本發(fā)明涉及藥物制劑領(lǐng)域，具體涉及一種肝素修飾的陽離子脂質(zhì)體，本發(fā)明還公開了這種肝素修飾的陽離子脂質(zhì)體的制備方法。

背景技術(shù)：

陽離子脂質(zhì)體具有無免疫原性、可生物降解、可重復(fù)轉(zhuǎn)染等特性，一直受到相關(guān)研究者的重視，至今已有數(shù)十種陽離子脂質(zhì)體被研制出來。但研究表明，單獨(dú)使用陽離子脂質(zhì)體具有一定的風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物靜脈注射給予陽離子脂質(zhì)體后，傾向于與血漿蛋白或血細(xì)胞聚合，并通過靜電作用附著于血管內(nèi)皮細(xì)胞上，因此導(dǎo)致其從血液中快速消除或定位于肺部，增加肺栓塞的危險(xiǎn)。陽離子脂質(zhì)體的另一個(gè)毒性表現(xiàn)為免疫反應(yīng)，Zelphati等的試驗(yàn)結(jié)果顯示陽離子脂質(zhì)可以激活血清中的補(bǔ)體系統(tǒng)，補(bǔ)體系統(tǒng)激活后可以促進(jìn)補(bǔ)體成分與脂質(zhì)體的結(jié)合，因而會(huì)被肺部或肝臟補(bǔ)體成分受體所識(shí)別，導(dǎo)致陽離子脂質(zhì)體快速地從血流中清除而被肺或肝臟所攝取。采用親水性的材料結(jié)合陽離子脂質(zhì)體，對陽離子脂質(zhì)體實(shí)施保護(hù)，可以大大降低陽離子脂質(zhì)體引起的體內(nèi)安全性風(fēng)險(xiǎn)。

肝素是一種酸性的粘多糖，極易溶于水。肝素作為理想的陽離子脂質(zhì)體修飾材料的優(yōu)勢主要集中體現(xiàn)在兩個(gè)方面：首先，肝素可以代替PEG作為藥物載體的親水性修飾材料，用于構(gòu)建膠束、脂質(zhì)體等。親水性材料PEG常用于載體修飾，以達(dá)到長循環(huán)的目的。但是，PEG修飾的載體在體內(nèi)中也存有諸多弊端和一些不能忽視的問題，如靜脈重復(fù)注射PEG化脂質(zhì)體可加速血液清除，從而大大限制了其臨床應(yīng)用。肝素作為修飾材料，具有類PEG化的作用，修飾后的載體表現(xiàn)出更為出色的穩(wěn)定性、安全性。其次，有研究表明肝素或肝素類似物可以通過成纖維細(xì)胞生長因子受體內(nèi)吞進(jìn)入腫瘤和腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞。因此，肝素修飾的陽離子載藥脂質(zhì)體可賦予藥物載體一定的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞靶向性，提高治療效果。

本發(fā)明是在構(gòu)建陽離子脂質(zhì)體的基礎(chǔ)上，通過共價(jià)鍵連接的方式結(jié)合肝素，得到肝素修飾的陽離子脂質(zhì)體。本發(fā)明的肝素修飾的陽離子脂質(zhì)體，體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)證明，肝素修飾的陽離子脂質(zhì)體能顯著提高陽離子脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。載體溶血性實(shí)驗(yàn)證明，修飾肝素后，陽離子脂質(zhì)體的安全性得到提高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的肝素修飾的陽離子脂質(zhì)體，含下列組分及重量比：

本發(fā)明的肝素修飾的陽離子脂質(zhì)體的制備方法包括：將蛋黃卵磷脂、膽固醇、陽離子材料、藥物溶于有機(jī)溶劑，減壓蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑；活化劑活化肝素，備用；將活化后的肝素溶液加入制備的陽離子脂質(zhì)體中室溫反應(yīng)過夜；超濾除去游離的肝素，即得肝素修飾的陽離子脂質(zhì)體混懸液；制備成凍干粉針劑時(shí)，將凍干保護(hù)劑溶解于脂質(zhì)體混懸液中，冷凍干燥即可。

上述陽離子材料選自氯化三甲基-2，3-二油烯氧基丙基銨、溴化三甲基-2，3-二油酰氧基丙基銨、三氟乙酸二甲基-2，3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基銨、溴化三甲基十二烷基銨、溴化三甲基十四烷基銨、溴化三甲基十六烷基銨、溴化二甲基雙十八烷基銨、N-(2-精胺甲?；?-N’，N’-雙十八烷基甘氨酰胺、1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油膽堿酯、3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲?；鵠膽固醇、脂質(zhì)多聚-L-賴氨酸、硬脂胺中的一種或幾種。

上述凍干保護(hù)劑選自蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇中的一種或幾種。

上述藥物可以是姜黃素及其衍生物的一種或幾種的混合物。

上述有機(jī)溶劑選自氯仿、二氯甲烷、乙醚、乙醇、丙酮中的一種或幾種，優(yōu)選二氯甲烷、氯仿。

上述活化劑選自1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽與N-羥基硫代琥珀酰亞胺的混合物，兩者比例為1∶2-1∶6。

上述肝素選自普通肝素、達(dá)肝素鈉、依諾肝素、納肝素鈣、帕肝素鈉、汀肝素鈉中的一種或幾種。

本發(fā)明所涉及的比例均為重量比。

當(dāng)膽固醇取一個(gè)固定值，蛋黃卵磷脂取不同的重量時(shí)，肝素修飾的陽離子脂質(zhì)體混懸液的平均粒徑和包封率也不同。結(jié)果見表1。

表1：藥物和蛋黃卵磷脂的比例對脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響(n＝3)

從表中可以看出，當(dāng)藥物和蛋黃卵磷脂重量比小于1∶5時(shí)，粒徑較大，包封率很低；當(dāng)藥物：磷脂重量比大于1∶35時(shí)，脂質(zhì)體溶液的透光性下降，粒徑逐漸增大，放置越久越不穩(wěn)定；當(dāng)藥物和大豆卵磷脂重量比在1∶5～35范圍內(nèi)，包封率較高，粒徑符合要求，因此本發(fā)明中藥物/蛋黃卵磷脂的比例為1∶5～35。

當(dāng)?shù)包S卵磷脂取一個(gè)固定值，膽固醇取不同的重量時(shí)，肝素修飾的陽離子脂質(zhì)體混懸液的平均粒徑和包封率也不同。結(jié)果見表2。

表2：藥物和膽固醇的比例對脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響(n＝3)

從表中可以看出，藥物和膽固醇的重量比小于1∶0.5時(shí)，粒徑較大，包封率很低；當(dāng)藥物和膽固醇的重量比大于1∶7時(shí)，包封率較低，且放置片刻即絮凝，當(dāng)藥物和膽固醇的重量比例在1∶0.5～7范圍內(nèi)，粒徑和包封率均較好，因此本發(fā)明中藥物/膽固醇的比例在1∶0.5～7。

上述方法制備的肝素修飾的陽離子脂質(zhì)體混懸液電位在2-5mV。

本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)在于：肝素修飾陽離子脂質(zhì)體后，顯著提高陽離子脂質(zhì)體的血漿穩(wěn)定性，降低陽離子脂質(zhì)體的溶血率，提高載體安全性，可以作為抗腫瘤藥的有效載體，具有靶向到腫瘤及腫瘤新生血管的功能，提高藥物療效。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的肝素修飾的陽離子脂質(zhì)體血清穩(wěn)定性結(jié)果

圖2是本發(fā)明的肝素修飾的陽離子脂質(zhì)體溶血率結(jié)果

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。但是本發(fā)明不限于所給出的例子。下述實(shí)施例中的試驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；試劑和材料，如無特殊說明，均可通過商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1肝素修飾的陽離子脂質(zhì)體

分別稱取處方量的蛋黃卵磷脂10mg、膽固醇1mg、雙十八烷基二甲基溴化銨1mg、姜黃素1mg置于茄形瓶中，加入適量二氯甲烷，超聲使之完全溶解；旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，在瓶壁上形成干燥均勻的脂質(zhì)薄膜；加入蒸餾水溶液1mL洗膜，37℃下水合1h，形成脂質(zhì)體初乳液；探頭超聲(200W，100次)，即得空白脂質(zhì)體；加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽與N-羥基硫代琥珀酰亞胺至依諾肝素溶液中，比例為1∶3，活化依諾肝素；取陽離子脂質(zhì)體溶液與等體積的活化后依諾肝素溶液(4mg/mL)室溫?cái)嚢柽^夜；超濾法去除游離的肝素，即得肝素修飾的陽離子脂質(zhì)體溶液；再將上述溶液中加入適量蔗糖，無菌過濾后(膜濾器孔徑0.2μm)，將續(xù)濾液分裝于西林瓶中，冷凍干燥即可。

成品性狀：本品為疏松不塌陷粘連的固態(tài)。

復(fù)水分散性：本品在注射用溶劑如生理鹽水中輕微震蕩，10s內(nèi)即可迅速形成均一、穩(wěn)定、透光性好的混懸液。

粒徑測定：取本品適量用采用激光粒度分析儀測定粒徑，平均粒徑為140.9nm，多分散系數(shù)為0.265。

電位測定：取本品適量用采用激光粒度分析儀測定電位，平均電位為3.4mV，多分散系數(shù)為0.743。

實(shí)施例2肝素修飾的陽離子脂質(zhì)體

分別稱取處方量的蛋黃卵磷脂15mg、膽固醇2mg、硬脂胺1mg、一脫甲氧基姜黃素1mg，置于茄形瓶中，加入適量氯仿，超聲使之完全溶解；旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，在瓶壁上形成干燥均勻的脂質(zhì)薄膜；加入蒸餾水溶液1mL洗膜，37℃下水合1h，形成脂質(zhì)體初乳液，探頭超聲(200W，100次)，即得空白脂質(zhì)體。取上述空白脂質(zhì)體加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽與N-羥基硫代琥珀酰亞胺至普通肝素溶液中，比例為1∶2，活化普通肝素；取陽離子脂質(zhì)體溶液與等體積的活化后普通肝素溶液(4mg/mL)室溫?cái)嚢柽^夜；超濾法去除游離的肝素，即得肝素修飾的陽離子脂質(zhì)體溶液；再將上述溶液中加入適量葡萄糖，無菌過濾后(膜濾器孔徑0.2μm)，將續(xù)濾液分裝于西林瓶中，冷凍干燥即可。

將凍干脂質(zhì)體在4℃環(huán)境貯存3個(gè)月后，粒徑為152.4nm，電位為4.7mV。

實(shí)施例3肝素修飾的陽離子脂質(zhì)體

分別稱取處方量的蛋黃卵磷脂20mg、膽固醇1.5mg、溴化三甲基十六烷基銨1mg雙脫甲氧基姜黃素1mg置于茄形瓶中，加入適量甲醇，超聲使之完全溶解；旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，在瓶壁上形成干燥均勻的脂質(zhì)薄膜；加入蒸餾水溶液1mL洗膜，37℃下水合1h，形成脂質(zhì)體初乳液，探頭超聲(200W，100次)，即得空白脂質(zhì)體；取上述空白脂質(zhì)體加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽與N-羥基硫代琥珀酰亞胺至達(dá)肝素溶液中，比例為1∶4，取陽離子脂質(zhì)體溶液與等體積的達(dá)肝素鈉溶液(4mg/mL)孵育30min，25℃；超濾法去除游離的肝素，即得肝素修飾的陽離子脂質(zhì)體溶液；再將上述溶液中加入適量乳糖，無菌過濾后(膜濾器孔徑0.2μm)，將續(xù)濾液分裝于西林瓶中，冷凍干燥即可。

將凍干脂質(zhì)體在4℃環(huán)境貯存3個(gè)月后，粒徑為156.9nm，電位為2.1mV。

實(shí)施例4陽離子脂質(zhì)體血清穩(wěn)定性考察

取陽離子脂質(zhì)體溶液和肝素修飾的陽離子脂質(zhì)體溶液，各500μL置于2mL離心管中與1mL的胎牛血清混合；水浴37℃放置1、6、12、24小時(shí)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)拿出，使用Zetaplus電位及激光粒度分析儀進(jìn)行粒徑檢測，直至24小時(shí)。

實(shí)施例5陽離子脂質(zhì)體體外溶血率考察

取新鮮的家兔抗凝全血(內(nèi)部涂肝素鈉溶液)5mL，攪拌去除纖維蛋白凝塊，加0.9％氯化鈉注射用生理鹽水，充分混勻后分裝于5mL離心管內(nèi)，1500r/min離心4min，棄去上清液，重復(fù)前述操作5次，直至上清液基本無色；剩余的血紅細(xì)胞用生理鹽水配成2％(v/v)的血紅細(xì)胞懸液，4℃保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。取陽離子脂質(zhì)體溶液和肝素修飾的陽離子脂質(zhì)體溶液，置于2.5mL離心管中，加入等體積的2％(v/v)血紅細(xì)胞懸液混勻，于37℃下振蕩中孵育20h；另取2％(v/v)的血紅細(xì)胞懸液2.5mL，分別加入等體積的去離子水和生理鹽水混勻，作為陽性對照和陰性對照；將孵育后樣品以1500r/min離心10min，取上清液，用紫外-可見光分光光度計(jì)于λ＝540nm測定吸光度，計(jì)算溶血率。