細胞。

上述肺癌細胞為人肺癌A549細胞。

上述貝母素乙的用量為對腫瘤細胞的非毒性劑量。

本發(fā)明首次提出了貝母素乙作為制備提高食管癌細胞、肝癌細胞、乳腺癌細胞、宮頸癌細胞和肺癌細胞對化療藥物的敏感性藥物的應用，貝母素乙聯(lián)用化療藥物，可以提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，可以顯著抑制食管癌細胞、肝癌細胞、乳腺癌細胞、宮頸癌細胞和肺癌細胞的增殖，為提高對食管癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌和肺癌的治療效果提供了新手段。

附圖說明

附圖1為不同濃度貝母素乙作用72h后對腫瘤細胞存活率的影響。

附圖2a為A549細胞的抑制率。

附圖2b為Eca109細胞的抑制率。

附圖2c為HepG2細胞的抑制率。

附圖2d為MCF7細胞的抑制率。

附圖2e為Hela細胞的抑制率。

附圖3為貝母素乙聯(lián)合阿霉素以及單用阿霉素處理腫瘤細胞的半數(shù)抑制濃度IC₅₀。

附圖4a為A549細胞的結(jié)晶紫染色圖。

附圖4b為Eca109細胞的結(jié)晶紫染色圖。

附圖4c為HepG2細胞的結(jié)晶紫染色圖。

附圖4d為MCF7細胞的結(jié)晶紫染色圖。

附圖4e為Hela細胞的結(jié)晶紫染色圖。

具體實施方式

本發(fā)明不受下述實施例的限制，可根據(jù)本發(fā)明的技術方案與實際情況來確定具體的實施方式。本發(fā)明中所提到各種化學試劑和化學用品如無特殊說明，均為現(xiàn)技術中公知公用的化學試劑和化學用品。

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步描述：

實施例1：該貝母素乙作為制備提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性藥物的應用，腫瘤細胞為食管癌細胞或/和肝癌細胞或/和乳腺癌細胞或/和宮頸癌細胞或/和肺癌細胞。

實施例2：作為實施例1的優(yōu)化，食管癌細胞為食管癌Eca109細胞。

實施例3：作為實施例1的優(yōu)化，肝癌細胞為肝癌HepG2細胞。

實施例4：作為實施例1的優(yōu)化，乳腺癌細胞為人乳腺癌MCF7細胞。

實施例5：作為實施例1的優(yōu)化，宮頸癌細胞為人宮頸癌Hela細胞。

實施例6：作為實施例1的優(yōu)化，肺癌細胞為人肺癌A549細胞。

實施例7：作為上述實施例的優(yōu)化，貝母素乙的用量為對腫瘤細胞的非毒性劑量。

以下為貝母素乙的藥理試驗：

1. 貝母素乙對、食管癌細胞、肝癌細胞、乳腺癌細胞、宮頸癌細胞、肺癌細胞的毒性測定

通過MTT比色法，檢測貝母素乙對食管癌細胞（食管癌Eca109細胞）、肝癌細胞（肝癌HepG2細胞）、乳腺癌細胞（人乳腺癌MCF7細胞）、宮頸癌細胞（人宮頸癌Hela細胞）、肺癌細胞（人肺癌A549細胞）生長的抑制作用，不同濃度貝母素乙作用72h后對腫瘤細胞存活率的影響如圖1所示。在后續(xù)的敘述中，食管癌Eca109細胞用Eca109細胞代替，肝癌HepG2細胞用HepG2細胞代替，人乳腺癌MCF7細胞用MCF7細胞代替，人宮頸癌Hela細胞用Hela細胞代替，人肺癌A549細胞用A549細胞代替。

通過圖1實驗結(jié)果證明，貝母素乙對這五種腫瘤細胞（Eca109細胞、HepG2細胞、MCF7細胞、Hela細胞、A549細胞）幾乎無作用，在劑量為20ug/mL的貝母素乙的作用下，五種腫瘤細胞存活率均大于90%。所以，濃度小于20ug/mL時，認為貝母素乙對五種腫瘤細胞無細胞毒性作用，為貝母素乙對五種腫瘤細胞系的非毒性劑量，這樣可以避免因細胞毒性作用或劑量過大導致的機體不能耐受。

敏感性實驗

阿霉素為目前常用的化療藥物，本實驗化療藥物選擇阿霉素（ADR）。檢測阿霉素（ADR）單劑以及非毒性劑量的貝母素乙聯(lián)合化療藥物阿霉素(PMI+ADR)對腫瘤細胞（Eca109細胞、HepG2細胞、MCF7細胞、Hela細胞、A549細胞）的生長抑制率（抑制率，%）的影響，Eca109細胞、HepG2細胞、MCF7細胞、Hela細胞、A549細胞的抑制率如圖2a至圖2e所示（*p<0.05，**p<0.01）。貝母素乙聯(lián)合阿霉素以及單用阿霉素處理腫瘤細胞的半數(shù)抑制濃度（IC₅₀值，*p<0.05，**p<0.01）如圖3所示。

通過2a至圖2e所示可以看出，阿霉素聯(lián)用貝母素乙對腫瘤細胞的抑制率高于阿霉素單劑對腫瘤細胞的抑制率，即阿霉素聯(lián)用貝母素乙對腫瘤細胞處理后，使腫瘤細胞的存活率大大低于采用阿霉素單劑處理后的腫瘤細胞的存活率，說明貝母素乙聯(lián)合阿霉素對腫瘤細胞的毒性增強。

通過圖3可以看出，貝母素乙聯(lián)合阿霉素處理腫瘤細胞的IC₅₀值低于單用阿霉素處理腫瘤細胞的IC₅₀值，說明貝母素乙聯(lián)合阿霉素對腫瘤細胞的毒性增強。

由此試驗可知，貝母素乙能夠提高腫瘤細胞對阿霉素的敏感性。

結(jié)晶紫染色實驗

通過結(jié)晶紫染色法，驗證非毒性劑量貝母素乙與化療藥物阿霉素聯(lián)用對腫瘤細胞增殖的抑制作用。

取對數(shù)生長期的Eca109細胞、HepG2細胞、MCF7細胞、Hela細胞、A549細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，收集到離心管中，800rpm離心5min，重懸后計數(shù)，按照每孔1×10⁴個細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。按照實驗分組，加入不同的濃度ADR以及非毒性劑量的貝母素乙，置于37℃、5%CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天,結(jié)晶紫染色，拍照，結(jié)果如圖4a-圖4e。在圖4a中，包括4個組，分別為溶劑對照組（MOCK）、加入非毒性劑量的貝母素乙組（PMI）、加入ADR單劑組（ADR）、聯(lián)用非毒性劑量的貝母素乙與阿霉素組（PMI+ADR），圖4b-圖4e的分組如圖4a相同。

通過圖4a至圖4e可以看出，加入PMI+ADR組中的紫色細胞（圖中顯示為黑點及黑色區(qū)域）分布量明顯比加入ADR單劑組的紫色細胞分布量要少，即加入PMI+ADR組中的紫色細胞（腫瘤細胞）的數(shù)量明顯少于加入ADR單劑組的紫色細胞的數(shù)量，說明非毒性劑量貝母素乙與化療藥物阿霉素聯(lián)用對腫瘤細胞增殖的抑制作用明顯優(yōu)于阿霉素單劑對腫瘤細胞增殖的抑制作用，即貝母素乙與化療藥物阿霉素聯(lián)用能夠提高腫瘤細胞對阿霉素的敏感性。

綜上所述，本發(fā)明首次提出了貝母素乙作為制備提高食管癌細胞、肝癌細胞、乳腺癌細胞、宮頸癌細胞和肺癌細胞對化療藥物的敏感性藥物的應用，貝母素乙聯(lián)用化療藥物，可以提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，可以顯著抑制食管癌細胞、肝癌細胞、乳腺癌細胞、宮頸癌細胞和肺癌細胞的增殖，為提高對食管癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌和肺癌的治療效果提供了新手段。

以上技術特征構成了本發(fā)明的實施例，其具有較強的適應性和實施效果，可根據(jù)實際需要增減非必要的技術特征，來滿足不同情況的需求。