本發(fā)明涉及從中藥植物中提取總黃酮的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種玫瑰花總黃酮提取純化工藝。

背景技術(shù)：

玫瑰花為薔薇科植物玫瑰（RosarugosaThunb）的干燥花蕾，其性味甘溫，歸肝、脾經(jīng)，具有行氣解郁，和血止痛之功效。玫瑰花含有揮發(fā)油、氨基酸、多糖類及多種黃酮類化合物， 其中的黃酮類成分具有抗癌、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗氧化等多種藥理活性。但是目前，從玫瑰花中提供總黃酮的工藝路線不成熟，主要表現(xiàn)為提取的有效成分總量不高（即純度低）、工藝路線不夠合理或工業(yè)化條件不具備等。如公開號為CN102796066A，名稱為一種黃酮類化合物及其制備方法與應(yīng)用，以玫瑰花為原料，經(jīng)浸膏提取、硅膠柱層析、石油醚～乙酸乙酯柱層析、高壓液相色譜分離步驟，具體為：取玫瑰花，粉碎，用90～99%乙醇超聲提取合并提取液、過濾，減壓濃縮成浸膏；浸膏用硅膠干法裝柱進(jìn)行硅膠柱層析；以體積配比為20:1～1:1的氯仿～甲醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，合并相同的部分；9:1部分用體積配比為9:1～0:1的石油醚～乙酸乙酯溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集各部分洗脫液并濃縮；7:3部分進(jìn)一步用高壓液相色譜分離純化即得所述的黃酮類化合物。該方法存在下述問題黃酮類化合物大多具有酚羥基，易溶于堿性水或稀醇（50%～70%）中，該方法采用90～99%乙醇提取，黃酮類物質(zhì)在其中溶解度較低， 且硅膠會對部分黃酮形成死吸附，造成產(chǎn)品損失，使得黃酮得率較低。

又如公開號為CN104083476A，名稱為一種玫瑰花提取物在制備抗抑郁藥物中的應(yīng)用及公開號為CN103417679A，名稱為一種玫瑰花中提取抗腦缺血物質(zhì)的方法及其應(yīng)用，是將玫瑰花干燥粉碎成粗粉，用石油醚回流萃取脫脂，棄去石油醚液，脫脂后的玫瑰花藥渣揮干石油醚，用乙醇浸泡回流提取，濾液減壓回收乙醇至無醇味，濃縮，濃縮液加蒸餾水分散；分散液上AB～8型大孔吸附樹脂，用蒸餾水洗脫，棄去水液；繼用乙醇洗脫，棄去洗脫液；再用乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇，干燥粉碎，即得，其總黃酮質(zhì)量含量為63%以上。如公開號為CN103006899A，名稱為一種枸杞子總黃酮的提取純化工藝、檢測方法及其應(yīng)用，提取工藝是枸杞子烘干粉碎、加乙醇，提取合并濾液、濃縮、萃取、得到枸杞子黃酮粗提液；提取純化工藝：采用大孔樹脂D101，對粗提液進(jìn)行純化，采用聚酰胺對黃酮進(jìn)一步的純化等，其黃酮純度只有42.8% 。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中玫瑰總黃酮提取純化工藝存在的純度和得率低的問題，提供一種方法合理、穩(wěn)定、生產(chǎn)周期短，適合工業(yè)化生產(chǎn)且得到的總黃酮純度高的玫瑰花總黃酮的提取純化工藝。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

玫瑰花總黃酮提取純化工藝，包括下述步驟：

A、取玫瑰花干燥藥材，粉碎后，加入乙醇回流提取，提取液過濾，備用；

B、將步驟A得到的提取液除去乙醇，得到一次濃縮液，一次濃縮液加入到AB ～8型大孔樹脂中，依次經(jīng)水、5～10%乙醇洗至水澄清，乙醇顏色較淺，最后用80～85%乙醇洗脫，洗脫液除去乙醇，得二次濃縮液；

C、將步驟B中得到的二次濃縮液倒入裝好的聚酰胺柱中，依次用水、5～10%乙醇洗至水澄清，乙醇顏色較淺，最后用70～75%乙醇洗脫，洗脫液濃縮至干，得玫瑰花總黃酮粗品；

D、將步驟C中得到的玫瑰花總黃酮粗品用甲醇溶解，用聚酰胺拌樣、干燥得樣品，然后將樣品干法上樣到柱層析聚酰胺為填料，二氯甲烷和甲醇為溶劑濕法裝柱的柱子上，采用二氯甲烷：甲醇為 10：1～1：1的比例進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)TLC點板收集含總黃酮的洗脫液，洗脫液濃縮至干得純化玫瑰花總黃酮；

E、將步驟D得到的純化玫瑰花總黃酮用甲醇溶解后過濾，濾液到入C18柱中，以20%～70%的甲醇溶液為溶劑，在254nm波長下梯度洗脫，收集含黃酮部分洗脫液，回收甲醇并濃縮，將濃縮液用C18柱富集，然后用甲醇解析，收集甲醇解析液，解析液除去甲醇并濃縮至干得玫瑰花總黃酮。

進(jìn)一步的，所述工藝還包括將步驟E得到的玫瑰花總黃酮再次按照步驟D操作進(jìn)行處理，即步驟E得到的玫瑰花總黃酮用甲醇溶解，用聚酰胺拌樣、干燥得樣品，然后將樣品干法上樣到柱層析聚酰胺為填料，二氯甲烷和甲醇為溶劑濕法裝柱的柱子上，采用二氯甲烷：甲醇為 10：1～1：1的比例進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)TLC點板收集含總黃酮的洗脫液，洗脫液濃縮至干。

優(yōu)選的，在步驟A中，所述乙醇的加入量為玫瑰花藥材重量的5～15倍，所述乙醇的體積濃度為70～75%，回流提取2～3次，每次1.5～2小時。

在步驟D中，所述柱層析聚酰胺用量為玫瑰花總黃酮粗品總重80～120倍。

在步驟D中，所述濕法裝柱時用二氯甲烷和甲醇的體積比為10:1。

在步驟D中，采用二氯甲烷：甲醇為10：1～1：1比例進(jìn)行梯度洗脫的過程為 10：1流動相洗脫15L，8：1流動相洗脫10L，6：1流動相洗脫10L，3：1流動相洗脫10L，1：1流動相洗脫15L，TLC點板收集黃酮反應(yīng)的洗脫液部分。

在步驟E中， 20%～70%的甲醇溶液梯度洗脫的過程為使用二元泵梯度制備，每2min分段收集，通過TLC點板檢測，收集黃酮反應(yīng)的洗脫液。

在步驟E中，所述解析用甲醇濃度為90%。

提取純化得到的玫瑰花總黃酮可按照下述步驟檢測：

A儀器與試劑

儀器：紫外～可見分光光度儀

試劑：蘆丁對照品，甲醇，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉；

B溶液制備

A、對照品貯備液制備：精密稱取蘆丁對照品50mg，置于25ml容量瓶中，加甲醇適量，置水浴上微熱溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻。精密量取10ml，置100ml容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得（每1ml中含蘆丁0.2mg）；

B、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密量取對照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml，分別置于25ml容量瓶中，各加水至6.0ml，加5%亞硝酸鈉溶液1ml，混勻，放置6分鐘，加氫氧化鈉試液10ml，再加水至刻度，搖勻，放置15分鐘，以相應(yīng)試劑為空白，使用紫外～可見分光光度儀，在500nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A=8.1046C+0.0113,相關(guān)系數(shù)γ=0.9985。

C、供試品溶液制備：精密稱取樣品40mg，置10ml量瓶中，加入甲醇適量，在水浴上微熱溶解，放冷，加甲醇至刻度，后置于1000ml量瓶中，加水至刻度線，搖勻，即得；

D、空白溶液制備：以相應(yīng)溶液作為空白；

C、樣品測定

精密吸取供試品溶液3ml，置于25ml容量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下的方法，加水至6.0ml，加5%亞硝酸鈉溶液1ml，混勻，放置6分鐘，加氫氧化鈉試液10ml，再加水至刻度，搖勻，放置15分鐘，以相應(yīng)試劑為空白，使用紫外～可見分光光度儀，在500nm波長處測定吸光度，總黃酮含量以蘆丁計算；

D結(jié)果計算

從回歸方程計算供試品溶液中總黃酮的含量。采用該方法檢測本發(fā)明方法提取純化的玫瑰花總黃酮，總黃酮含量以蘆丁計算大于等于90%。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明將玫瑰花干燥藥材的提取液依次經(jīng)過AB-8大孔樹脂、聚酰胺柱、柱層析聚酰胺、C18柱這一特定的分離純化步驟，從而制備出含量達(dá)90%以上的玫瑰花總黃酮，為藥材資源的充分利用及提高其應(yīng)用價值提供科學(xué)的依據(jù)。

2、本發(fā)明設(shè)計合理，工藝合理、穩(wěn)定、可行，采用本發(fā)明方法提取，純化玫瑰花中總黃酮、分離速度快，生產(chǎn)周期短，適合工業(yè)化生產(chǎn)，有很好的應(yīng)用前景。

2、本發(fā)明將提取液濃縮后加入到AB-8大孔樹脂總，并依次用水和低濃度乙醇洗，除去了水溶性色素及雜質(zhì)如糖類，除去去大極性的色素及雜質(zhì)，且都不會將目標(biāo)物洗脫下來；方便后續(xù)聚酰胺和C18分離，降低對填料的污染； AB-8型大孔樹脂，是一種吸附范圍較廣的填料，能吸附大部分的色素及雜質(zhì)。

3、本發(fā)明將經(jīng)過AB-8型大孔樹脂后進(jìn)一步用聚酰胺柱子處理，聚酰胺填料對黃酮類物質(zhì)有較專一的分離效果，為了提高分離純化效率，采用高濃度乙醇洗脫前先用水和低濃度乙醇洗，先除色素和雜質(zhì)，只需經(jīng)過依次洗脫，就能使高比例洗脫下的黃酮類物質(zhì)部分更純，更方便下一步正相洗脫，同時避免雜質(zhì)、多糖等物質(zhì)對后續(xù)分離柱污染和堵塞。

4、本發(fā)明將樣品采用聚酰胺拌樣可以使總黃酮粗品均勻的分散被吸附在聚酰胺上，加入流動相洗脫時，樣品溶解均勻，使得梯度洗脫時雜質(zhì)與產(chǎn)品分布更均勻、集中，達(dá)到有效分離；拌樣后干燥使樣品中的甲醇完全揮發(fā)，讓聚酰胺拌樣中不含甲醇，避免在梯度洗脫初期低極性有機溶劑洗脫時改變流動相極性，而造成雜質(zhì)與產(chǎn)品分離不好。

5、本發(fā)明將經(jīng)過AB-8大孔樹脂、聚酰胺柱、柱層析聚酰胺處理的玫瑰提取物進(jìn)一步用C18柱處理，能定向得到大部分黃酮類物質(zhì)使黃酮含量有較大提高，且分離時間較短，而且能明確其中的一種或幾種黃酮物質(zhì)，有利于其進(jìn)一步開發(fā)。

6、本發(fā)明將經(jīng)過AB-8大孔樹脂、聚酰胺柱、柱層析聚酰胺、C18柱處理后的玫瑰提取物重新經(jīng)過柱層析聚酰胺處理，不但能進(jìn)一步提高總黃酮的純度，將黃酮含量提高到90%以上；且能提高總黃酮的收率，操作更加簡便快速。

具體實施方式

實施例1

玫瑰花總黃酮提取純化工藝，包括下述步驟：

A、取玫瑰花干燥藥材，粉碎后，加入玫瑰花干燥藥材重量5倍的70%乙醇回流提取3次，每次2小時，提取液過濾，合并濾液；

B、將步驟A得到的提取液除去乙醇，得到一次濃縮液，一次濃縮液加入到AB ～8型大孔樹脂中，依次經(jīng)水、10%乙醇洗至水澄清，乙醇顏色較淺，最后用80%乙醇洗脫，洗脫液除去乙醇，得二次濃縮液；

C、將步驟B中得到的二次濃縮液倒入裝好的聚酰胺柱中，依次用水、10%乙醇洗至水澄清，乙醇顏色較淺，最后用70%乙醇洗脫，洗脫液濃縮至干，得玫瑰花總黃酮粗品；

D、將步驟C中得到的玫瑰花總黃酮粗品用甲醇溶解，甲醇的加入量以玫瑰花總黃酮粗品全部溶解為好，溶解后用聚酰胺拌樣、干燥得樣品，然后將樣品干法上樣到柱層析聚酰胺為填料，二氯甲烷和甲醇為溶劑濕法裝柱的柱子上，采用二氯甲烷：甲醇為10：1～1：1的比例進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)TLC點板收集含總黃酮的洗脫液，洗脫液濃縮至干得純化玫瑰花總黃酮；

E、將步驟D得到的純化玫瑰花總黃酮用甲醇溶解后過濾，濾液到入C18柱中，以20%～70%的甲醇溶液為溶劑，在254nm波長下梯度洗脫，收集含黃酮部分洗脫液，回收甲醇并濃縮，將濃縮液用C18柱富集，然后用甲醇解析，收集甲醇解析液，解析液除去甲醇并濃縮至干得玫瑰花總黃酮。

測定并計算計算，本實施例玫瑰花總黃酮提取物中總黃酮含量以蘆丁計算總黃酮含量為90.10%。

實施例2

本實施例與實施例1的區(qū)別在于：本實施例還包括將步驟E得到的玫瑰花總黃酮再一次按照步驟D過程進(jìn)行處理，即用甲醇溶解，用聚酰胺拌樣、干燥得樣品，然后將樣品干法上樣到柱層析聚酰胺為填料，二氯甲烷和甲醇為溶劑濕法裝柱的柱子上，采用二氯甲烷：甲醇為10：1～1：1的比例進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)TLC點板收集含總黃酮的洗脫液，洗脫液濃縮至干。其中，該步驟中，所述柱層析聚酰胺用量為玫瑰花總黃酮粗品總重120倍。所述濕法裝柱時用二氯甲烷和甲醇的體積比為10:1。

測定并計算計算，本實施例玫瑰花總黃酮提取物中總黃酮含量以蘆丁計算總黃酮含量為91.16%

實施例3

玫瑰花總黃酮提取純化工藝，包括下述步驟：

A、取玫瑰花干燥藥材，粉碎后，加入玫瑰花干燥藥材重量10倍的75%乙醇回流提取3次，每次2小時，提取液過濾，合并濾液；

B、將步驟A得到的提取液除去乙醇，得到一次濃縮液，一次濃縮液加入到AB ～8型大孔樹脂中，依次經(jīng)水、5%乙醇洗至水澄清，乙醇顏色較淺，最后用85%乙醇洗脫，洗脫液除去乙醇，得二次濃縮液；

C、將步驟B中得到的二次濃縮液倒入裝好的聚酰胺柱中，依次用水、5%乙醇洗至水澄清，乙醇顏色較淺，最后用75%乙醇洗脫，洗脫液濃縮至干，得玫瑰花總黃酮粗品；

D、將步驟C中得到的玫瑰花總黃酮粗品用甲醇溶解，用聚酰胺拌樣、干燥得樣品，然后將樣品干法上樣到柱層析聚酰胺為填料，二氯甲烷和甲醇為溶劑濕法裝柱的柱子上，采用二氯甲烷：甲醇為10：1～1：1的比例進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)TLC點板收集含總黃酮的洗脫液，洗脫液濃縮至干得純化玫瑰花總黃酮；

E、將步驟D得到的純化玫瑰花總黃酮用甲醇溶解后過濾，濾液到入C18柱中，以20%～70%的甲醇溶液為溶劑，在254nm波長下梯度洗脫，收集含黃酮部分洗脫液，回收甲醇并濃縮，將濃縮液用C18柱富集，然后用甲醇解析，收集甲醇解析液，解析液除去甲醇并濃縮至干得玫瑰花總黃酮。

F、將步驟E得到的玫瑰花總黃酮用甲醇溶解，用聚酰胺拌樣、干燥得樣品，然后將樣品干法上樣到柱層析聚酰胺為填料，二氯甲烷和甲醇為溶劑濕法裝柱的柱子上，采用二氯甲烷：甲醇梯度洗脫，根據(jù)TLC點板收集含總黃酮的洗脫液，洗脫液濃縮至干得玫瑰花總黃酮成品。

上述步驟D和F中，所述柱層析聚酰胺用量為玫瑰花總黃酮粗品總重80倍。所述濕法裝柱時用二氯甲烷和甲醇的體積比為10:1。

在步驟E中，所述解析用甲醇濃度為90%。

測定并計算計算，本實施例玫瑰花總黃酮提取物中總黃酮含量以蘆丁計算總黃酮含量為93.15%。

實施例4

玫瑰花總黃酮的提取純化工藝，包括下述步驟：A、取玫瑰花干燥藥材，粉碎后，加入玫瑰花干燥藥材重量15倍的70%乙醇回流提取3次，每次2小時，提取液過濾，合并濾液；

B、將步驟A得到的提取液除去乙醇，得到一次濃縮液，一次濃縮液加入到AB ～8型大孔樹脂中，依次經(jīng)水、8%乙醇洗至水澄清，乙醇顏色較淺，最后用80%乙醇洗脫，洗脫液除去乙醇，得二次濃縮液；

C、將步驟B中得到的二次濃縮液倒入裝好的聚酰胺柱中，依次用水、8%乙醇洗至水澄清，乙醇顏色較淺，最后用72%乙醇洗脫，洗脫液濃縮至干，得玫瑰花總黃酮粗品；

D、將步驟C中得到的玫瑰花總黃酮粗品用甲醇溶解，用聚酰胺拌樣、干燥得樣品，然后將樣品干法上樣到柱層析聚酰胺為填料，二氯甲烷和甲醇為溶劑濕法裝柱的柱子上，采用二氯甲烷：甲醇為10：1～1：1的比例進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)TLC點板收集含總黃酮的洗脫液，洗脫液濃縮至干得純化玫瑰花總黃酮；

E、將步驟D得到的純化玫瑰花總黃酮用甲醇溶解后過濾，濾液到入C18柱中，以20%～70%的甲醇溶液為溶劑，在254nm波長下梯度洗脫，收集含黃酮部分洗脫液，回收甲醇并濃縮，將濃縮液用C18柱富集，然后用甲醇解析，收集甲醇解析液，解析液除去甲醇并濃縮至干得玫瑰花總黃酮。

F、將步驟E得到的玫瑰花總黃酮用甲醇溶解，用聚酰胺拌樣、干燥得樣品，然后將樣品干法上樣到柱層析聚酰胺為填料，二氯甲烷和甲醇為溶劑濕法裝柱的柱子上，采用二氯甲烷：甲醇梯度洗脫，根據(jù)TLC點板收集含總黃酮的洗脫液，洗脫液濃縮至干得玫瑰花總黃酮成品。

上述步驟D和F中，所述柱層析聚酰胺用量為玫瑰花總黃酮粗品總重100倍。所述濕法裝柱時用二氯甲烷和甲醇的體積比為10:1。

在步驟E中，所述解析用甲醇濃度為90%。

測定并計算計算，本實施例玫瑰花總黃酮提取物中總黃酮含量以蘆丁計算總黃酮含量為91.50%。

上述實施例1-4中，在步驟D中，采用二氯甲烷：甲醇為10：1～1：1比例進(jìn)行梯度洗脫的過程為10：1流動相洗脫15L，8：1流動相洗脫10L，6：1流動相洗脫10L，3：1流動相洗脫10L，1：1流動相洗脫15L，TLC點板收集黃酮反應(yīng)的洗脫液部分。在步驟E中， 20%～70%的甲醇溶液梯度洗脫的過程為使用二元泵梯度制備，每2min分段收集，通過TLC點板檢測，收集黃酮反應(yīng)的洗脫液。