本發(fā)明涉及中藥制劑制備領(lǐng)域，具體涉及一種具有逆轉(zhuǎn)大腸癌多藥耐藥作用的中藥復(fù)方制劑及其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近幾年，癌癥的發(fā)病率和死亡率仍然很高，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，癌癥已成為居民死亡的第二位死因，在城市居民中居首位。全球癌癥發(fā)病率在我國和英國，法國，高于大多數(shù)亞洲國家。肝癌、結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌死亡率呈明顯上升趨勢(shì)，肺癌一直是我國惡性腫瘤死因的首位(占全國惡性腫瘤死亡的22.7％)。

腫瘤的主要治療方法有外科手術(shù)治療，放化療，介入治療，其它：如生物、基因、中醫(yī)藥療法，多作為輔助應(yīng)用活尚待發(fā)展。常用的手術(shù)療法適用于腫瘤方面較好，早期的沒有轉(zhuǎn)移與重要臟器大血管物粘連，但中晚期效果則不如早期。中晚期則多采取放化療治療，常用的藥物有5-FU(5氟尿嘧啶)，順鉑(DDP)，阿霉素(ADR)，長(zhǎng)春新堿(VCR)等，而在治療過程中產(chǎn)生的多藥耐藥(multidurg resistance，MDR)現(xiàn)象是造成化療失敗的主要因素。研究發(fā)現(xiàn)，癌癥患者中90％以上是由于腫瘤細(xì)胞對(duì)化療耐藥發(fā)生多藥耐藥性而死亡。MDR作用于機(jī)體的機(jī)制非常復(fù)雜，是指誘發(fā)于一種化療藥物，而同時(shí)對(duì)其他多種分子結(jié)構(gòu)與機(jī)制完全不同的抗癌藥物產(chǎn)生交叉耐藥，為目前化療失敗的主要原因。因此，從克服MDR逆轉(zhuǎn)多藥耐藥現(xiàn)象的措施和機(jī)制，已成國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)，涉及到P-糖蛋白(P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)與肺耐藥蛋白(LRP)表達(dá)增加；谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)活性DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(Topo II)含量減少以及性質(zhì)改變。近年來也發(fā)現(xiàn)了多種化學(xué)逆轉(zhuǎn)劑，例如：環(huán)孢素A(CsA)、三苯氧胺、維拉帕米(vRP)等，但都存在體內(nèi)應(yīng)用可引起不同程度的不良反應(yīng)或逆轉(zhuǎn)效果不佳、作用靶點(diǎn)單一等問題，從而限制了臨床應(yīng)用。

現(xiàn)在從實(shí)驗(yàn)到臨床應(yīng)用其中毒性的問題是當(dāng)前最重要的障礙，另一方面化療藥物動(dòng)力學(xué)的改變導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)劑毒性的增加。因此化療逆轉(zhuǎn)劑的選擇早已成為介導(dǎo)的耐藥現(xiàn)象的重要環(huán)節(jié)。我國中藥資源豐富，而大部分中藥有抗腫瘤作用，在傳統(tǒng)的中藥篩選MDR逆轉(zhuǎn)劑有巨大的潛力，它的不良反應(yīng)少，同時(shí)在耐藥性的逆轉(zhuǎn)，殺死腫瘤細(xì)胞，調(diào)節(jié)和改善人體的免疫功能的多重效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具有逆轉(zhuǎn)大腸癌多藥耐藥作用的中藥復(fù)方制劑及其制備方法及應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種具有逆轉(zhuǎn)大腸癌多藥耐藥作用的中藥復(fù)方制劑，由人參、薏苡仁、莪術(shù)、喜樹果、鴉膽子制備所得，所述人參、薏苡仁、莪術(shù)、喜樹果、鴉膽子的質(zhì)量比為3∶2∶1∶0.5-1∶0.5-1。

本發(fā)明還提供了一種具有逆轉(zhuǎn)大腸癌多藥耐藥作用的中藥復(fù)方制劑的制備方法，包括如下步驟：

S1、按權(quán)利要求1所述的比例稱取各組分，稱取處方量的人參用70％乙醇回流提取2次，每次2小時(shí)，合并提取液，回收乙醇，剩余液加入藥學(xué)上可接受的增溶劑或潛溶劑制備成溶液；

S2、處方量的莪術(shù)用水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油，加藥學(xué)上可接受的乳化劑制備成乳液；

S3、將喜樹果、鴉膽子打碎后與薏苡仁、步驟S1和S2所得的藥渣混合后，加入8倍水煎煮提取3次，每次1小時(shí)，合并提取液，濃縮，加適量乙醇至含醇量達(dá)70％(w/w)，靜置24小時(shí)，收集上清液備用；

S4、將所得上清液回收乙醇，剩余液與步驟S1所得的溶液、步驟S2所得的乳液混合，加少許尼泊金乙酯，調(diào)PH值6-7，加純化水定容，得成品。

上述具有逆轉(zhuǎn)大腸癌多藥耐藥作用的中藥復(fù)方制劑可作為多藥耐藥大腸癌聯(lián)合化療藥劑使用。

上述具有逆轉(zhuǎn)大腸癌多藥耐藥作用的中藥復(fù)方制劑及其藥學(xué)上可接受的輔料制備的其他制劑形式(丸劑、散劑、顆粒劑、沖劑、口服液、膠囊劑、軟膠囊、片劑、水劑等劑型)。

上述具有逆轉(zhuǎn)大腸癌多藥耐藥作用的中藥復(fù)方及在其基礎(chǔ)上進(jìn)行的拆方研究或獲得有效部位藥物等

本發(fā)明具有以下有益效果：

1、獲得一個(gè)研究證明具有逆轉(zhuǎn)大腸癌多藥耐藥作用的有效組方；2、實(shí)現(xiàn)聯(lián)合用藥提高臨床療效；3、將組方進(jìn)一步研究的權(quán)利，包括開發(fā)相關(guān)制劑，包括(丸劑、散劑、顆粒劑、沖劑、口服液、膠囊劑、軟膠囊、片劑、水劑等劑型的研發(fā))4、對(duì)組方拆方研究的權(quán)利，獲得部位藥。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例的制備工藝流程圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例中細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例中不同濃度本發(fā)明所得制劑含藥血清對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞存活率的影響。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例中P-gp的表達(dá)。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例子中LRP的表達(dá)。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例中MRP1的表達(dá)。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例中COX2的表達(dá)。

圖8為本發(fā)明實(shí)施例中β-actin的表達(dá)。

圖中：1.表示HCT-8/VCR+20％胎牛血清，2.HCT-8/VCR+20％大鼠空白血清，3.HCT-8/VCR+20％含藥血清。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種具有逆轉(zhuǎn)大腸癌多藥耐藥作用的中藥復(fù)方制劑，由人參、薏苡仁、莪術(shù)、喜樹果、鴉膽子制備所得，所述人參、薏苡仁、莪術(shù)、喜樹果、鴉膽子的質(zhì)量比為3∶2∶1∶0.5-1∶0.5-1。

本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種具有逆轉(zhuǎn)大腸癌多藥耐藥作用的中藥復(fù)方制劑的制備方法，包括如下步驟：

S1、按權(quán)利要求1所述的比例稱取各組分，稱取處方量的人參用70％乙醇回流提取2次，每次2小時(shí)，合并提取液，回收乙醇，剩余液加入藥學(xué)上可接受的增溶劑或潛溶劑制備成溶液；

S2、處方量的莪術(shù)用水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油，加藥學(xué)上可接受的乳化劑制備成乳液；

S3、將喜樹果、鴉膽子打碎后與薏苡仁、步驟S1和S2所得的藥渣混合后，加入8倍水煎煮提取3次，每次1小時(shí)，合并提取液，濃縮，加適量乙醇至含醇量達(dá)70％(w/w)，靜置24小時(shí)，收集上清液備用；

S4、將所得上清液回收乙醇，剩余液與步驟S1所得的溶液、步驟S2所得的乳液混合，加少許尼泊金乙酯，調(diào)PH值6-7，加純化水定容，得成品。

逆轉(zhuǎn)多要耐藥作用及機(jī)制

按照血清藥理學(xué)的研究方法進(jìn)行，制備含藥血清

采用大鼠灌服本發(fā)明所得制劑連續(xù)5天，末次給藥后1h，制備含藥血清。細(xì)胞株生長(zhǎng)曲線測(cè)定

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好接近匯合的人大腸癌細(xì)胞株HCT-8與耐長(zhǎng)春新堿細(xì)胞株HCT-8/V(HCT-8、HCT-8V)，用胰酶消化，經(jīng)精確計(jì)數(shù)后分別將細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞數(shù)1×10⁴/mL作傳代培養(yǎng)接種細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)24h后開始計(jì)數(shù)，24h/次，共計(jì)7天，HCT-8與HCT-8V細(xì)胞株每天取3個(gè)平行孔進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞均值，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞數(shù)/mL)為縱軸，連接成曲線后即為該細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

本發(fā)明所得制劑含藥血清對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8體外最大無毒劑量的測(cè)定。

細(xì)胞抑制率＝[1-本發(fā)明所得制劑組吸光度值/對(duì)照組吸光度值]×100％。

計(jì)算含藥血清各個(gè)濃度下的細(xì)胞抑制率，以細(xì)胞抑制率＜10％時(shí)的含藥血清濃度為最大無毒劑量。

多藥耐藥特性的結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8/V及對(duì)常用抗癌藥物(VCR、5-FU、OXA)耐藥指數(shù)測(cè)定

(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人結(jié)腸癌HCT-8與HCT-8/V細(xì)胞，配制細(xì)胞濃度為1×10⁴/mL，每孔100μL細(xì)胞，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃、5％CO2中孵育24h；

(2)將VCR、5-FU、OXA溶液用RPMI-1640液配制成終濃度分別為100000ng、20000ng、4000ng、800ng、160ng、32ng、6.4ng、1.28ng；分別加入HCT-8與HCT-8/V的培養(yǎng)板中100μL，每一濃度設(shè)5個(gè)平行復(fù)孔，放在37℃，5％CO₂的孵箱中繼續(xù)孵育48h小時(shí)；

(3)每孔加入25μl MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4h；

(4)小心棄去上清液，每孔加入150μL DMSO，搖床上混勻震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，于酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值。

并計(jì)算各藥物對(duì)敏感及耐藥株細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)，計(jì)算耐藥指數(shù)(RF)＝IC_{50耐藥細(xì)胞}/IC_{50敏感細(xì)胞}

本發(fā)明所得制劑逆轉(zhuǎn)指數(shù)測(cè)定

選擇最大無毒劑量的藥物血清作為與化療藥物聯(lián)用濃度，與化療藥物VCR、5-Fu、OXA的培養(yǎng)液作用于HCT8/V細(xì)胞株，分別設(shè)7個(gè)濃度級(jí)，每組藥物設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組。同樣采用MTT法進(jìn)行。

計(jì)算腫瘤細(xì)胞的存活率，以確定細(xì)胞的IC₅₀、耐藥倍數(shù)(resistance factor，RF)和逆轉(zhuǎn)指數(shù)(reversal index，RI)。

RI＝不加逆轉(zhuǎn)劑時(shí)某種藥物針對(duì)抗藥性細(xì)胞的IC₅₀/加逆轉(zhuǎn)劑時(shí)某種藥物針對(duì)抗藥性細(xì)胞的IC₅₀。

生長(zhǎng)曲線如圖2所示HCT-8細(xì)胞與HCT-8/V在第1至5天呈迅速生長(zhǎng)狀態(tài)，兩種細(xì)胞數(shù)無明顯差異，從第5天開始細(xì)胞數(shù)減少，所以本實(shí)驗(yàn)采用的腫瘤細(xì)胞為生長(zhǎng)第4到5天的呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞。

本發(fā)明所得制劑含藥血清對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8體外最大無毒劑量選擇藥物血清作用48h后最大無毒劑量(細(xì)胞存活率＞90％)，結(jié)果如圖3所示：顯示本發(fā)明所得制劑濃度為5％-20％的藥物血清為無毒使用范圍，20％藥物血清濃度HCT-8的細(xì)胞存活率為90.4％，即在此濃度下，本發(fā)明所得制劑對(duì)HCT-8細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性，此劑量作為與化療藥物聯(lián)合用藥最高劑量濃度。

HCT-8/VCR多藥耐藥性

結(jié)果表明(見表1)，HCT-8/VCR細(xì)胞株不僅對(duì)VCR具有耐藥性，對(duì)OXA，5-FU均有耐藥性，耐藥倍數(shù)分別為15.01、7.85、10.48。顯示HCT-8/VCR細(xì)胞具有多藥耐藥的特點(diǎn)。

本發(fā)明所得制劑方對(duì)HCT-8/VCR細(xì)胞株多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用

使用20％的本發(fā)明所得制劑含藥物血清分別與VCR，OXA，5-FU聯(lián)合應(yīng)用，結(jié)果顯示(見表1)：本發(fā)明所得制劑方含藥血清與相應(yīng)化療藥物聯(lián)合使用后，能增加VCR、5-Fu、OXA對(duì)耐藥細(xì)胞HCT-8/VCR的抑制殺傷作用，使相應(yīng)藥物IC50降低，分別為74.8±0.42mg·L^-1，63.8±0.51mg·L^-1，124.3±1.21mg ·L^-1，逆轉(zhuǎn)指數(shù)為2.61、2.3、1.89倍，不同程度的逆轉(zhuǎn)化療藥物，與單獨(dú)使用相應(yīng)化療藥物比較，有一定逆轉(zhuǎn)作用(P＜0.01)。

表1 本發(fā)明所得制劑方對(duì)HCT8和HCT/V化療藥物敏感性的影響(n＝3)

注：與HCT8/V組比較，^#P＜0.01。

研究的結(jié)果

本研究從本發(fā)明所得制劑與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，逆轉(zhuǎn)大腸癌細(xì)胞的多藥耐藥入手，研究了本發(fā)明所得制劑對(duì)大腸癌多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用。

本發(fā)明所得制劑方聯(lián)合化療藥物VCR，OXA，5-Fu數(shù)據(jù)顯示：本發(fā)明所得制劑方含藥血清與相應(yīng)化療藥物聯(lián)合使用后，能增加VCR、5-Fu、OXA對(duì)耐藥細(xì)胞HCT-8/VCR的抑制殺傷作用，使這三種藥物的IC₅₀明顯降低(P＜0.01)，逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為2.61，2.3，1.89，均＞100％，由此可見本發(fā)明所得制劑方能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤多耐藥的作用。

逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的機(jī)制

國內(nèi)外研究表明，腫瘤耐藥涉及細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低、藥物靶分子改變及代謝解毒、DNA損傷修復(fù)功能增強(qiáng)等多種機(jī)理，與多種耐藥相關(guān)基因有關(guān)。本專利也從大腸癌的幾種多藥耐藥基因表達(dá)及其關(guān)系闡釋本發(fā)明所得制劑具有的逆轉(zhuǎn)大腸癌多藥耐藥機(jī)制。

本發(fā)明所得制劑對(duì)多藥耐藥蛋白P-gp、LRP、MRP1、COX-2表達(dá)的影響：

P-gp的表達(dá)Wsetern Blot結(jié)果顯示(見表2，圖4、8)，組1與組2相比，表達(dá)并無明顯差異(P＞0.05)，說明大鼠的空白血清對(duì)于P-gp表達(dá)沒有明顯影響；3組與1組相比，P-gp蛋白表達(dá)(0.32±0.04)％明顯降低(P＜0.01)，說明本發(fā)明所得制劑可以顯著降低P-gp的表達(dá)。

LRP的表達(dá)Wsetern Blot結(jié)果顯示(見表2，圖5、8)，組1與組2相比，表達(dá)并無明顯差異(P＞0.05)，說明大鼠的空白血清對(duì)于LRP表達(dá)沒有明顯影響；3組與1組相比，LRP蛋白表達(dá)(0.077±0.01)％明顯降低(P＜0.01)，說明本發(fā)明所得制劑可以顯著降低LRP的表達(dá)。

MRP1的表達(dá)Wsetern Blot結(jié)果顯示(見表2，圖6、8)，組1與組2相比，表達(dá)并無明顯差異(P＞0.05)，說明大鼠的空白血清對(duì)于MRP1表達(dá)沒有明顯影響；3組與1組相比，MRP1蛋白表達(dá)(0.36±0.05)％明顯降低(P＜0.01)，說明本發(fā)明所得制劑可以顯著降低MRP1的表達(dá)。

COX-2的表達(dá)Wsetern Blot結(jié)果顯示(見表2，圖7、8)，組1與組2相比，表達(dá)并無明顯差異(P＞0.05)，說明大鼠的空白血清對(duì)于COX-2表達(dá)沒有明顯影響；3組與1組相比，COX-2蛋白表達(dá)(0.31±0.01)％明顯降低(P＜0.01)，說明本發(fā)明所得制劑可以顯著降低COX-2的表達(dá)。

表2 本發(fā)明所得制劑對(duì)HCT-8/VCR細(xì)胞耐藥基因表達(dá)的影響

1組與2組比較：^*P＞0.05；1組與3組比較：^#P＜0.01

注：1.表示HCT-8/VCR+20％胎牛血清，2.HCT-8/VCR+20％大鼠空白血清，3.HCT-8/VCR+20％含藥血清。

大腸癌的多藥耐藥機(jī)制復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)P-gp、LRP、MRP1以及COX-2表達(dá)增加為大腸癌多藥耐藥的主要機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所得制劑在一定程度上可以下調(diào)P-gp、LRP、MRP1、COX-2的高表達(dá)，為其主要逆轉(zhuǎn)大腸癌多藥耐藥的機(jī)制

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。