本發(fā)明專利屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種能夠搭載基因治療腫瘤的運(yùn)載體及其制備方法。
背景技術(shù):
目前,我國腫瘤的發(fā)生發(fā)病率、死亡率呈持續(xù)上升趨勢(shì)。據(jù)國際癌癥研究署報(bào)告顯示,2012年我國癌癥發(fā)病人數(shù)約為306.5萬,約占全球癌癥發(fā)病的1/5,癌癥死亡人數(shù)為220.5萬,約占全球癌癥死亡人數(shù)的1/4。
目前,腫瘤的治療手段主要包括手術(shù)治療、放化學(xué)治療、生物免疫治療、中醫(yī)藥治療等。但是由于現(xiàn)有治療手段本身存在的缺陷,即便積極采取手術(shù)、放療、化療、免疫治療等多種綜合治療模式,患者療效及預(yù)后仍然極差,5年生存率僅約25%。因此探索及創(chuàng)制針對(duì)腫瘤的新型治療手段已迫在眉睫。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題就是提供一種能搭載抗腫瘤藥物或基因的運(yùn)載體及其制備方法,使其既能搭載抗腫瘤藥物發(fā)揮抗癌作用,或能搭載抑癌基因發(fā)揮抗癌作用,且能提高抗腫瘤藥物或者基因的穿膜效率,大大增強(qiáng)其抗腫瘤效應(yīng)。
為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明提供了一種能夠搭載抗腫瘤藥物或者基因的運(yùn)載體,包括氧化石墨烯(GO),殼聚糖(CS),細(xì)胞穿膜肽(MPG)。其特征在于,此運(yùn)載體既能運(yùn)載抗腫瘤藥物,又能運(yùn)載抑癌基因。并且綜合利用了氧化石墨烯載藥量大,生物相容性好,連接殼聚糖之后,其在溶液中分散性、生物相容性及穩(wěn)定性更好;將其與細(xì)胞穿膜肽連接后,能發(fā)揮穿膜作用,提高抗腫瘤藥物或者抑癌基因進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的效率,大大增強(qiáng)其抗腫瘤效應(yīng)。
為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo),本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
將鱗片石墨和KMnO4混合物(質(zhì)量比為1: 3~1: 10)兩種固體混合均勻。將混合物放入燒杯,置于在恒溫水浴箱(35~42℃)中,攪拌下緩慢滴加濃H2SO4-濃H3PO4混酸(體積比為5: 1~10: 1),;再超聲乳化30~60分鐘,然后在50~100℃下反應(yīng)12-72小時(shí);反應(yīng)結(jié)束后,產(chǎn)物在空氣之中自然冷卻至室溫。然后將產(chǎn)物與500~1000毫升冰水(0-4℃)混合,并在攪拌下緩慢滴加H2O2至不再產(chǎn)生氣泡為止;所得混合物經(jīng)離心(1000r/min,5min)后,所得固體用稀鹽酸洗滌2-10次,再用蒸餾水洗至中性,所得固體用20~50毫升去離子水分散后放入冷凍干燥器(-10℃~-50℃)中,冷凍干燥得氧化石墨烯粉末。
稱取10-1000mg氧化石墨烯粉末、10-1000mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)、10-6000mg殼聚糖以及1-100ml二甲基亞砜(DMSO),混合,然后經(jīng)超聲分散0.5-2h,混合均勻后,加入0.1-10g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC),加熱至50~100℃下反應(yīng)12~72小時(shí);反應(yīng)結(jié)束后,所得混合物用去離子水洗2-10遍, 稀鹽酸洗2-10遍,最后用去離子水洗至中性,冷凍干燥(-10℃~-50℃),得氧化石墨烯-殼聚糖復(fù)合物(GO-CS)。
將10-1000mg氧化石墨烯-殼聚糖復(fù)合物用雙蒸水洗滌2-10遍,純化,加入10-3000mgMPG多肽,超聲分散0.5-2h,透析提純2-5遍,無酶水洗滌2-10遍,完全去除多余未反應(yīng)的MPG多肽,再進(jìn)行冷凍干燥(-10℃~-50℃),得氧化石墨烯-殼聚糖-MPG多肽(GO-CS-MPG)載體。
為了能夠更加直觀的對(duì)制備的GO-CS-MPG載體進(jìn)行觀察分析,進(jìn)行了掃描電鏡分析。氧化石墨烯呈單層片狀結(jié)構(gòu),殼聚糖以膜覆蓋方式與氧化石墨烯接枝,而MPG則通過棒狀、桿狀、鏈狀等結(jié)構(gòu)形式與氧化石墨烯-殼聚糖相連接。
為了能夠具體分析GO-CS-MPG載體構(gòu)成比例,進(jìn)行了TGA熱重分析。每一份GO-CS-MPG載體中,GO約占30-50%,CS約占40-60%,MPG約占5-15%。
為了驗(yàn)證該載體的生物安全性以及細(xì)胞毒性,對(duì)其進(jìn)行了細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該載體在濃度為0-320mg/L時(shí),其對(duì)細(xì)胞增殖是無毒性的。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明,而非限制本發(fā)明。
氧化石墨烯(GO)制備:稱取0.3g鱗片石墨和1.5g的KMnO4,將兩種固體混合均勻轉(zhuǎn)移至100mL的圓底燒瓶中,量取36mL的濃H2SO4和4mL的H3PO4混淆均勻,在冰水浴中逐漸滴加至圓底燒瓶,超聲處理之后,溶液呈現(xiàn)墨綠色,在50℃水浴中反應(yīng)12h,滴加H2O2,溶液呈現(xiàn)亮黃色,至不再產(chǎn)生氣泡后,1000r/min離心3min,用0.1M HCl洗滌3次,用蒸餾水洗至pH=7,冷凍干燥(-20℃)得氧化石墨烯粉末。
氧化石墨烯接枝殼聚糖:將0.20g氧化石墨烯、0.10g4-二甲氨基吡啶(DMAP)、0.75g 殼聚糖以及30mL二甲基亞砜(DMSO)一起加入50mL圓底燒瓶中,混勻后,加入0.5g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC),在60℃油浴中反應(yīng)36h,所得混合溶液用水洗3遍,0.5M的HCl洗3遍,最后水洗至中性,冷凍干燥(-20℃),得氧化石墨烯-殼聚糖復(fù)合物(GO-CS)。
氧化石墨烯-殼聚糖接枝MPG多肽:稱取200mg氧化石墨烯-殼聚糖復(fù)合物,高溫高壓滅菌蒸餾水洗滌3遍,純化,冷凍蒸干,嚴(yán)格無菌操作,得到的蒸干物中取100mg氧化石墨烯-殼聚糖復(fù)合物,溶于500ml無RNase酶水中,充分震蕩搖勻,在超聲波振蕩器中震蕩4-6h。然后加入500mg MPG多肽,37℃超聲乳化,靜置6h,然后透析提純,無酶水洗滌3遍,完全去除多余未反應(yīng)的MPG多肽,再進(jìn)行冷凍蒸干(-20℃),得到完整的氧化石墨烯-殼聚糖-MPG多肽(GO-CS-MPG)載體。
將制備所得的GO-CS-MPG進(jìn)行掃描電鏡分析發(fā)現(xiàn),單個(gè)GO呈單層片狀結(jié)構(gòu),殼聚糖CS以膜覆蓋的形式與GO相鏈接,且載體厚度較單個(gè)GO增加,而MPG多肽以桿狀、棒狀、鏈狀等結(jié)構(gòu)與GO-CS相連接。
將制備所得的GO-CS-MPG進(jìn)行TGA熱重分析發(fā)現(xiàn),氧化石墨烯GO約占40%,殼聚糖CS約占50%,MPG多肽約占10%。
將制備所得的GO-CS-MPG進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),隨著GO-CS-MPG濃度的增高,其對(duì)細(xì)胞有一定的毒性作用。但即使當(dāng)GO-CS-MPG濃度高達(dá) 320mg/L時(shí),細(xì)胞的相對(duì)生存率仍然能夠達(dá)到81%。這充分表明GO-CS-MPG載體與細(xì)胞的生物相容性良好,細(xì)胞毒性作用極低,對(duì)細(xì)胞活力幾乎無影響。
本發(fā)明不限于實(shí)施例的范圍,凡是通過氧化石墨烯、細(xì)胞穿膜肽等構(gòu)建此類既能搭載抗腫瘤藥物又能搭載抑癌基因的運(yùn)載體均在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。