本發(fā)明涉及藥學，尤其是一種協(xié)同促進細胞凋亡治療人乳腺癌組合物。

背景技術(shù)：

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率高居女性惡性腫瘤之首，其死亡率僅次于肺癌。作為蒽環(huán)類藥物的代表--阿霉素化療可以有效提高乳腺癌患者的生存率和抑制乳腺癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移，在乳腺癌的臨床治療中，長期單一給予阿霉素藥物治療，易導致阿霉素心臟毒性的出現(xiàn)。

現(xiàn)有醫(yī)學技術(shù)中，例如：用于治療癌癥的協(xié)同藥物組合，CN101677567A，包含一種選自紫杉醇、多西他賽、阿霉素或吉西他濱或其藥學上可接受的鹽的細胞毒性抗腫瘤劑，和至少一種細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑的新的藥物組合；其中，所述組合在用于治療癌癥時顯示協(xié)同效應。該發(fā)明還涉及使用治療有效量的所述組合治療癌癥的方法。

該發(fā)明中有許多藥物與阿霉素協(xié)同用藥來抑制癌癥細胞，但尚未用巖藻黃素與阿霉素協(xié)同用藥來抑制癌細胞。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供減少阿霉素使用量加大癌細胞的抑制率的一種協(xié)同促進細胞凋亡治療人乳腺癌組合物。

為解決上述現(xiàn)有的技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下方案：一種協(xié)同促進細胞凋亡治療人乳腺癌組合物，所述組合物為巖藻黃素和阿霉素，混合比例為按重量份300：1。

一種協(xié)同促進細胞凋亡治療人乳腺癌組合物的制備方法，包括巖藻黃素和阿霉素組合物的制備，包括以下步驟：提取巖藻黃素，按混合比例稱取巖藻黃素和阿霉素，置于乙醇浸泡，過濾，干燥，粉碎至50-150目，攪拌并加入2-5重量份的助懸劑后再加入0.1-0.2重量份的抗氧化劑，得到組合物造粒。

作為優(yōu)選，乙醇濃度為70-80％，浸泡3-4小時。

作為優(yōu)選，干燥方法為：藥物置于干燥箱內(nèi)50-70℃鼓風干燥。

作為優(yōu)選，助懸劑為黃原膠、羥丙甲纖維素、卡波姆中的一種或幾種。

作為優(yōu)選，抗氧化劑的成分及其重量份為：D-異抗壞血酸鈉0.1-2份、檸檬酸亞錫二鈉0.1-2份、乙二胺四乙酸二鈉0.1-0.5份、三聚磷酸鈉0.1-0.5份、肌醇六磷酸0.1-0.5份、磷酸二氫鈉為0.1-1份、鹽酸萘乙二胺0.01-0.03份、多聚苯丙氨酸0.04-0.06份。

作為優(yōu)選，提取巖藻黃素包括以下步驟：

1)預處理：將海藻清洗消毒，烘干粉碎過篩；

2)提取濃縮液：加入有機試劑，避光反復浸泡過濾直至液體呈無色；

3)去雜質(zhì)：將濃縮液放入瓶中，真空旋轉(zhuǎn)蒸后出現(xiàn)沉淀后過濾；

4)巖藻黃素的獲得：反復步驟3，直至出現(xiàn)紅色固體后濾取紅色固體，即得到巖藻黃素。

作為優(yōu)選，步驟1中烘干溫度為60-70℃，過篩的目數(shù)為60～100目，使其藥物成分烘干。

作為優(yōu)選，步驟2中有機試劑為80-99％的乙醇水溶液。

有益效果：本發(fā)明提供的這種協(xié)同促進細胞凋亡治療人乳腺癌組合物，巖藻黃素與阿霉素合用后具有較強的協(xié)同作用，減少阿霉素的毒性，能下降線粒體膜電位，協(xié)同誘導癌細胞凋亡，提高對癌細胞的抑制率。

本發(fā)明采用了上述技術(shù)方案提供一種協(xié)同促進細胞凋亡治療人乳腺癌組合物，彌補了現(xiàn)有技術(shù)的不足，設(shè)計合理，操作方便。

附圖說明

圖1為本發(fā)明AO/EB染色觀察細胞形態(tài)結(jié)果對比圖；

圖2為本發(fā)明JC-1法測定MCF-7細胞線粒體膜電位的變化對比圖；

圖3為本發(fā)明Western blotting檢測MCF-7細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的電泳條帶對比圖。

圖1中：A：空白對照組、B：巖藻黃素單用組、C：阿霉素單用組、D：巖藻黃素與阿霉素合用組

具體實施方式

以下結(jié)合附圖和實施例作進一步詳細描述：

實施例1

如圖1、2、3所示，一種協(xié)同促進細胞凋亡治療人乳腺癌組合物，所述組合物為巖藻黃素和阿霉素，混合比例為：300：1，巖藻黃素配合阿霉素協(xié)同使用，降低阿霉素對人體的副作用，同時提高抑制癌細胞的作用。

一種協(xié)同促進細胞凋亡治療人乳腺癌組合物的制備方法，包括巖藻黃素和阿霉素組合物的制備，包括以下步驟：提取巖藻黃素，按混合比例稱取巖藻黃素和阿霉素，置于乙醇浸泡，過濾，干燥，粉碎至100目，攪拌并加入混懸液后再加入0.1-0.2％重量份的抗氧化劑，固化處理，得到組合物。

制備方法中的常規(guī)技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的現(xiàn)有技術(shù)，在此不作詳細敘述。

干燥方法為：藥物置于干燥箱內(nèi)70℃鼓風干燥，便于藥物充分干燥

助懸劑為黃原膠、羥丙甲纖維素、卡波姆中的一種或幾種。

抗氧化劑的成分及其優(yōu)選重量份為：D-異抗壞血酸鈉0.1份、檸檬酸亞錫二鈉0.5份、乙二胺四乙酸二鈉0.1份、三聚磷酸鈉0.5份、肌醇六磷酸0.1份、磷酸二氫鈉為0.1份、鹽酸萘乙二胺0.01份、多聚苯丙氨酸0.04份。采用新型的抗氧化劑，能使組合物的有效成分得以保存，提高作用效果。

提取巖藻黃素包括以下步驟：

1)預處理：將海藻清洗消毒，烘干粉碎；

2)提取濃縮液：加入有機試劑，避光反復浸泡過濾直至液體呈無色；

3)去雜質(zhì)：將濃縮液放入瓶中，真空旋轉(zhuǎn)蒸后出現(xiàn)沉淀后過濾；

4)巖藻黃素的獲得：反復步驟3，直至出現(xiàn)紅色固體后濾取紅色固體，即得到巖藻黃素。

步驟2中有機試劑為90％的乙醇水溶液。

巖藻黃素為安全性較高的活性物質(zhì)。

實施例2

一種協(xié)同促進細胞凋亡治療人乳腺癌組合物的制備方法，所述巖藻黃素在制備協(xié)同促進細胞凋亡中效果的實驗步驟：

1)、MCF-7細胞采用含胎牛血清10％、青霉素100U/mL和鏈霉素100U/mL的DMEM完全培養(yǎng)基，置于溫度為37℃、二氧化碳5％、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2天傳代1次，所有試驗均在MCF-7細胞對數(shù)生長期進行。

2)、設(shè)立巖藻黃素，阿霉素以及聯(lián)合用藥實驗組和空白對照組，

3)、取MCF-7細胞消化后，離心制成6×103個/mL終密度的細胞懸液接種于96孔板中，以二氧化碳5％、溫度為37℃的環(huán)境下孵育24h，添加各實驗組中的藥物，藥物添加量如表1所示，繼續(xù)培養(yǎng)72h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加200μL MTT工作液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)后，吸棄MTT工作液，每孔加入150μL DMSO震蕩10min，于酶標儀490nm波長下測定各空的吸光度值，最后計算細胞抑制率和聯(lián)合指數(shù)。

抑制率(IR％)＝(1-TOD/COD)×100％

TOD:給藥組的OD均值 COD:溶劑對照組OD均值

(聯(lián)合指數(shù))CI＝D1/Dx1+D2/Dx2+α·(D1·D2)/(Dx1·Dx2)

D1、D2為合用時產(chǎn)生X效應時兩藥各自所需劑量；

Dx1、Dx2為兩藥單獨使用產(chǎn)生X效應時各自劑量；

表1

通過計算后查詢得出，在總抑制率為50％～80％時的CI值小于1，協(xié)同效應顯著，當25μmol/L的巖藻黃素與0.08μmol/L的阿霉素合用72h條件下，其CI值為0.348，此時巖藻黃素與阿霉素合用后具有較強的協(xié)同作用，如表2所示：

表2

4)將濃度為1×105/mLMCF-7細胞接種于培養(yǎng)板中的蓋玻片上，常規(guī)條件下培養(yǎng)24h，投入藥物后培養(yǎng)24h后，取出蓋玻片，用95％乙醇固定30min，觀察前于載玻片上滴加40μLPBS和10μLAO/EB混合液，將蓋玻片有細胞的一面朝下，熒光顯微鏡下觀察并拍照采集，通過對采集的照片觀察對比，發(fā)現(xiàn)空白對照組A中，細胞核染色質(zhì)著綠色并呈正常結(jié)構(gòu)；巖藻黃素單用組B，細胞核染色質(zhì)著綠色呈固縮狀或圓珠狀；阿霉素單用組C,細胞出現(xiàn)空泡，核染色質(zhì)呈現(xiàn)強黃綠色熒光；巖藻黃素與阿霉素合用組D，細胞呈晚期凋亡細胞形態(tài)，核染色質(zhì)為橘紅色并呈固縮狀或圓珠狀。

5)取對數(shù)MCF-7細胞，消化離心制成5×104細胞懸液接種于25mL培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24h后加藥，巖藻黃素單用組25μmol/L、阿霉素單用組0.08μmol/L及聯(lián)合用藥組25μmol/LFUC+0.08μmol/LADR并設(shè)立空白對照組，放入藥物48h后，PBS洗滌細胞2次，離心收集不多于1×106的細胞。取500μLJC-1工作液將細胞均勻懸浮，在二氧化碳5％、溫度為37℃培養(yǎng)箱中孵育20分鐘。室溫離心收集細胞，用1×Incubation Buffer洗兩次。最后，吸取1×Incubation Buffer重新懸浮細胞置于流式細胞儀分析并計算線粒體膜電位下降的細胞比例，發(fā)現(xiàn)加藥處理MF-7細胞48h后，空白對照組細胞線粒體膜電位下降比例為0.09±0.47％，巖藻黃素單用組細胞線粒體膜電位下降比例為2.40±1.43％，阿霉素單用組細胞線粒體膜電位下降比例為4.12±2.71％，而合用組細胞線粒體膜電位下降比例達20.02±4.84％，表明巖藻黃素與阿霉素合用具有很強的協(xié)同下降線粒體膜電位的作用。

6)在MCF-7細胞中加入含PMSF的RIPA后反復吹打，將細胞置于冰上裂解30min。裂解后，離心，取上清液。按照測定的蛋白含量取相同體積的蛋白提取液，與5×SDS Loading按1:4的比例均勻混合后加熱變性，-80℃儲存?zhèn)溆谩Ｗ冃院蟮牡鞍滋崛∫翰捎肧DS-PAGE電泳法，取經(jīng)5×SDS Loading處理后蛋白樣品各25μL經(jīng)上樣緩沖液處理后上樣，電壓60v電泳25min后轉(zhuǎn)換電壓100v，電泳90min；采用濕法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，將PVDF膜至于5％脫脂奶粉中4℃封閉2h；用TBST10mL溶液洗3次，TBS 10mL溶液洗膜1次，將膜置于1％BSA溶液稀釋后的一抗的雜交袋，4℃孵育過夜；洗膜后加入1％BSA的溶液稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，4℃搖床孵育2h后，洗膜后用ECL顯影，使用Alpha化學發(fā)光儀進行掃描并拍照采集，發(fā)現(xiàn)藥物作用剪切底物蛋白pro-Caspase-3，聯(lián)合用藥組與單用組相比，合用組產(chǎn)生cleaved-Caspase-3的累積，Caspase-3蛋白的激活，引起Caspase-3下游底物多聚ADP糖聚合酶(PARP)的裂解，PARP切割明顯增加，巖藻黃素與阿霉素合用能夠協(xié)同誘導MCF-7細胞凋亡，通過探索巖藻黃素與阿霉素聯(lián)合用藥對MCF-7細胞凋亡的影響，得出巖藻黃素與阿霉素合用后具有更強的抗腫瘤效果。

本文中所描述的具體實施例僅僅是對本發(fā)明作舉例說明。本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，但并不會偏離本發(fā)明或者超越所附權(quán)利要求書所定義的范圍。