相關(guān)專利申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2015年3月2日提交的題目為“經(jīng)修飾的細(xì)胞及其用途”的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?2/126,804的優(yōu)先權(quán)，所述臨時(shí)專利申請(qǐng)通過(guò)全文引用并入本文。本公開涉及經(jīng)修飾的細(xì)胞和使用者，尤其涉及用于降低與cart細(xì)胞療法相關(guān)的免疫耐受性的組合物和方法。
背景技術(shù)：
：t細(xì)胞療法已經(jīng)證明了用于治療癌癥的療效和治療潛力。然而，它們的使用受到免疫抑制微環(huán)境的存在的限制。免疫抑制微環(huán)境包括由程序性死亡-1(pd-1)與pd-l1配體(pd-l1)之間的相互作用所誘導(dǎo)的免疫耐受性。pd-1是在t細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞上的陰性共調(diào)節(jié)受體。pd-l1由幾種細(xì)胞類型(例如，腫瘤細(xì)胞和其它組織細(xì)胞)表達(dá)，并且表現(xiàn)為由免疫微環(huán)境進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。因此，需要解決由pd-l1誘導(dǎo)的免疫耐受性，以改善t細(xì)胞療法的療效。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本公開的實(shí)施例涉及一種包含編碼經(jīng)修飾的程序性細(xì)胞死亡蛋白質(zhì)1(pd-1)的核酸序列和編碼嵌合抗原受體(car)的核酸序列的分離的核酸序列。在某些實(shí)施例中，經(jīng)修飾的pd-1和car被表達(dá)為基因產(chǎn)物，所述基因產(chǎn)物為單獨(dú)的多肽。在一些實(shí)施例中，car對(duì)存在于癌細(xì)胞上的腫瘤抗原是特異性的，并且其中所述癌細(xì)胞表達(dá)pd-l1。在一些實(shí)施例中，腫瘤抗原包含her2、cd19、cd20、cd22、κ輕鏈、cd30、cd33、cd123、cd38、ror1、erbb3/4、egfr、egfrviii、epha2、fap、癌胚抗原、egp2、egp40、間皮素、tag72、psma、nkg2d配體、b7-h6、il-13受體α2、il-11受體α、muc1、muc16、ca9、gd2、gd3、hmw-maa、cd171、lewisy、g250/caix、hla-aimagea1、hla-a2ny-eso-1、psc1、葉酸受體-α、cd44v7/8、8h9、ncam、vegf受體、5t4、胎兒型乙酰膽堿受體、nkg2d配體、cd44v6、tem1、tem8，或者由腫瘤表達(dá)的病毒相關(guān)抗原。在一些實(shí)施例中，與編碼野生型pd-1的胞內(nèi)部分的核酸序列相比，編碼經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代或者缺失。在一些實(shí)施例中，與編碼野生型pd-1的胞內(nèi)部分的核酸序列相比，編碼經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列包含多個(gè)核苷酸的缺失。在某些實(shí)施例中，經(jīng)修飾的pd-1包含seqidno:14的核酸序列。在一些實(shí)施例中，編碼經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列包含編碼截?cái)嗟膒d-1的核酸，所述截?cái)嗟膒d-1不包括胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施例中，編碼經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列包含seqidno:12的核酸序列。在一些實(shí)施例中，與野生型pd-1相比，經(jīng)修飾的pd-1包含一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變。在某些實(shí)施例中，點(diǎn)突變包含野生型pd-1的磷酸化位點(diǎn)的一個(gè)或兩個(gè)氨基酸點(diǎn)突變。實(shí)施例進(jìn)一步涉及一種包含如上所述的核酸序列的表達(dá)載體。在一些實(shí)施例中，表達(dá)載體是選自由以下組成的群組的病毒載體：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體和腺相關(guān)病毒載體。實(shí)施例進(jìn)一步涉及一種包含本公開的表達(dá)載體的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，所述細(xì)胞選自由以下組成的群組：t細(xì)胞、nk細(xì)胞和nkt細(xì)胞。實(shí)施例進(jìn)一步涉及一種包含抗腫瘤有效量的人t細(xì)胞群的藥物組合物，其中所述人t細(xì)胞群包括包含如上所述的分離的核酸序列的人t細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，pd-l1對(duì)所述人t細(xì)胞群的細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制作用小于pd-l1對(duì)不包含編碼經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列的至少一部分的人t細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制作用。實(shí)施例進(jìn)一步涉及一種治療人患者的癌癥的方法，該方法包含向人患者施用如本公開中所描述的藥物組合物。實(shí)施例進(jìn)一步涉及一種被工程化以表達(dá)經(jīng)修飾的pd-1和嵌合抗原受體(car)的細(xì)胞，其中所述經(jīng)修飾的pd-1不包括pd-1的跨膜部分或胞內(nèi)部分，或其組合。在一些實(shí)施例中，細(xì)胞表達(dá)可溶性pd-1，例如以破壞pd-1與pd-l-1的結(jié)合。例如，可溶性pd-1沒有粘附到細(xì)胞的細(xì)胞膜。實(shí)施例進(jìn)一步涉及一種治療和/或抑制受試者的癌癥的方法。該方法包括向受試者施用治療有效量的可溶性受體，所述可溶性受體包括pd-1的胞外結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，可溶性受體結(jié)合pd-l1蛋白質(zhì)，并且可溶性受體破壞癌細(xì)胞的pd-1信號(hào)傳導(dǎo)和/或破壞pd-1與pd-l1的結(jié)合。在某些實(shí)施例中，分離的可溶性受體多肽包括seqidno:9的氨基酸殘基20-519。實(shí)施例進(jìn)一步涉及一種包括受體多肽的經(jīng)修飾的細(xì)胞，所述受體多肽的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域被截?cái)?，所述受體多肽是程序性細(xì)胞死亡蛋白質(zhì)1(pd-1)受體多肽、細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白質(zhì)4(ctla-4)受體多肽，或者b和t淋巴細(xì)胞衰減因子(btla)受體中的至少一種。實(shí)施例進(jìn)一步涉及一種用于治療患有疾病的受試者的方法。該方法包括向患有疾病的受試者施用細(xì)胞，其中所述細(xì)胞經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)：受體多肽，所述受體多肽的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域被截?cái)?，所述受體多肽是程序性細(xì)胞死亡蛋白質(zhì)1(pd-1)受體多肽、細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白質(zhì)4(ctla-4)受體多肽，或者b和t淋巴細(xì)胞衰減因子(btla)受體中的至少一種；包括特異性抗體的抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體(car)，或者經(jīng)修飾的或野生型t細(xì)胞受體，所述特異性抗體與抗原結(jié)合。在一些實(shí)施例中，所述受體多肽是pd-1受體多肽，并且其中所述pd-1受體多肽的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域含有基于免疫受體酪氨酸的基序。實(shí)施例進(jìn)一步涉及一種與相應(yīng)的野生型細(xì)胞相比包括減少量的一種或多種受體的經(jīng)修飾的細(xì)胞，所述一種或多種受體包括程序性細(xì)胞死亡蛋白質(zhì)1(pd-1)、細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白質(zhì)4(ctla-4)，或者b和t淋巴細(xì)胞衰減因子(btla)中的至少一種。實(shí)施例進(jìn)一步涉及一種用于治療患有疾病的受試者的方法。該方法包括向患有疾病的受試者施用細(xì)胞，其中，與相應(yīng)的野生型細(xì)胞相比，所述細(xì)胞經(jīng)修飾以表達(dá)減少量的一種或多種受體，所述一種或多種受體包括程序性細(xì)胞死亡蛋白質(zhì)1(pd-1)、細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白質(zhì)4(ctla-4)，或者b和t淋巴細(xì)胞衰減因子(btla)中的至少一種。在一些實(shí)施例中，經(jīng)修飾的細(xì)胞進(jìn)一步包括：包括特異性抗體的抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體(car)，或者經(jīng)修飾的或野生型t細(xì)胞受體。在某些實(shí)施例中，經(jīng)修飾的細(xì)胞進(jìn)一步包括：包括特異性抗體的抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體(car)，或者經(jīng)修飾的或野生型t細(xì)胞受體，所述特異性抗體與抗原結(jié)合。在一些實(shí)施例中，與相應(yīng)的野生型細(xì)胞相比，經(jīng)修飾的細(xì)胞具有一個(gè)或多個(gè)基因的降低的表達(dá)，所述一個(gè)或多個(gè)基因的降低的表達(dá)與一種或多種受體的生物合成途徑或輸送途徑相關(guān)。在某些實(shí)施例中，經(jīng)修飾的細(xì)胞包括一個(gè)或多個(gè)基因的破壞。在某些實(shí)施例中，經(jīng)修飾的細(xì)胞包括一個(gè)或多個(gè)基因的部分或完全缺失。在某些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞在人患者體內(nèi)復(fù)制。在一些實(shí)施例中，經(jīng)修飾的細(xì)胞形成人患者的記憶細(xì)胞。在這些情況下，經(jīng)修飾的細(xì)胞經(jīng)靜脈內(nèi)施用給人患者。在某些實(shí)施例中，經(jīng)修飾的細(xì)胞持續(xù)存在于人患者內(nèi)。例如，經(jīng)修飾的細(xì)胞是自體t細(xì)胞。對(duì)于另一個(gè)實(shí)例，細(xì)胞可以包括b細(xì)胞、t細(xì)胞、nk細(xì)胞、胚胎細(xì)胞或樹突細(xì)胞中的至少一種。在一些實(shí)施例中，所述疾病可以包括癌癥、免疫缺陷、自身免疫性疾病，或肥胖癥中的至少一種。提供該
發(fā)明內(nèi)容以用簡(jiǎn)化的形式介紹以下具體實(shí)施方式中進(jìn)一步描述的精選概念。該
發(fā)明內(nèi)容并不旨在標(biāo)識(shí)所要求保護(hù)的主題的關(guān)鍵特征或必要特征，也不旨在用于限制所要求保護(hù)的主題的范圍。附圖說(shuō)明參照附圖描述具體實(shí)施方式。在不同附圖中使用相同的參考數(shù)字表示類似或相同的項(xiàng)目。圖1是示出p0:cd19bbzeta、p1:cd19bbzeta-ires-可溶性pd1、p2:cd19bbzeta-ires-截?cái)嗟膒d1、p3:cd19bbzeta-ires-點(diǎn)突變pd1、p4:cd19bbzeta-ires-缺失pd1的dna構(gòu)建體的示意圖。圖2包括圖2a和圖2b，是顯示car和經(jīng)修飾的pd-1在轉(zhuǎn)導(dǎo)的293t和k562細(xì)胞上的表達(dá)的一系列圖像。圖2a顯示car在轉(zhuǎn)導(dǎo)的293t和k562細(xì)胞上的表達(dá)。圖2b顯示經(jīng)修飾的pd-1在轉(zhuǎn)導(dǎo)的293t和k562細(xì)胞上的表達(dá)。圖3包括圖3a至圖3c，是顯示car和經(jīng)修飾的pd-1在原代t細(xì)胞上的表達(dá)的一系列圖像。圖3a顯示car在轉(zhuǎn)導(dǎo)的原代t細(xì)胞上的表達(dá)。圖3b和圖3c顯示經(jīng)修飾的pd-1在轉(zhuǎn)導(dǎo)的原代t細(xì)胞上的表達(dá)。圖4包括圖4a和圖4b，是顯示用car和經(jīng)修飾的pd-1轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞的細(xì)胞毒性的一系列圖像。圖4a顯示每104個(gè)t細(xì)胞的ifn-γ釋放，所述t細(xì)胞用car和經(jīng)修飾的pd-1轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中e：t比例是10：1并且用cd19+細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)。圖4b表明，每104個(gè)t細(xì)胞殺死cd19+細(xì)胞，損失t細(xì)胞用car和經(jīng)修飾的pd-1轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中e：t比例是10：1并且培養(yǎng)24小時(shí)。圖5顯示pd-l1在轉(zhuǎn)導(dǎo)的nalm6細(xì)胞上的表達(dá)。圖6包括圖6a和圖6b，是證明經(jīng)修飾的pd-1降低了由pd-l1誘導(dǎo)的免疫耐受性的一系列圖像。圖6a顯示每104個(gè)t細(xì)胞的ifn-γ釋放，所述t細(xì)胞用car和經(jīng)修飾的pd-1轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中e：t比例是10：1并且用cd19+細(xì)胞和cd19+/pd-l1+細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)。這些結(jié)果表明，由pd-l1誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的抑制作用在用car和經(jīng)修飾的pd-1轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞上降低。圖6b示出與單獨(dú)用car轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞相比，由pd-l1誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的損失在用car和經(jīng)修飾的pd-1轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞上降低。具體實(shí)施方式概述本公開涉及以下發(fā)現(xiàn)：關(guān)于基于cart細(xì)胞的療法，由pd-l1誘導(dǎo)的免疫耐受性可以通過(guò)經(jīng)遺傳修飾的pd-1在這些t細(xì)胞上的表達(dá)而降低。在一些實(shí)施例中，這些t細(xì)胞包括編碼car和經(jīng)遺傳修飾的pd-1的核酸序列，使得經(jīng)修飾的pd-1和car被表達(dá)為基因產(chǎn)物，所述基因產(chǎn)物是這些t細(xì)胞上的單獨(dú)的多肽。遺傳修飾的實(shí)例包括與pd-1的胞內(nèi)部分的表達(dá)或功能相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代或缺失。在一些實(shí)施例中，本公開提供了一種t細(xì)胞，所述t細(xì)胞被工程化以表達(dá)抗cd19的car和經(jīng)修飾的pd-1，使得pd-l1對(duì)t細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制作用顯著小于pd-l1對(duì)不包括編碼經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列的至少一部分的t細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制作用。在一些情況下，car對(duì)存在于腫瘤細(xì)胞上的腫瘤抗原是特異性的，并且所述腫瘤細(xì)胞表達(dá)pd-l1。因此，當(dāng)本公開的工程化t細(xì)胞被輸注到患者中時(shí)，所述工程化t細(xì)胞可以降低由腫瘤細(xì)胞的pd-l1誘導(dǎo)的免疫耐受性，并且進(jìn)一步消除患者體內(nèi)的這些腫瘤細(xì)胞。定義除非另有定義，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有如本公開所屬的領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。雖然在本公開的實(shí)踐或測(cè)試中可以使用與本文描述的方法和材料類似或等同的任何方法和材料，但是描述了優(yōu)選的方法和材料。對(duì)于本公開的目的，下列術(shù)語(yǔ)定義如下。本文使用冠詞“一(a)”和“一個(gè)(an)”指的是一個(gè)或多于一個(gè)(即，指的是至少一個(gè))該冠詞的語(yǔ)法對(duì)象。舉例來(lái)說(shuō)，“元件”表示一個(gè)元件或多于一個(gè)元件。“約”是指與參考量、水平、值、數(shù)量、頻率、百分比、量綱、大小、用量、重量或長(zhǎng)度相比，量、水平、值、數(shù)量、頻率、百分比、量綱、大小、用量、重量或長(zhǎng)度的變化高達(dá)30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“活化”指的是已經(jīng)被充分刺激以誘導(dǎo)可檢測(cè)的細(xì)胞增殖的t細(xì)胞的狀態(tài)?；罨部膳c誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生和可檢測(cè)的效應(yīng)子功能相關(guān)。術(shù)語(yǔ)“活化的t細(xì)胞”尤其指的是正經(jīng)歷細(xì)胞分裂的t細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“抗體”以最廣泛的意義使用，并且具體包括單克隆抗體(包括全長(zhǎng)單克隆抗體)、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)，以及抗體片段，只要它們表現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性或功能即可。本公開中的抗體可以以多種形式存在，包括例如多克隆抗體、單克隆抗體、fv、fab和f(ab)2，以及單鏈抗體和人源化抗體(harlow等人，1999年，載于：《使用抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(usingantibodies:alaboratorymanual)》，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約；harlow等人，1989年，載于：《抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(antibodies:alaboratorymanual)》，冷泉港，紐約；houston等人，1988年，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)85:5879-5883；bird等人，1988年，《科學(xué)(science)》242:423-426)?！翱贵w片段”包含全長(zhǎng)抗體的一部分，通常包含抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。抗體片段的實(shí)例包括：fab、fab'、f(ab')2和fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；以及由抗體片段形成的多特異性抗體?！癴v”是包含完整抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。此片段由一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域通過(guò)緊密的、非共價(jià)結(jié)合的二聚體組成。通過(guò)這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的折疊發(fā)出提供用于抗原結(jié)合的氨基酸殘基并賦予抗體抗原結(jié)合特異性的六個(gè)高變環(huán)(3個(gè)環(huán)各自來(lái)自h和l鏈)。但是，甚至單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(或者僅僅包括抗原特異的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)的fv的一半)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，盡管親和力比完整結(jié)合位點(diǎn)低。如本文所使用的，“抗體重鏈”指的是以它們天然存在的構(gòu)象存在于所有抗體分子中的兩類多肽鏈中較大的一類。如本文所使用的，“抗體輕鏈”指的是以它們天然存在的構(gòu)象存在于所有抗體分子中的兩類多肽鏈中較小的一類。κ和λ輕鏈指的是兩種主要的抗體輕鏈同種型。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“合成抗體”是指利用重組dna技術(shù)產(chǎn)生的抗體，例如，如本文所述的由噬菌體表達(dá)的抗體。該術(shù)語(yǔ)也應(yīng)當(dāng)被解釋為指通過(guò)編碼抗體的dna分子的合成而產(chǎn)生的抗體，并且所述dna分子表達(dá)抗體蛋白質(zhì)，或表示抗體的氨基酸序列，其中dna或氨基酸序列是利用本領(lǐng)域可用且公知的合成dna或氨基酸序列技術(shù)獲得的。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“抗原”被定義為引起免疫應(yīng)答的分子，所述免疫應(yīng)答可涉及抗體產(chǎn)生，或特異性免疫活性細(xì)胞的活化，或這兩者。抗原可以包括任何大分子，實(shí)際上包括所有蛋白質(zhì)或肽，或者源自重組或基因組dna的分子。例如，包括編碼引發(fā)免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)的核苷酸序列或部分核苷酸序列的dna因此編碼如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“抗原”。此外，抗原不一定僅由基因的全長(zhǎng)核苷酸序列編碼。進(jìn)一步地，抗原可以通過(guò)生物學(xué)樣本產(chǎn)生、合成或衍生，所述生物學(xué)樣本包括組織樣本、腫瘤樣本、細(xì)胞或生物學(xué)流體。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“抗腫瘤作用”指的是與腫瘤體積的減小、腫瘤細(xì)胞數(shù)量的減少、轉(zhuǎn)移數(shù)量的減少、具有腫瘤細(xì)胞的受試者的預(yù)期壽命的增加，或者與癌性病癥相關(guān)的各種生理癥狀的改善相關(guān)的生物學(xué)效應(yīng)?！翱鼓[瘤作用”也可由本公開的肽、多核苷酸、細(xì)胞和抗體在預(yù)防腫瘤首次出現(xiàn)的能力表示。術(shù)語(yǔ)“自體抗原”指的是由免疫系統(tǒng)錯(cuò)誤識(shí)別為外源的抗原。自體抗原包括細(xì)胞蛋白質(zhì)、磷蛋白質(zhì)、細(xì)胞表面蛋白質(zhì)、細(xì)胞脂質(zhì)、核酸、糖蛋白，包括細(xì)胞表面受體。術(shù)語(yǔ)“自體的”用于描述源自相同個(gè)體的物質(zhì)，所述物質(zhì)隨后被再次引入到個(gè)體中?！巴N異體的”用于描述源自相同物種的不同動(dòng)物的移植物?！爱惙N異體的”用于描述源自不同物種的動(dòng)物的移植物。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“癌癥”被定義為以畸變細(xì)胞的快速和失控生長(zhǎng)為特征的疾病。癌癥細(xì)胞可局部蔓延或通過(guò)血流和淋巴系統(tǒng)蔓延至身體的其它部位。各種癌癥的實(shí)例包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等等。在整個(gè)本說(shuō)明書中，除非上下文另有要求，詞語(yǔ)“包含”和“包括”將被理解為指包括所陳述的步驟或元素或者步驟或元素的集合，但是不排除任何其它步驟或元素或者步驟或元素的集合。“由……組成”是指包括并且限于短語(yǔ)“由……組成”之后所描述的內(nèi)容。因此，短語(yǔ)“由……組成”表示所列元素是必要的或強(qiáng)制性的，并且其它元素可以不存在?！盎旧嫌伞M成”是指包括該短語(yǔ)后面列出的任何元素，并且限于對(duì)本公開中針對(duì)所列元素說(shuō)明的活性或作用不干擾或無(wú)貢獻(xiàn)的其它元素。因此，短語(yǔ)“基本上由……組成”表示所列元素是必要的或強(qiáng)制性的，但是其它元素是任選的，并且根據(jù)它們是否影響所列元素的活性或作用可以存在或不存在。術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)的”和“互補(bǔ)”指的是通過(guò)堿基配對(duì)原則相關(guān)的多核苷酸(即核苷酸的序列)。例如，序列“a-g-t”與序列“t-c-a”是互補(bǔ)的?；パa(bǔ)可以是“部分的”，其中僅一些核酸的堿基根據(jù)堿基配對(duì)原則進(jìn)行匹配?；蛘?，核酸之間可存在“完全”或“總體”的互補(bǔ)。核酸鏈之間的互補(bǔ)程度對(duì)核酸鏈之間雜交的效率和強(qiáng)度具有顯著影響?！皩?duì)應(yīng)于”是指(a)具有與參考多核苷酸序列的全部或一部分基本上相同或互補(bǔ)的核酸序列或編碼與肽或蛋白質(zhì)中的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多核苷酸；或者(b)具有與參考肽或蛋白質(zhì)中的氨基酸的序列基本上相同的氨基酸序列的肽或多肽?！肮泊碳づ潴w”包括特異性結(jié)合t細(xì)胞上的同源共刺激分子的抗原呈遞細(xì)胞(例如，apc、樹突細(xì)胞、b細(xì)胞等等)上的分子，由此除了通過(guò)例如將tcr/cd3復(fù)合物與負(fù)載有肽的mhc分子結(jié)合提供的初級(jí)信號(hào)之外，還提供介導(dǎo)t細(xì)胞應(yīng)答的信號(hào)，所述t細(xì)胞應(yīng)答包括增殖、活化、分化等等。共刺激配體可包括cd7、b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、pd-l1、pd-l2、4-1bbl、ox40l、可誘導(dǎo)的共刺激配體(icos-l)、細(xì)胞間粘附分子(icam)、cd30l、cd40、cd70、cd83、hla-g、mica、micb、hvem、淋巴毒素β受體、3/tr6、ilt3、ilt4、hvem、結(jié)合toll配體受體的激動(dòng)劑或抗體和與b7-h3特異性結(jié)合的配體。共刺激配體也包括，特別是與存在于t細(xì)胞上的共刺激分子特異性結(jié)合的抗體，諸如cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3，以及與cd83特異性結(jié)合的配體。“共刺激分子”指的是與共刺激配體特異性結(jié)合的t細(xì)胞上的同源結(jié)合配偶體，由此由t細(xì)胞介導(dǎo)共刺激應(yīng)答，諸如增殖。共刺激分子包括mhci類分子、btla和toll樣受體?！肮泊碳ば盘?hào)”指的是與初級(jí)信號(hào)(諸如tcr/cd3接合)結(jié)合導(dǎo)致t細(xì)胞增殖和/或關(guān)鍵分子的上調(diào)或下調(diào)的信號(hào)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“疾病”和“病癥”可以互換使用，或者可以是不同的，因?yàn)樘厥獾募膊』虿“Y可以不具有已知的致病因子(因此不能用病因?qū)W解決)，因此其不被公認(rèn)為疾病而是為不合適的病癥或癥狀，其中臨床醫(yī)師已經(jīng)鑒定出或多或少的特異系列癥狀。如本文所使用的，“疾病”是受試者的一種健康狀態(tài)，其中受試者不能維持體內(nèi)平衡，并且其中如果不改善該疾病，則受試者的健康繼續(xù)惡化。與之相比，受試者中的“紊亂”是一種健康狀態(tài)，其中動(dòng)物能夠維持體內(nèi)平衡，但是其中動(dòng)物的健康狀態(tài)與它沒有處于該紊亂相比不太有利。保持不治療，紊亂不一定引起動(dòng)物健康狀態(tài)的進(jìn)一步降低。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“有效的”是指足以實(shí)現(xiàn)所期望的、預(yù)期的或意圖的結(jié)果。例如，“有效量”可以是足以產(chǎn)生治療性或預(yù)防性益處的化合物的量。“編碼”指的是多核苷酸(諸如基因、cdna或mrna)中核苷酸的特異性序列在生物學(xué)過(guò)程中用作合成其它聚合物和大分子的模板的固有性質(zhì)，所述聚合物和大分子具有確定的核苷酸序列(即，rrna、trna和mrna)或確定的氨基酸序列和由其產(chǎn)生的生物學(xué)性質(zhì)。因此，如果對(duì)應(yīng)于基因的mrna的轉(zhuǎn)錄和翻譯在細(xì)胞或其它生物學(xué)系統(tǒng)中產(chǎn)生蛋白質(zhì)，則該基因編碼蛋白質(zhì)。核苷酸序列與mrna序列相同并且通常在序列表中提供的編碼鏈和用作基因或cdna轉(zhuǎn)錄的模板的非編碼鏈可被稱為編碼那個(gè)基因或cdna的蛋白質(zhì)或其它產(chǎn)物。關(guān)于多核苷酸，術(shù)語(yǔ)“外源的”指的是在野生型細(xì)胞或生物體中并非天然存在但是通常通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)將其引入到細(xì)胞中的多核苷酸序列。外源多核苷酸的實(shí)例包括載體、質(zhì)粒，和/或編碼所需蛋白質(zhì)的人造核酸構(gòu)建體。對(duì)于多核苷酸，術(shù)語(yǔ)“內(nèi)源的”或“天然的”指的是可在給定的野生型細(xì)胞或生物體中找到的天然存在的多核苷酸序列。同樣，從第一生物體分離并且通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)轉(zhuǎn)移到第二生物體的特定多核苷酸序列通常被認(rèn)為相對(duì)于所述第二生物體是“外源”多核苷酸。在具體的實(shí)施例中，多核苷酸序列可以通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)被“引入”到已包含這樣的多核苷酸序列的微生物中，例如以創(chuàng)建另外的天然存在的多核苷酸序列的一個(gè)或多個(gè)附加拷貝，并且由此促進(jìn)所編碼的多肽的過(guò)表達(dá)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”被定義為由它的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的特定核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。“表達(dá)載體”指的是包括重組多核苷酸的載體，所述重組多核苷酸包括可操作地連接至待表達(dá)的核苷酸序列的表達(dá)控制序列。表達(dá)載體包括用于表達(dá)的足夠的順式作用元件；用于表達(dá)的其它元件可由宿主細(xì)胞供應(yīng)或在體外表達(dá)系統(tǒng)中供應(yīng)。表達(dá)載體包括本領(lǐng)域已知的所有那些表達(dá)載體，諸如并入重組多核苷酸的粘粒、質(zhì)粒(例如，裸露或包含在脂質(zhì)體中)和病毒(例如，慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)?！巴吹摹敝傅氖莾蓚€(gè)多肽之間或兩個(gè)核酸分子之間的序列相似性或序列同一性。當(dāng)兩個(gè)比較序列中的位置被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據(jù)時(shí)，例如，如果兩個(gè)dna分子的每一個(gè)中的位置被腺嘌呤占據(jù)，則所述分子在那個(gè)位置上是同源的。兩個(gè)序列之間的同源性百分比為兩個(gè)序列共有的匹配或同源位置數(shù)除以被比較的位置數(shù)再乘以100所得的函數(shù)。例如,如果兩個(gè)序列中10個(gè)位置中的6個(gè)是匹配或同源的，則兩個(gè)序列是60％同源的。舉例來(lái)說(shuō)，dna序列attgcc和tatggc共有50％的同源性。通常，當(dāng)兩個(gè)序列進(jìn)行比對(duì)給出最大同源性時(shí)才進(jìn)行比較。術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白”或“ig”指的是起到抗體作用的一類蛋白質(zhì)。包括在該類蛋白質(zhì)中的五個(gè)成員為iga、igg、igm、igd和ige。iga為存在于身體分泌物(諸如唾液、淚液、母乳)、胃腸分泌物以及呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物中的初級(jí)抗體。igg是最常見的循環(huán)抗體。igm是在多數(shù)受試者的初級(jí)免疫應(yīng)答中產(chǎn)生的主要免疫球蛋白。它是在凝集、補(bǔ)體結(jié)合和其它抗體應(yīng)答中最有效的免疫球蛋白，并且在抵御細(xì)菌和病毒方面是很重要的。igd是不具有已知抗體功能但可用作抗原受體的免疫球蛋白。ige是在暴露于過(guò)敏原后，通過(guò)引起從肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞釋放介體而介導(dǎo)速發(fā)型超敏反應(yīng)的免疫球蛋白?！胺蛛x的”是指基本上或?qū)嵸|(zhì)上不含通常在其天然狀態(tài)下附帶著的成分的物質(zhì)。例如，如本文所使用的，“分離的多核苷酸”指的是在天然存在的狀態(tài)下被來(lái)自其兩側(cè)的序列所純化的多核苷酸，例如從正常毗鄰于所述片段的序列所移除的dna片段。可選地，如本文所使用的，“分離的肽”或“分離的多肽”等指的是肽或多肽分子從其天然細(xì)胞環(huán)境中的體外分離和/或純化，以及與細(xì)胞的其它成分關(guān)聯(lián)。在本公開的上下文中，使用下列普遍存在的核酸堿基的縮寫?！癮”指的是腺苷，“c”指的是胞嘧啶，“g”指的是鳥苷，“t”指的是胸苷，以及“u”指的是尿苷。除非另有說(shuō)明，“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此互為簡(jiǎn)并版本并且編碼相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。短語(yǔ)編碼蛋白質(zhì)或rna的核苷酸序列也可包括內(nèi)含子，在一定程度上編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列可在某些版本中包含(一個(gè)或多個(gè))內(nèi)含子。如本文所使用的，“慢病毒”指的是逆轉(zhuǎn)錄病毒科的屬。在逆轉(zhuǎn)錄病毒中，慢病毒是唯一能夠感染非分裂細(xì)胞的；它們可以將顯著量的遺傳信息傳遞到宿主細(xì)胞的dna中，所以它們是基因傳遞載體的最有效的方法之一。hiv、siv和fiv是慢病毒的所有實(shí)例。源自慢病毒的載體提供了實(shí)現(xiàn)顯著水平的基因體內(nèi)轉(zhuǎn)移的工具。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”是指與缺少治療或化合物的受試者中的應(yīng)答水平相比，和/或與在另外相同但未治療的受試者中的應(yīng)答水平相比，介導(dǎo)受試者中的應(yīng)答水平的可檢測(cè)的增加或減少。該術(shù)語(yǔ)包括擾亂和/或影響天然信號(hào)或應(yīng)答，由此介導(dǎo)受試者、優(yōu)選人中的有益的治療性應(yīng)答。當(dāng)使一核酸與另一核酸序列處于功能性關(guān)系時(shí)，所述核酸即是“可操作地連接”。例如，如果前序列或分泌前導(dǎo)序列的dna被表達(dá)為參與多肽的分泌的前蛋白，則其可操作地連接至所述多肽的dna；如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響序列的轉(zhuǎn)錄，則其可操作地連接至編碼序列；或者如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被定位成便于翻譯，則其可操作地連接至編碼序列。通常，“可操作地連接”是指被連接的dna序列是連續(xù)的，并且在分泌前導(dǎo)序列的情況下是連續(xù)的并且處于閱讀相。然而，增強(qiáng)子不一定是連續(xù)的。連接是通過(guò)在方便的限制性位點(diǎn)進(jìn)行接合而實(shí)現(xiàn)的。如果不存在此類位點(diǎn)，則根據(jù)常規(guī)實(shí)踐使用合成的寡核苷酸銜接頭或連接子。術(shù)語(yǔ)“過(guò)表達(dá)的”腫瘤抗原或腫瘤抗原的“過(guò)表達(dá)”意在表示相對(duì)于在來(lái)自組織或器官的正常細(xì)胞中的表達(dá)水平，腫瘤抗原在來(lái)自患者的特異性組織或器官內(nèi)的疾病區(qū)域(如實(shí)體腫瘤)的細(xì)胞中的異常表達(dá)水平?；加刑卣髟谟谀[瘤抗原的過(guò)表達(dá)的實(shí)體腫瘤或惡性血液疾病的患者可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法來(lái)確定。免疫原性組合物的“腸胃外”施用包括，例如，皮下注射(s.c.)、靜脈內(nèi)注射(i.v.)、肌內(nèi)注射(i.m.)、或胸骨內(nèi)注射、或輸液技術(shù)。術(shù)語(yǔ)“患者”、“受試者”、“個(gè)體”等等在本文中可互換使用，并且指的是不論是在體外或原位服從本文所描述的方法的任何動(dòng)物或其細(xì)胞。在某些非限制性實(shí)施例中，患者、受試者或個(gè)體是人。在一些實(shí)施例中，術(shù)語(yǔ)“受試者”意在包括可引發(fā)免疫應(yīng)答的活生物體(例如，哺乳動(dòng)物)。受試者的實(shí)例包括人、狗、貓、小鼠、大鼠及其轉(zhuǎn)基因物種。如本文所使用的，敘述“多核苷酸”或“核酸”是指mrna、rna、crna、rrna、cdna或dna。該術(shù)語(yǔ)通常指的是長(zhǎng)度為至少10個(gè)堿基的聚合體形式的核苷酸，所述核苷酸是核糖核苷酸或脫氧核苷酸或任一類型核苷酸的經(jīng)修飾形式。該術(shù)語(yǔ)包括dna和rna的單鏈和雙鏈形式。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸變體”和“變體”等指的是顯示與參考多核苷酸序列具有基本序列同一性的多核苷酸或在下文定義的低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與參考序列雜交的多核苷酸。這些術(shù)語(yǔ)還包括通過(guò)至少一個(gè)核苷酸的添加、缺失或取代而區(qū)別于參考多核苷酸的多核苷酸。因此，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸變體”和“變體”包括其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸被添加或缺失，或用不同的核苷酸置換的多核苷酸。在這方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員很好理解的是，可以對(duì)參考多核苷酸進(jìn)行某些改變，包括突變、添加、缺失和取代，由此所改變的多核苷酸保持參考多核苷酸的生物學(xué)功能或活性，或者相對(duì)于所述參考多核苷酸具有增加的活性(即，優(yōu)化)。多核苷酸變體包括，例如，與本文中所描述的參考多核苷酸序列具有至少50％(和至少51％至至少99％，以及在之間的所有整數(shù)百分比，例如，90％、95％或98％)序列同一性的多核苷酸。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸變體”和“變體”還包括天然存在的等位基因變體和編碼這些酶的直系同源物?！岸嚯摹薄ⅰ岸嚯钠巍?、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，用來(lái)指氨基酸殘基的聚合物及其變體和合成類似物。因此，這些術(shù)語(yǔ)適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是合成的非天然存在的氨基酸的氨基酸聚合物(諸如相應(yīng)的天然存在的氨基酸的化學(xué)類似物)，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。在某些方面，多肽可以包括通常催化不同的化學(xué)反應(yīng)(即，增加不同的化學(xué)反應(yīng)的速率)的酶多肽，或“酶”。敘述多肽“變體”指的是通過(guò)至少一個(gè)氨基酸殘基的添加、缺失或取代而區(qū)別于參考多肽序列的多肽。在某些實(shí)施例中，多肽變體通過(guò)一個(gè)或多個(gè)取代基而區(qū)別于參考多肽，所述取代基可以是保守的或非保守的。在某些實(shí)施例中，所述多肽變體包含保守性取代基，并且在這方面，本領(lǐng)域中很好理解的是，一些氨基酸可以被改變?yōu)榫哂袕V泛相似性質(zhì)的其它氨基酸，而不改變多肽的活性性質(zhì)。多肽變體還包括其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被添加或缺失，或用不同的氨基酸殘基置換的多肽。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”被定義為通過(guò)細(xì)胞的合成機(jī)制，或引入的合成機(jī)制識(shí)別的dna序列，它是啟動(dòng)多核苷酸序列的特異性轉(zhuǎn)錄所必需的。表達(dá)“控制序列”指的是在特定宿主生物體中表達(dá)可操作連接的編碼序列所必需的dna序列。例如適于原核生物的控制序列包括啟動(dòng)子，任選地包括操縱子序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。真核細(xì)胞已知利用啟動(dòng)子、多腺苷酸化信號(hào)，以及增強(qiáng)子。術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”或“與……相互作用”是指一個(gè)分子識(shí)別并粘附到樣本或生物體中的特定第二分子，但基本上不識(shí)別或粘附到樣本中的其它結(jié)構(gòu)上無(wú)關(guān)的分子。如本文關(guān)于抗體所使用的，術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”是指識(shí)別特異性抗原但基本上不識(shí)別或結(jié)合樣本中的其它分子的抗體。例如，與來(lái)自一個(gè)物種的抗原特異性結(jié)合的抗體也可與來(lái)自一個(gè)或多個(gè)物種的抗原結(jié)合。但是，這種交叉物種反應(yīng)性本身沒有將抗體的類別改變?yōu)樘禺愋缘?。在另一個(gè)實(shí)例中，與抗原特異性結(jié)合的抗體也可與不同等位基因形式的抗原結(jié)合。然而，這種交叉反應(yīng)性本身沒有將抗體的類別改變?yōu)樘禺愋缘摹Ｔ谝恍┣闆r下，術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”或“特異性地結(jié)合”可以在提及抗體、蛋白質(zhì)或肽與第二化學(xué)物種的相互作用時(shí)使用，用于指所述相互作用依賴于化學(xué)物種上特定結(jié)構(gòu)(例如，抗原決定簇或表位)的存在；例如，抗體通常識(shí)別和結(jié)合特異性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)而不是蛋白質(zhì)。如果抗體對(duì)表位“a”是特異性的，則在包含標(biāo)記的“a”和抗體的反應(yīng)中，包含表位a(或游離的、未標(biāo)記的a)的分子的存在將降低與抗體結(jié)合的標(biāo)記的a的量?！翱扇苄允荏w”是不與細(xì)胞膜結(jié)合的受體多肽?？扇苄允荏w是缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的最常見的配體結(jié)合受體多肽?？扇苄允荏w可包括附加的氨基酸殘基，諸如用于多肽的純化或?yàn)槎嚯呐c底物粘附提供位點(diǎn)的親和標(biāo)簽，或免疫球蛋白恒定區(qū)序列。許多細(xì)胞表面受體具有天然存在的由蛋白水解產(chǎn)生的可溶性對(duì)應(yīng)物。當(dāng)可溶性受體多肽缺乏分別提供膜錨定或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的足夠的跨膜和胞內(nèi)多肽區(qū)段的部分時(shí)，它們被認(rèn)為是基本上不含跨膜和胞內(nèi)多肽區(qū)段?！敖y(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的”是指結(jié)果不太可能是偶然發(fā)生的。統(tǒng)計(jì)顯著性可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)確定。通常使用的顯著性測(cè)量值包括p值，它是在無(wú)效假設(shè)是真的情況下所觀察到的事件將發(fā)生的頻率或概率。如果獲得的p值小于顯著性水平，則無(wú)效假設(shè)被拒絕。在簡(jiǎn)單的情況下，顯著性水平被限定在0.05或更小的p值。“下降的”或“減少的”或“更少的”量通常是“統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的”或生理學(xué)上顯著的量，并且可以包括是本文中描述的量或水平的約1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50倍或更多倍(例如，100、500、1000倍)(包括在之間和在1以上的所有整數(shù)和小數(shù)點(diǎn)，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)的下降。術(shù)語(yǔ)“刺激”是指通過(guò)將刺激分子(例如，tcr/cd3復(fù)合物)與其同源配體結(jié)合而誘導(dǎo)的初級(jí)應(yīng)答，由此介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，諸如經(jīng)tcr/cd3復(fù)合物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。刺激可介導(dǎo)某些分子的改變的表達(dá)，諸如tgf-β的下調(diào)和/或細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的再組織等等?！按碳し肿印敝傅氖桥c存在于抗原呈遞細(xì)胞上的同源刺激配體特異性結(jié)合的t細(xì)胞上的分子。“刺激配體”指的是當(dāng)存在于抗原呈遞細(xì)胞(例如，apc、樹突細(xì)胞、b-細(xì)胞等等)上時(shí)，可與t細(xì)胞上的同源結(jié)合配偶體(在本文中被稱為“刺激分子”)特異性結(jié)合的配體，由此介導(dǎo)t細(xì)胞的初級(jí)應(yīng)答，包括活化、免疫應(yīng)答的開始、增殖等等。刺激配體在本領(lǐng)域中是公知的，并且尤其包括負(fù)載有肽的mhci類分子、抗-cd3抗體、超激動(dòng)劑抗-cd28抗體，以及超激動(dòng)劑抗-cd2抗體。如本文所使用的，“基本上純化的”細(xì)胞為基本上不含其它細(xì)胞類型的細(xì)胞?；旧霞兓募?xì)胞也指的是已經(jīng)與在其天然存在狀態(tài)下與其正常相關(guān)聯(lián)的其它細(xì)胞類型分離的細(xì)胞。在一些情況下，基本上純化的細(xì)胞群指的是均質(zhì)細(xì)胞群。在其它情況下，該術(shù)語(yǔ)僅僅指的是已經(jīng)與在其天然狀態(tài)下與其自然相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞分離的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，細(xì)胞在體外培養(yǎng)。在其它實(shí)施例中，細(xì)胞不在體外培養(yǎng)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“治療的”表示治療和/或預(yù)防。治療作用通過(guò)疾病狀態(tài)的抑制、緩和或根除而獲得。術(shù)語(yǔ)“治療有效量”指的是將引發(fā)由研究者、獸醫(yī)、醫(yī)生或其它臨床醫(yī)師所尋求的組織、系統(tǒng)或受試者的生物學(xué)或醫(yī)學(xué)應(yīng)答的受試者化合物的量。術(shù)語(yǔ)“治療有效量”包括當(dāng)施用化合物時(shí)足以預(yù)防被治療的紊亂或疾病的跡象或癥狀中的一個(gè)或多個(gè)的發(fā)展，或在一定程度上減輕被治療的紊亂或疾病的跡象或癥狀中的一個(gè)或多個(gè)的化合物的量。治療有效量將根據(jù)化合物、疾病和其嚴(yán)重性、以及待治療的受試者的年齡、重量等而變化。如本文所使用的術(shù)語(yǔ)，“治療”疾病是指降低受試者經(jīng)歷的疾病或紊亂的至少一種跡象或癥狀的頻率或嚴(yán)重性。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染的”或“轉(zhuǎn)化的”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)的”指的是外源核酸被轉(zhuǎn)移或引入到宿主細(xì)胞中的過(guò)程?！稗D(zhuǎn)染的”或“轉(zhuǎn)化的”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)的”細(xì)胞是已經(jīng)由外源核酸轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。所述細(xì)胞包括原代受試者細(xì)胞及其子代。如本文所使用的，短語(yǔ)“在轉(zhuǎn)錄控制下”或“可操作地連接”是指啟動(dòng)子在相對(duì)于多核苷酸的正確位置和朝向上，以控制通過(guò)rna聚合酶進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄的開始和多核苷酸的表達(dá)?！拜d體”為包括分離的核酸，并且可用于將分離的核酸傳遞至細(xì)胞內(nèi)部的物質(zhì)組合物。很多載體在本領(lǐng)域中是已知的，包括線性多核苷酸、與離子或兩性分子化合物相關(guān)的多核苷酸、質(zhì)粒和病毒。因此，術(shù)語(yǔ)“載體”包括自主復(fù)制的質(zhì)?；虿《尽Ｔ撔g(shù)語(yǔ)也應(yīng)當(dāng)被解釋為包括便于將核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的非質(zhì)粒和非病毒化合物，例如聚賴氨酸化合物、脂質(zhì)體等等。病毒載體的實(shí)例包括但不限于，腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等等。例如，慢病毒是復(fù)雜的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中，除了常見的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因gag、pol和env之外，其還包含具有調(diào)節(jié)或結(jié)構(gòu)功能的其它基因。慢病毒載體在本領(lǐng)域中是公知的。慢病毒的一些實(shí)例包括人類免疫缺陷病毒：hiv-1、hiv-2和猿猴免疫缺陷病毒：siv。慢病毒載體通過(guò)將大多的hiv的致病基因剔除而產(chǎn)生，例如基因env、vif、vpr、vpu和nef被刪除使得載體具有生物安全性。范圍：在整個(gè)本公開中，本公開的各個(gè)方面可以以范圍格式給出。應(yīng)當(dāng)理解，范圍格式的描述僅是為了方便和簡(jiǎn)潔，并且不應(yīng)當(dāng)被解釋為對(duì)本公開的范圍的硬性限制。因此，范圍的描述應(yīng)被認(rèn)為具有具體公開的所有可能的子范圍以及處于那個(gè)范圍內(nèi)的單個(gè)數(shù)值。例如，范圍的描述諸如從1至6應(yīng)被認(rèn)為具有具體公開的子范圍諸如從1至3、從1至4、從1至5、從2至4、從2至6、從3至6等，以及那個(gè)范圍內(nèi)的單個(gè)數(shù)值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范圍的寬度如何，這一點(diǎn)都是適用的。本公開涉及分離的核酸序列、包括分離的核酸序列的載體、包括分離的核酸序列的細(xì)胞和使用這些細(xì)胞治療癌癥的方法。組合物和治療應(yīng)用本文的實(shí)施例涉及一種包括編碼經(jīng)修飾的程序性細(xì)胞死亡蛋白質(zhì)1(pd-1)的核酸序列和編碼嵌合抗原受體(car)的核酸序列的分離的核酸序列。在一些實(shí)施例中，經(jīng)修飾的pd-1和car被表達(dá)為基因產(chǎn)物，所述基因產(chǎn)物是單獨(dú)的多肽。在這些情況下，car對(duì)存在于癌細(xì)胞上的腫瘤抗原是特異性的，并且所述癌細(xì)胞表達(dá)pd-l1。car是通常包括胞外結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的分子。胞外結(jié)構(gòu)域包括靶特異性結(jié)合元件。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(例如胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域)包括共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和ζ鏈部分。共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)指的是包括共刺激分子的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的car的一部分。共刺激分子為淋巴細(xì)胞針對(duì)抗原的有效應(yīng)答所需要的細(xì)胞表面分子，而不是抗原受體或它們的配體。在car的胞外結(jié)構(gòu)域與跨膜結(jié)構(gòu)域之間，可并入間隔結(jié)構(gòu)域。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“間隔結(jié)構(gòu)域”通常指起到將跨膜結(jié)構(gòu)域連接至多肽鏈的胞外結(jié)構(gòu)域或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的作用的任何寡肽或多肽。間隔結(jié)構(gòu)域可包括高達(dá)300個(gè)氨基酸，優(yōu)選地10至100個(gè)氨基酸并且最優(yōu)選地25至50個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施例中，在本公開中的car的靶特異性結(jié)合元件可以識(shí)別腫瘤抗原。腫瘤抗原是由引發(fā)免疫應(yīng)答，特別是t-細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。腫瘤抗原在本領(lǐng)域中是公知的，并且包括例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)抗原、癌胚抗原(cea)、β-人絨毛膜促性腺激素、α-胎蛋白(afp)、凝集素-反應(yīng)性afp、甲狀腺球蛋白、rage-1、mn-caix、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶、ru1、ru2(as)、腸道羧酸酯酶、muthsp70-2、m-csf、前列腺酶、前列腺特異性抗原(psa)、pap、ny-eso-l、lage-la、p53、prostein、psma、her2/neu、存活素和端粒酶、前列腺癌腫瘤抗原-1(pcta-1)、mage、elf2m、中性白細(xì)胞彈性蛋白酶、埃甫蛋白b2、cd22、胰島素生長(zhǎng)因子(igf)-i、igf-ii、igf-i受體和間皮素。在一些實(shí)施例中，腫瘤抗原包括her2、cd19、cd20、cd22、κ輕鏈、cd30、cd33、cd123、cd38、ror1、erbb3/4、egfr、egfrviii、epha2、fap、癌胚抗原、egp2、egp40、間皮素、tag72、psma、nkg2d配體、b7-h6、il-13受體α2、il-11受體α、muc1、muc16、ca9、gd2、gd3、hmw-maa、cd171、lewisy、g250/caix、hla-aimagea1、hla-a2ny-eso-1、psc1、葉酸受體-α、cd44v7/8、8h9、ncam、vegf受體、5t4、胎兒型乙酰膽堿受體、nkg2d配體、cd44v6、tem1、tem8，或者由腫瘤表達(dá)的病毒相關(guān)抗原。在一些實(shí)施例中，本公開的car的抗原結(jié)合元件以cd19為靶點(diǎn)。在一些情況下，本公開的car的抗原結(jié)合元件包括抗cd19scfv，所述抗cd19scfv包括在seqidno:1中列出的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，本公開的car的跨膜結(jié)構(gòu)域包括cd8或cd9跨膜結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，本公開的car的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括4-1bb(cd137)或cd28的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。pd-1，cd28家族的一個(gè)成員，是具有包含單個(gè)免疫球蛋白(ig)樣的可變結(jié)構(gòu)域的胞外結(jié)構(gòu)域和包含基于免疫受體酪氨酸的抑制基序的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的1型跨膜蛋白質(zhì)。pd-1在活化的t細(xì)胞、b淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹突細(xì)胞和活化的單核細(xì)胞上表達(dá)。pd-1與其配體pd-l1和pd-l2之間的相互作用導(dǎo)致t細(xì)胞耗盡、失活和細(xì)胞凋亡。耗盡的t淋巴細(xì)胞喪失產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子(包括il-2、腫瘤壞死因子α和干擾素-γ)的能力。由不同組織進(jìn)行的pd-l1的表達(dá)介導(dǎo)外周免疫耐受性，并且pd-1/pd-l1的活化限制持續(xù)的免疫/炎癥應(yīng)答后的組織損傷。pd-1表達(dá)的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞與受損的抗腫瘤作用和pd-1的上調(diào)相關(guān)，而pd-l1與幾個(gè)腫瘤類型的結(jié)果相關(guān)。實(shí)施例涉及一種包括編碼經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列和編碼嵌合抗原受體(car)的核酸序列的分離的核酸序列。在一些實(shí)施例中，與編碼野生型pd-1的胞內(nèi)部分的核酸序列相比，編碼經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列可以包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代或缺失。在某些實(shí)施例中，與編碼野生型pd-1的胞內(nèi)部分的核酸序列相比，編碼經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失。例如，經(jīng)修飾的pd-1是包括seqidno:14的核酸序列的人pd-1。在一些實(shí)施例中，編碼經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列包括編碼截?cái)嗟膒d-1的核酸，所述截?cái)嗟膒d-1不包括胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。例如，編碼經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列包括seqidno:12的核酸序列。在一些實(shí)施例中，與野生型pd-1相比，經(jīng)修飾的pd-1包括一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變。在某些實(shí)施例中，點(diǎn)突變可以包括野生型pd-1的磷酸化位點(diǎn)的一個(gè)或兩個(gè)氨基酸點(diǎn)突變。例如，氨基酸點(diǎn)突變包括酪氨酸殘基223和/或酪氨酸殘基248的點(diǎn)突變。本公開的實(shí)施例進(jìn)一步涉及一種包括編碼car和經(jīng)修飾的pd-1的序列的dna構(gòu)建體。在一些實(shí)施例中，car可以包括cd3-ζ、cd28、4-1bb等的任意組合。例如，本公開的car包括抗cd19scfv、人cd8鉸鏈和跨膜結(jié)構(gòu)域，以及人4-1bb和cd3ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施例中，本公開的car包括在seqidno:1中列出的核酸序列。在一些實(shí)施例中，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(ires)元件用于產(chǎn)生多基因或多順反子信息。例如，ires元件可以將編碼car的核酸序列和編碼各種經(jīng)修飾的pd-1(見表1)中的一種的核酸序列連接起來(lái)。編碼所需分子的核酸序列可以使用本領(lǐng)域中已知的重組方法獲得，例如使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過(guò)從表達(dá)基因的細(xì)胞篩選文庫(kù)、通過(guò)從已知包括基因的載體衍生該基因，或者通過(guò)直接從含有基因的細(xì)胞或組織中分離該基因而獲得。可選地，也可以合成而非克隆生產(chǎn)感興趣的基因。本公開的實(shí)施例進(jìn)一步涉及將本發(fā)明的dna插入其中的載體。從逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如慢病毒)衍生的載體是實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期的基因轉(zhuǎn)移的合適的工具，因?yàn)樗鼈冊(cè)试S轉(zhuǎn)基因的長(zhǎng)期、穩(wěn)定的整合及其在子細(xì)胞中的繁殖。與從致癌性逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如鼠白血病病毒)衍生的載體相比，慢病毒載體具有附加優(yōu)點(diǎn)，在于因?yàn)樗鼈兡苻D(zhuǎn)導(dǎo)非增殖細(xì)胞，例如肝細(xì)胞。它們也具有低免疫原性的附加優(yōu)點(diǎn)。編碼car和經(jīng)修飾的pd-1的天然或合成的核酸的表達(dá)通常通過(guò)將編碼car多肽或其部分的核酸可操作地連接至一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子，以及將所述構(gòu)建體整合到表達(dá)載體中來(lái)實(shí)現(xiàn)。所述載體可適合于復(fù)制和整合真核生物。典型的克隆載體包含轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、起始序列和用于調(diào)節(jié)所需的核酸序列的表達(dá)的啟動(dòng)子。在美國(guó)專利號(hào)us8,906,682中提供了與編碼car和經(jīng)修飾的pd-1并且將基因轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)合成核酸有關(guān)的附加信息，所述專利全文引入作為參考。實(shí)施例進(jìn)一步涉及表達(dá)car和經(jīng)修飾的pd-1的經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞(例如，t細(xì)胞)。在一些實(shí)施例中，將顯性陰性pd-1引入t細(xì)胞中，使得顯性陰性pd-1抑制由腫瘤細(xì)胞的pd-l1誘導(dǎo)的野生型pd-1活性。在某些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的t細(xì)胞表達(dá)非功能性pd-1。例如，經(jīng)遺傳修飾的t細(xì)胞表達(dá)不包括胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、不包括胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域，或包括如在本公開中所描述的點(diǎn)突變的pd-1分子。在一些實(shí)施例中，腫瘤細(xì)胞的pd-l1對(duì)本公開的經(jīng)遺傳修飾的t細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制作用小于pd-l1對(duì)不包括編碼經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列的至少一部分的t細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制作用。例如，pd-l1對(duì)本公開的經(jīng)遺傳修飾的t細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制作用足以減少pd-l1對(duì)不包括編碼經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列的至少一部分的t細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制作用的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。在一些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的t細(xì)胞包括編碼與野生型pd-1相比具有一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變的經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列。例如，所述點(diǎn)突變包含野生型pd-1的磷酸化位點(diǎn)的一個(gè)或兩個(gè)氨基酸點(diǎn)突變。在某些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的t細(xì)胞包括編碼經(jīng)修飾的pd-1且與編碼野生型pd-1的胞內(nèi)部分的核酸序列相比包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失的核酸序列。例如，編碼經(jīng)修飾的pd-1的核酸序列包含seqidno:12或seqidno:14的核酸序列。實(shí)施例進(jìn)一步涉及用于治療患者的疾病的方法，所述方法包括向患者施用有效量的本公開的工程化細(xì)胞。各種疾病可以根據(jù)本發(fā)明的方法加以治療，所述疾病包括癌癥，諸如卵巢癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、前列腺癌和白血病。在一些實(shí)施例中，所述方法包括向人患者施用藥物組合物，所述藥物組合物包括抗腫瘤有效量的人t細(xì)胞群，其中所述人t細(xì)胞群包括包含如在本公開中所描述的核酸序列的人t細(xì)胞?？芍委煹陌┌Y包括沒有被血管化或基本上還沒有被血管化的腫瘤，以及血管化的腫瘤。癌癥可包括非實(shí)體腫瘤(諸如血液性腫瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括實(shí)體腫瘤。利用本公開的car治療的癌癥的類型包括但不限于癌、胚細(xì)胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴惡性腫瘤、良性和惡性腫瘤、以及惡性腫瘤,例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人腫瘤/癌癥和小兒腫瘤/癌癥。血液性癌癥為血液或骨髓的癌癥。血液性(或血源性)癌癥的實(shí)例包括白血病，包括急性白血病(諸如急性淋巴細(xì)胞白血病、急性髓細(xì)胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓細(xì)胞性白血病、前髓細(xì)胞性白血病、骨髓單核單核細(xì)胞性白血病、單核細(xì)胞性白血病和紅白血病)、慢性白血病(諸如慢性髓細(xì)胞(粒細(xì)胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴細(xì)胞白血病)、真性紅細(xì)胞增多癥、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(不活躍形式和高等級(jí)形式)、多發(fā)性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥、重鏈疾病、骨髓增生異常綜合征、多毛細(xì)胞白血病和脊髓發(fā)育不良。實(shí)體腫瘤為通常不包含囊腫或液體區(qū)的組織的異常腫塊。實(shí)體腫瘤可為良性或惡性的。不同類型的實(shí)體腫瘤以形成它們的細(xì)胞類型命名(諸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。實(shí)體腫瘤(諸如肉瘤和癌)的實(shí)例包括纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、淋巴類惡性腫瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、甲狀腺髓樣癌、乳頭狀甲狀腺癌、嗜鉻細(xì)胞瘤皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞瘤、膽管癌、絨膜癌、維爾姆斯氏腫瘤、子宮頸癌、睪丸腫瘤、精原細(xì)胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和cns腫瘤(諸如神經(jīng)膠質(zhì)瘤(諸如腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤和混合性神經(jīng)膠質(zhì)瘤)、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(也稱為多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)、星形細(xì)胞瘤、cns淋巴瘤、生殖細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤和腦轉(zhuǎn)移瘤)。通常，如本文所述的活化和擴(kuò)增的細(xì)胞可以用于治療和預(yù)防免疫受損的個(gè)體出現(xiàn)的疾病。特別地，本公開的工程化細(xì)胞用于治療癌癥。在某些實(shí)施例中，本公開的細(xì)胞用于治療處于發(fā)展成癌癥的風(fēng)險(xiǎn)中的患者。因此，本公開提供用于治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包含向需要其的受試者施用治療有效量的本公開的工程化t細(xì)胞。本公開的工程化t細(xì)胞可被單獨(dú)施用或作為藥物組合物與稀釋劑和/或與其它成分(諸如il-2或其它細(xì)胞因子或細(xì)胞群)結(jié)合施用。簡(jiǎn)單地說(shuō)，本公開的藥物組合物可包括如本文所述的靶細(xì)胞群，與一種或多種藥學(xué)或生理學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑結(jié)合。這樣的組合物可包括：緩沖液，諸如中性緩沖鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水等等；碳水化合物，諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白質(zhì)；多肽或氨基酸，諸如甘氨酸；抗氧化劑；螯合劑，諸如edta或谷胱甘肽；佐劑(例如，氫氧化鋁)；以及防腐劑。本公開的組合物優(yōu)選配制成用于靜脈內(nèi)施用。本公開的藥物組合物可以以適于待治療(或預(yù)防)的疾病的方式施用。施用的量和頻率將由以下因素確定，諸如患者的病癥、以及患者疾病的類型和嚴(yán)重度，盡管適當(dāng)?shù)膭┝靠捎膳R床試驗(yàn)確定。當(dāng)指出“免疫學(xué)有效量”、“抗腫瘤有效量”、“腫瘤抑制有效量”或“治療量”時(shí)，待施用的本公開的組合物的精確量可由醫(yī)師通過(guò)考慮個(gè)體的年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉(zhuǎn)移的程度，以及患者(受試者)的狀態(tài)的差異而確定。可以概括地說(shuō)：包含本文所描述的t細(xì)胞的藥物組合物可以以104至109個(gè)細(xì)胞/kg體重的劑量，優(yōu)選105至106個(gè)細(xì)胞/kg體重的劑量施用,包括那些范圍內(nèi)的所有整數(shù)值。t細(xì)胞組合物也可以以這些劑量多次施用。所述細(xì)胞可以通過(guò)使用免疫療法中通常已知的輸液技術(shù)施用(參見例如rosenberg等人，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志319:1676，1988年)。對(duì)于特殊患者的最佳劑量和治療方案可由醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)監(jiān)測(cè)患者的疾病跡象并相應(yīng)地調(diào)節(jié)治療容易地確定。在某些實(shí)施例中，可能期望向受試者施用活化的t細(xì)胞，并且隨后重新抽取血液(或進(jìn)行單采血液成分術(shù))，根據(jù)本公開活化來(lái)自其中的t細(xì)胞，并且將這些活化和擴(kuò)增的t細(xì)胞再輸給患者。該過(guò)程可每幾周進(jìn)行多次。在某些實(shí)施例中，t細(xì)胞可通過(guò)10cc至400cc的血液抽取來(lái)進(jìn)行活化。在某些實(shí)施例中，t細(xì)胞通過(guò)20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的血液抽取來(lái)進(jìn)行活化。不受理論所束縛，利用這種多次血液抽取/多次再輸液方案可選出某些t細(xì)胞群。受試者組合物的施用可以以任何方便的方式進(jìn)行，包括通過(guò)霧化吸入、注射、吞咽、輸液、植入或移植。本文描述的組合物可經(jīng)皮下、皮內(nèi)、瘤內(nèi)、結(jié)內(nèi)、脊髓內(nèi)、肌肉內(nèi)、通過(guò)靜脈內(nèi)(i.v.)注射或腹膜內(nèi)施用給患者。在一個(gè)實(shí)施例中，本公開的t細(xì)胞組合物通過(guò)皮內(nèi)或皮下注射施用給患者。在另一個(gè)實(shí)施例中，本公開的t細(xì)胞組合物優(yōu)選地通過(guò)i.v.注射施用。t細(xì)胞的組合物可被直接注射到腫瘤、淋巴結(jié)或感染部位中。在本公開的某些實(shí)施例中，利用本文所描述的方法或本領(lǐng)域已知的其它方法活化和擴(kuò)增的細(xì)胞(其中t細(xì)胞被擴(kuò)增至治療水平)與任何數(shù)量的相關(guān)治療方式結(jié)合(例如，在其之前、同時(shí)或之后)施用給患者，所述相關(guān)治療方式包括但不限于用試劑進(jìn)行治療，諸如抗病毒療法、西多福韋和白細(xì)胞介素-2、阿糖胞苷(也稱為ara-c)或?qū)s患者的那他珠單抗治療或?qū)εＦぐ_患者的依法利珠單抗治療或?qū)ml患者的其它治療。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，本公開的t細(xì)胞可與以下各項(xiàng)結(jié)合使用：化療、輻射、免疫抑制劑(諸如環(huán)孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麥考酚酯和fk506)、抗體，或其它免疫燒蝕劑(諸如campath、抗-cd3抗體或其它抗體療法、細(xì)胞毒素、氟達(dá)拉濱、環(huán)孢菌素、fk506、雷帕霉素、麥考酚酸、類固醇類、fr901228、細(xì)胞因子和輻射。這些藥物抑制鈣依賴性的磷酸酶鈣調(diào)磷酸酶(環(huán)孢菌素和fk506)或抑制對(duì)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)重要的p70s6激酶(雷帕霉素)。(liu等人，《細(xì)胞(cell)》66:807-815，1991；henderson等人，《免疫(immun.)》73:316-321，1991年；bierer等人，《免疫學(xué)新觀點(diǎn)(curr.opin,immun.)》5:763-773，1993年；isoniemi(同上))。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，本公開的細(xì)胞組合物與骨髓移植、利用化療劑(諸如氟達(dá)拉濱)的t細(xì)胞燒蝕療法、外部光束放射療法(xrt)、環(huán)磷酰胺，或抗體(諸如okt3或campath)結(jié)合(例如，在其之前、同時(shí)或之后)施用給患者。在另一個(gè)實(shí)施例中，本公開的細(xì)胞組合物在b-細(xì)胞燒蝕療法(諸如與cd20反應(yīng)的試劑，例如rituxan)之后進(jìn)行施用。例如，在一個(gè)實(shí)施例中，受試者可經(jīng)歷高劑量化療的標(biāo)準(zhǔn)治療，之后進(jìn)行外周血液干細(xì)胞移植。在某些實(shí)施例中，在移植后，受試者接受本公開的擴(kuò)增的免疫細(xì)胞的輸注。在一個(gè)附加的實(shí)施例中，擴(kuò)增的細(xì)胞在外科手術(shù)之前或之后施用。施用給患者的以上治療的劑量將隨著治療病癥的精確屬性和治療的接受者而變化。人施用的劑量比例可根據(jù)本領(lǐng)域接受的實(shí)踐實(shí)施。例如，campath的劑量對(duì)于成人患者通常將在1至約100mg的范圍中，通常每天施用，持續(xù)1至30天。盡管在一些情況下可以使用高達(dá)40mg/天的較大劑量，但優(yōu)選的日劑量為1至10mg/天(在美國(guó)專利號(hào)6,120,766中描述，所述專利全文引入作為參考)。在美國(guó)專利號(hào)us8,906,682中提供了關(guān)于使用工程化t細(xì)胞治療癌癥的方法的其它信息，所述專利全文引入作為參考。實(shí)施例進(jìn)一步涉及治療和/或抑制受試者的癌癥的方法。該方法包括向受試者施用治療有效量的可溶性受體，所述可溶性受體包括pd-1的胞外結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，所述可溶性受體結(jié)合pd-l1蛋白質(zhì)，并且可溶性受體破壞癌細(xì)胞的pd-1信號(hào)傳導(dǎo)和/或破壞pd-1與pd-l1的結(jié)合。在某些實(shí)施例中，分離的可溶性受體多肽包括seqidno:9的氨基酸殘基20-519?！翱扇苄允荏w”是不與細(xì)胞膜結(jié)合的受體多肽?？扇苄允荏w是缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的最常見的配體結(jié)合受體多肽?？扇苄允荏w可包括附加的氨基酸殘基，諸如用于多肽的純化或?yàn)槎嚯呐c底物粘附提供位點(diǎn)的親和標(biāo)簽，或免疫球蛋白恒定區(qū)序列。許多細(xì)胞表面受體具有天然存在的由蛋白水解產(chǎn)生的可溶性對(duì)應(yīng)物。當(dāng)可溶性受體多肽缺乏分別提供膜錨定或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的足夠的跨膜和胞內(nèi)多肽區(qū)段的部分時(shí)，它們被認(rèn)為是基本上不含跨膜和胞內(nèi)多肽區(qū)段。實(shí)施例進(jìn)一步涉及包括受體多肽的經(jīng)修飾的細(xì)胞，所述受體多肽的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域被截?cái)啵鍪荏w多肽是程序性細(xì)胞死亡蛋白質(zhì)1(pd-1)受體多肽、細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白質(zhì)4(ctla-4)受體多肽，或者b和t淋巴細(xì)胞衰減因子(btla)受體的至少一種。實(shí)施例進(jìn)一步涉及一種用于治療患有疾病的受試者的方法。該方法包括向患有疾病的受試者施用細(xì)胞，其中所述細(xì)胞經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)：受體多肽，所述受體多肽的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域被截?cái)?，所述受體多肽是程序性細(xì)胞死亡蛋白質(zhì)1(pd-1)受體多肽、細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白質(zhì)4(ctla-4)受體多肽，或者b和t淋巴細(xì)胞衰減因子(btla)受體的至少一種；以及包括特異性抗體的抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體(car)或者經(jīng)修飾的或野生型t細(xì)胞受體，所述特異性抗體與抗原結(jié)合。在一些實(shí)施例中，所述受體多肽是pd-1受體多肽，并且其中所述pd-1受體多肽的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域含有基于免疫受體酪氨酸的基序。實(shí)施例進(jìn)一步涉及相比于相應(yīng)的野生型細(xì)胞包括減少量的一種或多種受體的經(jīng)修飾的細(xì)胞，所述一種或多種受體包括程序性細(xì)胞死亡蛋白質(zhì)1(pd-1)、細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白質(zhì)4(ctla-4)，或者b和t淋巴細(xì)胞衰減因子(btla)中的至少一種。實(shí)施例進(jìn)一步涉及一種用于治療患有疾病的受試者的方法。該方法包括向患有疾病的受試者施用細(xì)胞，其中，與相應(yīng)的野生型細(xì)胞相比，所述細(xì)胞經(jīng)修飾以表達(dá)減少量的一種或多種受體，所述一種或多種受體包括程序性細(xì)胞死亡蛋白質(zhì)1(pd-1)、細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白質(zhì)4(ctla-4)，或者b和t淋巴細(xì)胞衰減因子(btla)中的至少一種。在一些實(shí)施例中，經(jīng)修飾的細(xì)胞進(jìn)一步包括：包括特異性抗體的抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體(car)，或者經(jīng)修飾的或野生型t細(xì)胞受體。在某些實(shí)施例中，經(jīng)修飾的細(xì)胞進(jìn)一步包括：包括特異性抗體的抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體(car)，或者經(jīng)修飾的或野生型t細(xì)胞受體，所述特異性抗體與抗原結(jié)合。在一些實(shí)施例中，與相應(yīng)的野生型細(xì)胞相比，經(jīng)修飾的細(xì)胞具有一個(gè)或多個(gè)基因的降低的表達(dá)，所述一個(gè)或多個(gè)基因的降低的表達(dá)與一種或多種受體的生物合成途徑或輸送途徑或其組合相關(guān)聯(lián)。在某些實(shí)施例中，經(jīng)修飾的細(xì)胞包括一個(gè)或多個(gè)基因的破壞。在某些實(shí)施例中，經(jīng)修飾的細(xì)胞包括一個(gè)或多個(gè)基因的部分或完全缺失。在某些實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞在人患者體內(nèi)復(fù)制。在一些實(shí)施例中，經(jīng)修飾的細(xì)胞形成人患者的記憶細(xì)胞。在這些情況下，經(jīng)修飾的細(xì)胞經(jīng)靜脈內(nèi)施用給人患者。在某些實(shí)施例中，經(jīng)修飾的細(xì)胞持續(xù)存在人患者中。例如，經(jīng)修飾的細(xì)胞是自體t細(xì)胞。對(duì)于另一個(gè)實(shí)例，細(xì)胞可以包括b細(xì)胞、t細(xì)胞、nk細(xì)胞、胚胎細(xì)胞或樹突細(xì)胞中的至少一種。在一些實(shí)施例中，所述疾病可以包括癌癥、免疫缺陷、自身免疫性疾病，或肥胖癥中的至少一種。實(shí)例通過(guò)參考以下實(shí)例進(jìn)一步描述本公開。提供這些實(shí)例僅用于說(shuō)明的目的，且并非旨在限制，除非另有說(shuō)明。因此，本公開不應(yīng)當(dāng)以任何方式被解釋為限于以下實(shí)例，而是應(yīng)當(dāng)被解釋為包括由于本文所提供的教導(dǎo)而變得明顯的任何和所有變化。實(shí)例1car和pd-1在hek293t和k562細(xì)胞上的表達(dá)生成編碼由腦心肌炎病毒內(nèi)部核糖體進(jìn)入序列分離的cd19car和經(jīng)修飾的pd-1的慢病毒載體(參見通過(guò)引用并入本文中的《t細(xì)胞的包含cd137信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)增強(qiáng)的存活率的嵌合受體和增加的抗白血病療效的體內(nèi)分子療法(chimericreceptorscontainingcd137signaltransductiondomainsmediateenhancedsurvivaloftcellsandincreasedantileukemicefficacyinvivomoleculartherapy)》，第17卷，第8期，1453–1464，2009年8月)。圖1和表1中提供了編碼car和經(jīng)修飾的pd-1的dna構(gòu)建體的信息。在表1-3中列出了這些構(gòu)建體和模塊的總結(jié)。表1dna構(gòu)建體和編碼模塊hek293t和k562細(xì)胞用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。進(jìn)行流式細(xì)胞獲取并分析以確定car和pd-1在這些細(xì)胞中的表達(dá)。如圖2a和圖2b所示，keck293t和k562細(xì)胞表達(dá)car(參見圖2a中的方框)和pd-1(參見圖2b中的方框)。從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc；弗吉尼亞州馬納薩斯)獲得hek293t和k562細(xì)胞。與細(xì)胞培養(yǎng)物、慢病毒載體的構(gòu)建，以及流式細(xì)胞術(shù)有關(guān)的技術(shù)可以在通過(guò)引用并入本文中的以下文獻(xiàn)中找到：《t細(xì)胞的包含cd137信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)增強(qiáng)的存活率的嵌合受體和增加的抗白血病療效的體內(nèi)分子療法，第17卷，第8期，1453–1464，2009年8月，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文。表2各種構(gòu)建體的序列標(biāo)識(shí)符seqidno:#標(biāo)識(shí)符seqidno:1p0(核酸序列)seqidno:2p1(核酸序列)seqidno:3p2(核酸序列)seqidno:4p3(核酸序列)seqidno:5p4(核酸序列)seqidno:6ires元件(核酸序列)seqidno:7pdl1-ires-egfp(核酸序列)seqidno:8pd-1信號(hào)肽(氨基酸序列)seqidno:9pd-1胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸序列)seqidno:10pd-1跨膜結(jié)構(gòu)域(氨基酸序列)seqidno:11p1：添加的親水性鏈段seqidno:12p2：pd-1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域殘基(氨基酸序列)seqidno:13p3：pd-1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域殘基(氨基酸序列)seqidno:14p4：pd-1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域殘基(氨基酸序列)seqidno:15p2：pd-1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的移除部分(氨基酸序列)seqidno:16p4：pd-1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的移除部分(氨基酸序列)實(shí)例2car和pd-1在原代t細(xì)胞上的表達(dá)從患者獲得原代t細(xì)胞。所獲得的原代t細(xì)胞用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。進(jìn)行流式細(xì)胞獲取并分析以確定car和pd-1在原代t細(xì)胞中的表達(dá)。如圖3a、圖3b和圖3c所示，原代t細(xì)胞表達(dá)car(參見圖3a中的方框)和pd-1(參見圖3b和圖3c中的方框)。與細(xì)胞培養(yǎng)物、慢病毒載體的構(gòu)建，以及流式細(xì)胞術(shù)有關(guān)的技術(shù)可以在以下文獻(xiàn)中找到：《利用包含cd28和cd137結(jié)構(gòu)域的經(jīng)遺傳重新靶向的人t細(xì)胞控制大的、所建立的腫瘤異種移植物(controloflarge，establishedtumorxenograftswithgeneticallyretargetedhumantcellscontainingcd28andcd137domains)》，3360–3365pnas，2009年3月3日，第106卷，第9期，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文。表3序列實(shí)例3細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞測(cè)定在該測(cè)定中，通過(guò)將用效應(yīng)子細(xì)胞培養(yǎng)的靶細(xì)胞(即，轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞)的存活率與用陰性對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)的靶細(xì)胞(即，非轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞)的存活率進(jìn)行比較來(lái)測(cè)定對(duì)靶細(xì)胞(即，k562-cd19)的細(xì)胞毒性。將靶細(xì)胞和效應(yīng)子細(xì)胞或陰性對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)約24小時(shí)，其中靶細(xì)胞與效應(yīng)子細(xì)胞或陰性對(duì)照細(xì)胞之間的數(shù)量比為約10：1。測(cè)定靶細(xì)胞的存活率和轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞和非轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞的ifn-γ的產(chǎn)生。如圖4a和圖4b所示，含有編碼car和各種pd-1的核酸序列的轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞能夠釋放ifn-γ并且殺死cd19細(xì)胞。所有的誤差條代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。與細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞測(cè)定的構(gòu)建有關(guān)的技術(shù)可以在以下文獻(xiàn)中找到：《利用包含cd28和cd137結(jié)構(gòu)域的經(jīng)遺傳重新靶向的人t細(xì)胞控制大的、所建立的腫瘤異種移植物(controloflarge，establishedtumorxenograftswithgeneticallyretargetedhumantcellscontainingcd28andcd137domains)》，3360–3365pnas，2009年3月3日，第106卷，第9期，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文。實(shí)例4pd-l1-ires-egfpnalm-6細(xì)胞系的構(gòu)建生成編碼pd-l1-ires-egfp(seqidno:7)的慢病毒載體。nalm-6細(xì)胞用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)為moi為30或moi為100的t細(xì)胞。進(jìn)行流式細(xì)胞獲取并分析以確定car和pd-1在這些細(xì)胞中的表達(dá)。如圖5所示，nalm-6pd-l1表達(dá)pd-l1。從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc；弗吉尼亞州馬納薩斯)獲得nalm-6細(xì)胞。與細(xì)胞培養(yǎng)物、慢病毒載體的構(gòu)建，以及流式細(xì)胞術(shù)有關(guān)的技術(shù)可以在以下文獻(xiàn)中找到：《利用mrna工程t細(xì)胞治療小鼠的晚期白血病。人類基因療法(treatmentofadvancedleukemiainmicewithmrnaengineeredtcells。humangenetherapy)》，22:1575–1586(2011年12月),所述文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文。實(shí)例5由pd-l1誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的抑制作用在用car和經(jīng)修飾的pd-1轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞上降低將靶細(xì)胞(即，表達(dá)pd-l1的nalm-6或nalm-6)和各種效應(yīng)子細(xì)胞(即，轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞)或陰性對(duì)照細(xì)胞(即，非轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞)培養(yǎng)約24小時(shí)，其中靶細(xì)胞與效應(yīng)子細(xì)胞或陰性對(duì)照細(xì)胞的數(shù)量比為約10：1。測(cè)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞的ifn-γ產(chǎn)生。如圖6a和圖6b所示，cart細(xì)胞的ifn-γ產(chǎn)生降低，這表明pd-l1在nalm-6細(xì)胞上的表達(dá)造成細(xì)胞毒性損失。進(jìn)一步地，與不包括經(jīng)修飾的pd-1的cart細(xì)胞相比，由pd-l1誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的損失在用經(jīng)修飾的pd-1轉(zhuǎn)導(dǎo)的cart細(xì)胞上下降。例如，用car和具有點(diǎn)突變的pd-1(即，p3)轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞的細(xì)胞毒性的損失為約22％，其比不包括經(jīng)修飾的pd-1(即，p0)的cart細(xì)胞低43％。這表明，由pd-l1誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的抑制作用在用car和經(jīng)修飾的pd-1轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞上降低。所有的誤差條代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。與細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞測(cè)定的構(gòu)建有關(guān)的技術(shù)可以在以下文獻(xiàn)中找到：《t細(xì)胞的包含cd137信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)增強(qiáng)的存活率的嵌合受體和增加的抗白血病療效的體內(nèi)分子療法》，第17卷，第8期，1453–1464，2009年8月，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文。當(dāng)前第1頁(yè)12