本發(fā)明涉及制備透明質(zhì)酸鈉鹽(ha)的丁酸酯的方法以及包含由所述方法生產(chǎn)的透明質(zhì)酸鈉鹽(ha)的丁酸酯的藥物制劑、化妝品制劑或醫(yī)療裝置。

本發(fā)明描述了通過在水性環(huán)境中合成來制備透明質(zhì)酸鈉鹽(ha)的丁酸酯的方法，其令人驚奇地在丁酸酯中產(chǎn)生高度取代度(ds)并保留抵抗分子降解的天然透明質(zhì)酸的多糖鏈。通過所述方法制備的透明質(zhì)酸的丁酸酯不含在化妝品領(lǐng)域不耐受和/或禁止的雜質(zhì)，具有抗炎和抗刺激特性，且由此可以有利地用于藥物和皮膚美容領(lǐng)域和醫(yī)療裝置中。

本領(lǐng)域的狀態(tài)

已知透明質(zhì)酸丁酸酯(habut)(其中透明質(zhì)酸的羥基被具有不同取代度的丁酸殘基酯化)作為皮膚彈性增進(jìn)劑和增濕劑具有抗炎、抗增殖和皮膚保護(hù)特性。

透明質(zhì)酸及其鹽通過多糖鏈的糖苷鍵的水解而高度傾向于分子量降解。從文獻(xiàn)中已知，所述水解顯著地受到ph、離子強(qiáng)度和溫度條件的影響。

因此，ha的衍生條件對(duì)于保持多糖鏈的長(zhǎng)度至關(guān)重要。理想的條件是使反應(yīng)介質(zhì)中水的存在最小化并且牽涉不是很高的溫度和ph接近中性即介于5到8之間的條件的那些。

ep0941253描述了在堿性活化劑例如吡啶和n，n-二甲氨基吡啶(dmap)的存在下，在無質(zhì)子有機(jī)溶劑例如n，n-二甲基甲酰胺和二甲亞砜(dmf，dmso)中用丁酸酐制備具有低取代度(maxds＝0.25)的透明質(zhì)酸的丁酸酯。在有機(jī)溶劑中溶解的方法牽涉透明質(zhì)酸可力丁鎓鹽的制備，其通過用2nhci酸化多糖水溶液并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)溶劑而制備多糖的酸形式而獲得，這是一種導(dǎo)致ha的分子量降解的方法。

wo2005/092929描述了具有低取代度(ds≤0.1)的透明質(zhì)酸丁酸酯的制備。在均勻條件下的合成牽涉通過使用強(qiáng)陽離子-交換樹脂(amberliteir-120-plus)使其通過離子-交換柱來制備可溶于無質(zhì)子有機(jī)溶劑的透明質(zhì)酸四丁基銨(tba)鹽，所述通道導(dǎo)致分子量降解。

wo2009/068215描述了透明質(zhì)酸的混合丁酸-甲酸酯的制備及其在皮膚化妝品中的用途以及皮膚保護(hù)和抗炎活性?；旌系孽ヮ愂褂枚∷狒诩柞０?fa)中與堿性dmap活化劑一起制備。

所述方法使用無質(zhì)子和質(zhì)子有機(jī)溶劑，例如n，n二甲基甲酰胺、甲酰胺或二甲亞砜，這些有機(jī)溶劑列在根據(jù)regulation(ec)no.1223/2009的化妝品制劑禁忌物質(zhì)中。也可以使用有機(jī)堿，例如n，n二甲氨基吡啶，其具有高毒性特征(數(shù)十個(gè)ppm的ld50)。溶劑、試劑和活化劑的殘留物在純化過程中不能被定量消除。

ep0416250中報(bào)道了在水中用于透明質(zhì)酸衍生化的反應(yīng)，該文獻(xiàn)報(bào)道了由于與碳二亞胺或雙-碳二亞胺的反應(yīng)而在透明質(zhì)酸的羧基上形成n-酰基脲和o-異?；?。該反應(yīng)發(fā)生在水中、在不降解多糖的受控ph下進(jìn)行。

us5874417描述了在適度條件下用在水中的酰肼使透明質(zhì)酸的羧基官能化。

a.mero等人(polymer2014，6，346-369)報(bào)道ha可以在水中被衍生。然而，在水相中，需要在涉及ha鏈的明顯降解的酸性或堿性條件下進(jìn)行許多反應(yīng)。該論文報(bào)道了在水中與碳二亞胺的反應(yīng)，導(dǎo)致在羧基上形成酰胺鍵。

本發(fā)明的方法還產(chǎn)生具有高取代度的habut，僅使用水作為溶劑和碳酸鈉作為堿性活化劑。得到的產(chǎn)物不存在會(huì)引起特定安全問題的任何溶劑或堿性活化劑殘留物。

本發(fā)明的描述

本發(fā)明涉及制備用于藥物或化妝品用途或作為醫(yī)療裝置可接受的透明質(zhì)酸丁酸酯或其鹽的方法，包含使透明質(zhì)酸，優(yōu)選與鈉或另一種堿金屬成鹽的透明質(zhì)酸在水溶液中在碳酸鈉的存在下與丁酰基-咪唑交酯(imidazolide)反應(yīng)。

本發(fā)明的方法優(yōu)選用于制備透明質(zhì)酸丁酸酯鈉鹽。

該方法中使用的透明質(zhì)酸鈉鹽優(yōu)選具有在10³-10⁶道爾頓之間的重均分子量(mw)。

將透明質(zhì)酸鹽溶于去礦質(zhì)水，向所得溶液中加入碳酸鈉，然后加入丁?；?咪唑交酯。

將該反應(yīng)混合物維持在20℃至30℃的溫度下不少于60分鐘。

反應(yīng)的ph范圍介于ph11-9之間。

當(dāng)反應(yīng)完成時(shí)，將該混合物調(diào)節(jié)至中性ph，并通過在適合的溶劑中沉淀回收產(chǎn)物。然后將如此獲得的產(chǎn)物純化，例如通過用適合的溶劑連續(xù)洗滌并過濾。

本發(fā)明的方法產(chǎn)生具有不同取代度的透明質(zhì)酸丁酸酯。定義為每個(gè)透明質(zhì)酸的glcnac-glcua二糖單位中的丁酸殘基數(shù)之比的取代度(ds)可以在例如0.01-2.5之間。

通過改變透明質(zhì)酸和丁?；?咪唑交酯之比可以獲得不同的取代度。

通過本發(fā)明方法獲得的透明質(zhì)酸丁酸酯不含溶劑殘留物或毒性試劑，并且可用于藥物制劑、化妝品制劑和醫(yī)療裝置。

因此，本發(fā)明的主題包括包含透明質(zhì)酸丁酸酯或其鹽以及至少一種藥物或化妝品用途可接受的賦形劑和/或載體的藥物和化妝品制劑，所述透明質(zhì)酸丁酸酯或其鹽為藥物或化妝品用途可接受的，其通過上述報(bào)道的方法得到。

通過報(bào)道的方法獲得的透明質(zhì)酸丁酸酯由于不存在管理化妝品成分的立法禁止的溶劑和試劑而被報(bào)道而可以用于皮膚美容領(lǐng)域的局部應(yīng)用，在高安全性的制劑中具有水化、彈性、調(diào)色、抗衰老或抗-痤瘡的活性，其適合于例如低變應(yīng)原產(chǎn)品或敏感性皮膚。

如體外對(duì)中性白細(xì)胞模型(多形核白細(xì)胞或pmn)所驗(yàn)證的，該分子還具有比透明質(zhì)酸(ha)和丁酸鈉(nabut)更顯著的抗刺激和抗炎活性，從而影響急性炎癥應(yīng)答。作為所述特征的結(jié)果，通過所述方法生產(chǎn)的透明質(zhì)酸丁酸酯可用作藥物制劑、化妝品制劑或醫(yī)療裝置中的活性成分，作為用于治療皮膚損傷例如由過熱引起的炎癥、潰瘍和損傷的皮膚損傷的佐劑，所述過熱通過例如紫外線、x射線和γ射線的輻射誘導(dǎo)。

實(shí)施例

所用的儀器：

●安裝有具有用于測(cè)定取代度(ds)的z梯度的5mm多核反向探針的brukeravance400mhz光譜儀；

●安裝有用于測(cè)定分子量分布和重均分子量(mw)的三重檢測(cè)器(90℃和7℃的光散射，折射率和粘度計(jì))。

取代度(ds)的測(cè)定

通過nmr光譜法定量透明質(zhì)酸衍生物上丁酸酯的取代度。用安裝有具有z梯度的5mm多核反向探針的brukeravance400mhz光譜儀在d2o中得到¹hnmr光譜。通過將測(cè)量探頭恒溫至300°k進(jìn)行測(cè)試。

該測(cè)試包括擴(kuò)散有序光譜(dosy)分析，其驗(yàn)證聚合物和丁酸之間共價(jià)鍵的存在。

丁酸酯中ds的定量直接在nmr管中用naod徹底水解后進(jìn)行。

水解物的¹hnmr光譜允許整合可以歸因于丁酸的信號(hào)(連位甲基和亞甲基質(zhì)子)和可歸因于透明質(zhì)酸的信號(hào)(糖質(zhì)子，不包括兩個(gè)端基異頭質(zhì)子)；它們的比例決定了取代度。

方法

通過hp-sec-tda色譜法測(cè)定分子量和重均分子量(mw)分布

使用3個(gè)檢測(cè)器(在90°和7°的光散射，折射率和粘度計(jì))的組合對(duì)樣品進(jìn)行尺寸排阻色譜。色譜圖的處理使分子量mw(重均分子量)的分布得到確定。

色譜條件

儀器viscotek270max。

柱：a7000，a6000mx2，溫度35℃。

流動(dòng)相：pbs。

流速：0.750ml/min。

檢測(cè)器：安裝有折射計(jì)、毛細(xì)管粘度計(jì)和在90°和7°、溫度35℃下的測(cè)量值的光散射的viscotektda。

注射體積：100μl。

超氧陰離子產(chǎn)生評(píng)價(jià)

在包被纖維蛋白原(fbg)、膠原蛋白iv(civ)、ha或habutiv的微量滴定板孔中的中性白細(xì)胞活化后，以釋放到培養(yǎng)基中的超氧陰離子(o2^-)的量來評(píng)價(jià)作為pmns代謝活化指示劑的ros的產(chǎn)生。使用分光光度法測(cè)定在板上溫育期間被細(xì)胞產(chǎn)生的超氧陰離子減少的細(xì)胞色素c的量。

對(duì)生物表面的粘附的評(píng)價(jià)

通過測(cè)定pmns的嗜苯胺藍(lán)顆粒中包含的標(biāo)記酶髓過氧化物酶(mpo)來評(píng)價(jià)代謝測(cè)定期間細(xì)胞對(duì)表面的粘附。使用menegazzi等人(anew，one-stepassayonwholecellsuspensionsforperoxidasesecretionbyhumanneutrophilsandeosinophils.menegazzir，zabucchig，knowlesa，cramerr，patriarcap.jleukocbiol.1992dec；52(6)：619-24)所述的方案。通過定量比色酶試驗(yàn)測(cè)定髓過氧化物酶活性，所述定量比色酶試驗(yàn)測(cè)定在h2o2的存在下通過mpo酶對(duì)3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)底物的氧化。

實(shí)施例1：透明質(zhì)酸鈉鹽丁酸酯的合成，ds＝0.3(but12103)

將100ml軟化水導(dǎo)入1升反應(yīng)器中，然后加入10.0gmw為280kda的透明質(zhì)酸鈉。將該混合物在25℃下恒溫并維持在恒定溫度下攪拌至完全溶解。

然后加入碳酸鈉(na2co3-1.6g)，然后在攪拌30分鐘后加入丁?；?咪唑交酯(2.6g)。將該溶液在25℃下保持?jǐn)嚢?小時(shí)，然后通過在丙酮中沉淀分離產(chǎn)物，隨后潷析。

通過在丙酮中連續(xù)洗滌來純化該溶液，并通過負(fù)壓過濾回收。

最后將產(chǎn)物懸浮在丙酮中，保持?jǐn)嚢柚辽?0分鐘，然后分離，通過過濾除去溶劑。

將沉淀物在室溫下干燥至少3h，然后在真空烘箱中在≤60℃的溫度下干燥至少16小時(shí)。

將10mg樣品溶于0.7ml重水(d2o)并轉(zhuǎn)入nmr試管。

將nmr光譜報(bào)道在圖1中；通過應(yīng)用僅保留歸屬于共價(jià)鍵合到聚合物上的化學(xué)基團(tuán)的信號(hào)的dosy序列獲得下部光譜(a)。

另外2個(gè)¹hnmr光譜分別在通過加入氘代氫氧化鈉(naod)水解丁酸酯之前(b)和之后(c)得到。通過積分¹hnmr光譜的信號(hào)，確定ds為0.30。

實(shí)施例2：分子量和重均分子量(mw)分布的測(cè)定

通過hp-sec-tda色譜法分析用于合成實(shí)施例1中所述的用280kda的mw驗(yàn)證的丁酸酯的透明質(zhì)酸鈉鹽樣品。實(shí)驗(yàn)分子量的分布得到了300kda的重均分子量(mw)。

通過hp-sec-tda色譜法分析如實(shí)施例1所述生產(chǎn)的透明質(zhì)酸鈉鹽丁酸酯樣品。實(shí)驗(yàn)分子量的分布得到360kda的重均分子量(mw)。

實(shí)施例3：透明質(zhì)酸鈉鹽丁酸酯的合成，ds＝0.3(but14014)

將1l軟化水傾入15l反應(yīng)器中，然后加入100.0gmw為290kda的透明質(zhì)酸鈉。將該混合物在25℃下恒溫并維持在恒定溫度下攪拌至完全溶解。

然后加入碳酸鈉(na2co3-15.9g)，然后在攪拌30分鐘后加入丁?；?咪唑交酯(25.9g)。將該溶液在25℃下保持?jǐn)嚢?小時(shí)；然后通過添加由鹽酸(hcl)和氯化鈉(nacl)組成的水溶液使反應(yīng)停止。

將溶液攪拌至少30分鐘，然后通過在異丙醇中沉淀回收產(chǎn)物。

當(dāng)沉淀完成時(shí)，將該溶液保持?jǐn)嚢柚辽?6小時(shí)；將該混合物轉(zhuǎn)移并通過過濾分離產(chǎn)物。

然后將產(chǎn)物通過在異丙醇中連續(xù)洗滌來純化，此后通過過濾回收產(chǎn)物。

最終，將產(chǎn)物懸浮在異丙醇中，保持?jǐn)嚢柚辽?0分鐘，然后分離，通過過濾除去溶劑。

將沉淀物在室溫下干燥至少3h，然后在真空烘箱中在≤60℃的溫度下干燥至少16小時(shí)。

將10mg樣品溶于0.7mld2o并轉(zhuǎn)入nmr試管。

將10mg樣品溶于0.7mlnaod并轉(zhuǎn)入nmr試管。

通過積分¹hnmr光譜的信號(hào)，確定ds為0.30。

實(shí)施例4：透明質(zhì)酸鈉鹽丁酸酯的合成，ds＝0.3(hbint05012014)

將2.5l軟化水導(dǎo)入15l反應(yīng)器中，然后加入250.0gmw為290kda的透明質(zhì)酸鈉。將該混合物在25℃下恒溫并維持在恒定溫度下攪拌至完全溶解。

然后加入碳酸鈉(na2co3-39.8g)，然后在攪拌30分鐘后加入丁?；?咪唑交酯(64.8g)。將該溶液在25℃下保持?jǐn)嚢?小時(shí)；然后通過添加由hcl和nacl組成的水溶液使反應(yīng)停止。

將溶液保持?jǐn)嚢柚辽?0分鐘，然后通過在丙酮中沉淀回收產(chǎn)物。

當(dāng)沉淀完成時(shí)，將該溶液保持?jǐn)嚢柚辽?0分鐘。然后通過潷析分離產(chǎn)物。

然后將產(chǎn)物通過在丙酮中連續(xù)洗滌來純化，此后通過過濾回收產(chǎn)物。

最終，將產(chǎn)物懸浮在丙酮中，保持?jǐn)嚢柚辽?0分鐘，然后分離，通過過濾除去溶劑。

將沉淀物在室溫下干燥至少16h，然后在真空烘箱中在≤60℃的溫度下干燥至少24小時(shí)。

將10mg樣品溶于0.7mld2o并轉(zhuǎn)入nmr試管。

將10mg樣品溶于0.7mlnaod并轉(zhuǎn)入nmr試管。

通過積分¹hnmr光譜的信號(hào)，確定ds為0.30。

實(shí)施例5：透明質(zhì)酸鈉鹽丁酸酯的合成，ds＝0.58(but14017)

將100ml軟化水導(dǎo)入1升反應(yīng)器中，然后加入10.0gmw為290kda的透明質(zhì)酸鈉。將該混合物在25℃下恒溫并維持在恒定溫度下攪拌至完全溶解。

然后加入碳酸鈉(na2co3-2.6g)，然后在攪拌30分鐘后加入丁?；?咪唑交酯(9.2g)。將該溶液在25℃下保持?jǐn)嚢?小時(shí)，然后通過添加由hcl和nacl組成的水溶液使反應(yīng)停止。

將溶液保持?jǐn)嚢柚辽?0分鐘，然后通過在異丙醇中沉淀回收產(chǎn)物。然后通過潷析分離產(chǎn)物。

然后將產(chǎn)物通過在異丙醇中連續(xù)洗滌來純化，此后通過過濾回收產(chǎn)物。

最終，將產(chǎn)物懸浮在異丙醇中，保持?jǐn)嚢柚辽?0分鐘，然后分離，通過過濾除去溶劑。

將沉淀物在室溫下干燥至少3h，然后在真空烘箱中在≤60℃的溫度下干燥至少24小時(shí)。

將10mg樣品溶于0.7mld2o并轉(zhuǎn)入nmr試管。

將10mg樣品溶于0.7mlnaod并轉(zhuǎn)入nmr試管。

通過積分¹hnmr光譜的信號(hào)，確定ds為0.58。

實(shí)施例6：透明質(zhì)酸鈉鹽丁酸酯的合成，ds＝0.85(but14019)

將100ml軟化水導(dǎo)入1升反應(yīng)器中，然后加入10.0gmw為290kda的透明質(zhì)酸鈉。將該混合物在25℃下恒溫并維持在恒定溫度下攪拌至完全溶解。

然后加入碳酸鈉(na2co3-5.3g)，然后在攪拌30分鐘后加入丁酰基-咪唑交酯(9.2g)。將該溶液在25℃下保持?jǐn)嚢?小時(shí)，然后通過添加由hcl和nacl組成的水溶液使反應(yīng)停止。

將溶液保持?jǐn)嚢柚辽?0分鐘，然后通過在異丙醇中沉淀回收產(chǎn)物。然后通過潷析分離產(chǎn)物。

然后將產(chǎn)物通過在異丙醇中連續(xù)洗滌來純化，此后通過過濾回收產(chǎn)物。

最終，將產(chǎn)物懸浮在異丙醇中，保持?jǐn)嚢柚辽?0分鐘，然后分離，通過過濾除去溶劑。

將沉淀物在室溫下干燥至少3h，然后在真空烘箱中在≤60℃的溫度下干燥至少24小時(shí)。

將10mg樣品溶于0.7mld2o并轉(zhuǎn)入nmr試管。

將10mg樣品溶于0.7mlnaod并轉(zhuǎn)入nmr試管。

通過積分¹hnmr光譜的信號(hào)，確定ds為0.85。

實(shí)施例7：透明質(zhì)酸鈉鹽丁酸酯的合成，ds＝1.30(hbint04042014-but14023)

將100ml軟化水導(dǎo)入1升反應(yīng)器中，然后加入10.0gmw為290kda的透明質(zhì)酸鈉。將該混合物在25℃下恒溫并維持在恒定溫度下攪拌至完全溶解。

然后加入碳酸鈉(na2co3-13.2g)，然后在攪拌30分鐘后加入丁?；?咪唑交酯(23.1g)。將該溶液在25℃下保持?jǐn)嚢?小時(shí)，然后通過添加hcl水溶液使反應(yīng)停止。

將溶液保持?jǐn)嚢柚辽?0分鐘，然后通過在異丙醇中沉淀回收產(chǎn)物。然后通過潷析分離產(chǎn)物。

然后將產(chǎn)物通過在異丙醇中連續(xù)洗滌來純化，此后通過過濾回收產(chǎn)物。

最終，將產(chǎn)物懸浮在異丙醇中，保持?jǐn)嚢柚辽?0分鐘，然后分離，通過過濾除去溶劑。

將沉淀物在室溫在空氣流中干燥至少3h，然后在真空烘箱中在≤60℃的溫度下干燥至少24小時(shí)。

將10mg樣品溶于0.7mld2o并轉(zhuǎn)入nmr試管。

將10mg樣品溶于0.7mlnaod并轉(zhuǎn)入nmr試管。

通過積分¹hnmr光譜的信號(hào)，確定ds為1.30。

實(shí)施例8：高分子量透明質(zhì)酸鈉鹽丁酸酯的合成，ds＝0.24(hbint01042014-but14025)

將1l軟化水傾入5l反應(yīng)器中，然后加入50.0gmw為1270kda的透明質(zhì)酸鈉。將該混合物在25℃下恒溫并維持在恒定溫度下攪拌至完全溶解。

然后加入碳酸鈉(na2co3-10.6g)，然后在攪拌90分鐘后加入丁?；?咪唑交酯(25.9g)。將該溶液在25℃下保持?jǐn)嚢?小時(shí)，然后通過添加由hcl和nacl組成的360ml水溶液使反應(yīng)停止。

將該溶液保持?jǐn)嚢柚辽?0分鐘，然后通過在丙酮中沉淀回收產(chǎn)物。當(dāng)沉淀完成時(shí)，將該溶液保持?jǐn)嚢柚辽?6小時(shí)。然后通過潷析分離產(chǎn)物。

然后將產(chǎn)物通過在丙酮中連續(xù)洗滌來純化，此后通過過濾回收產(chǎn)物。

最終，將產(chǎn)物懸浮在丙酮中，保持?jǐn)嚢柚辽?0分鐘，然后分離，通過過濾除去溶劑。

將沉淀物在室溫下干燥至少16h，然后在真空烘箱中在≤60℃的溫度下干燥至少24小時(shí)。

將3mg固體溶于0.7mld2o并轉(zhuǎn)入nmr試管。

10mg固體溶于0.7mlnaod并轉(zhuǎn)入nmr試管。

通過積分¹hnmr光譜的信號(hào)，確定ds為0.24。

實(shí)施例9：高分子量透明質(zhì)酸鈉鹽丁酸酯的合成，ds＝0.51(hbint03042014-but14032)

將0.72l軟化水導(dǎo)入5l反應(yīng)器中，然后加入30.0gmw為1270kda的透明質(zhì)酸鈉。將該混合物在25℃下恒溫并維持在恒定溫度下攪拌至完全溶解。

然后加入碳酸鈉(na2co3-23.8g)，然后在攪拌60分鐘后加入丁酰基-咪唑交酯(60.9g)。將該溶液在25℃下保持?jǐn)嚢?小時(shí)，然后通過添加hcl水溶液使反應(yīng)停止。

將該溶液保持?jǐn)嚢柚辽?0分鐘，然后通過在丙酮中沉淀回收產(chǎn)物。當(dāng)沉淀完成時(shí)，將該溶液保持?jǐn)嚢柚辽?6小時(shí)。然后通過潷析分離產(chǎn)物。

然后將產(chǎn)物通過在丙酮中連續(xù)洗滌來純化，此后通過過濾回收產(chǎn)物。

最終，將產(chǎn)物懸浮在丙酮中，保持?jǐn)嚢柚辽?0分鐘，然后分離，通過過濾除去溶劑。

將沉淀物在室溫下干燥至少30h，然后在真空烘箱中在≤60℃的溫度下干燥至少24小時(shí)。

將3mg樣品溶于0.7mld2o并轉(zhuǎn)入nmr試管。

將10mg樣品溶于0.7mlnaod并轉(zhuǎn)入nmr試管。

通過積分¹hnmr光譜的信號(hào)，確定ds為0.51。

實(shí)施例10：高分子量透明質(zhì)酸鈉鹽丁酸酯的合成，ds＝0.97(hbint02042014-but14031)

將0.85l軟化水導(dǎo)入5升反應(yīng)器中，然后加入30.0gmw為1270kda的透明質(zhì)酸鈉。將該混合物在25℃下恒溫并維持在恒定溫度下攪拌至完全溶解。

然后加入碳酸鈉(na2co3-47.6g)，然后在攪拌60分鐘后加入丁?；?咪唑交酯(138.3g)。將該溶液在25℃下保持?jǐn)嚢?小時(shí)，然后通過添加hcl水溶液使反應(yīng)停止。

將該溶液保持?jǐn)嚢柚辽?0分鐘，然后通過在丙酮中沉淀回收產(chǎn)物。當(dāng)沉淀完成時(shí)，將該溶液保持?jǐn)嚢柚辽?6小時(shí)，然后通過過濾分離產(chǎn)物。

然后將產(chǎn)物通過在丙酮中連續(xù)洗滌來純化，此后通過過濾回收產(chǎn)物。

最終，將產(chǎn)物懸浮在丙酮中，保持?jǐn)嚢柚辽?0分鐘，然后分離，通過過濾除去溶劑。

將沉淀物在室溫下干燥至少16h，然后在真空烘箱中在≤60℃的溫度下干燥至少24小時(shí)。

將3mg樣品溶于0.7mld2o并轉(zhuǎn)入nmr試管。

將10mg樣品溶于0.7mlnaod并轉(zhuǎn)入nmr試管。

通過積分¹hnmr光譜的信號(hào)，確定ds為0.97。

實(shí)施例11：低分子量透明質(zhì)酸鈉鹽丁酸酯的合成，ds＝0.46(but14037)

將35ml軟化水導(dǎo)入0.51燒瓶中，然后加入5.0gmw為45kda的透明質(zhì)酸鈉。將該混合物在25℃下恒溫并維持在恒定溫度下攪拌至完全溶解。

然后加入碳酸鈉(na2co3-0.8g)，然后在攪拌30分鐘后加入丁?；?咪唑交酯(1.3g)。將該溶液在25℃下保持?jǐn)嚢?小時(shí)，然后通過添加hcl和nacl的水溶液使反應(yīng)停止。

將該溶液保持?jǐn)嚢柚辽?0分鐘，然后通過在異丙醇中沉淀回收產(chǎn)物。當(dāng)沉淀完成時(shí)，將該溶液保持?jǐn)嚢柚辽?6小時(shí)；將該混合物轉(zhuǎn)移并且通過過濾分離產(chǎn)物。

然后將產(chǎn)物通過在異丙醇中連續(xù)洗滌來純化，此后通過過濾回收產(chǎn)物。

最終，將產(chǎn)物懸浮在異丙醇中，保持?jǐn)嚢柚辽?0分鐘，然后分離，通過過濾除去溶劑。

將沉淀物在室溫下干燥至少16h，然后在真空烘箱中在≤60℃的溫度下干燥至少16小時(shí)。

將10mg樣品溶于0.7mld2o并轉(zhuǎn)入nmr試管。

將10mg樣品溶于0.7mlnaod并轉(zhuǎn)入nmr試管。

通過積分¹hnmr光譜的信號(hào)，確定ds為0.46。

實(shí)施例12：低分子量透明質(zhì)酸鈉鹽丁酸酯的合成，ds＝1.68(but14039)

將12.5ml軟化水導(dǎo)入0.25l燒瓶中，然后加入5.0gmw為45kda的透明質(zhì)酸鈉。將該混合物在25℃下恒溫并維持在恒定溫度下攪拌至完全溶解。

然后加入碳酸鈉(na2co3-6.6g)，然后在攪拌30分鐘后加入丁酰基-咪唑交酯(11.9g)。將該溶液在25℃下保持?jǐn)嚢?小時(shí)，然后通過添加hcl的水溶液使反應(yīng)停止。

將該溶液保持?jǐn)嚢柚辽?0分鐘，然后通過在異丙醇中沉淀回收產(chǎn)物。當(dāng)沉淀完成時(shí)，將該溶液保持?jǐn)嚢柚辽?6小時(shí)。然后通過潷析分離產(chǎn)物。

然后將產(chǎn)物通過在異丙醇中連續(xù)洗滌來純化，此后通過過濾回收產(chǎn)物。

將沉淀物在室溫下干燥至少16h，然后在真空烘箱中在≤60℃的溫度下干燥至少16小時(shí)。

將10mg樣品溶于0.7mld2o并轉(zhuǎn)入nmr試管。

將10mg樣品溶于0.7mlnaod并轉(zhuǎn)入nmr試管。

通過積分¹hnmr光譜的信號(hào)，確定ds為1.68。

實(shí)施例13：低分子量透明質(zhì)酸鈉鹽丁酸酯的合成，ds＝1.90(but14042)

將25.0ml軟化水導(dǎo)入0.5l燒瓶中，然后加入10.0gmw為45kda的透明質(zhì)酸鈉。將該混合物在25℃下恒溫并維持在恒定溫度下攪拌至完全溶解。

然后加入碳酸鈉(na2co3-13.2g)，然后在攪拌30分鐘后加入丁?；?咪唑交酯(68.2g)。將該溶液在25℃下保持?jǐn)嚢?小時(shí)，然后通過添加hcl的水溶液使反應(yīng)停止。

將該溶液保持?jǐn)嚢柚辽?0分鐘，然后通過在異丙醇中沉淀回收產(chǎn)物。當(dāng)沉淀完成時(shí)，將該溶液保持?jǐn)嚢柚辽?6小時(shí)。然后通過潷析分離產(chǎn)物。

然后將產(chǎn)物通過在異丙醇中連續(xù)洗滌來純化，此后通過過濾回收產(chǎn)物。

將沉淀物在室溫下干燥至少16h，然后在真空烘箱中在≤60℃的溫度下干燥至少16小時(shí)。

將10mg樣品溶于0.7mld2o并轉(zhuǎn)入nmr試管。

將10mg樣品溶于0.7mlnaod并轉(zhuǎn)入nmr試管。

通過積分¹hnmr光譜的信號(hào)，確定ds為1.90。

實(shí)施例14：低分子量透明質(zhì)酸鈉鹽丁酸酯的合成，ds＝0.06(but14043)

將50.0ml軟化水導(dǎo)入0.5l燒瓶中，然后加入10.0gmw為45kda的透明質(zhì)酸鈉。將該混合物在25℃下恒溫并維持在恒定溫度下攪拌至完全溶解。

然后加入碳酸鈉(na2co3-0.2g)，然后在攪拌30分鐘后加入丁?；?咪唑交酯(0.3g)。將該溶液在25℃下保持?jǐn)嚢?小時(shí)，然后通過添加hcl的水溶液使反應(yīng)停止。

將該溶液保持?jǐn)嚢柚辽?0分鐘，然后通過在異丙醇中沉淀回收產(chǎn)物。當(dāng)沉淀完成時(shí)，通過負(fù)壓過濾分離產(chǎn)物；然后將產(chǎn)物通過在異丙醇中連續(xù)洗滌來純化，此后通過過濾回收產(chǎn)物。

將沉淀物在室溫下干燥至少16h，然后在真空烘箱中在≤60℃的溫度下干燥至少7小時(shí)。

將10mg樣品溶于0.7mld2o并轉(zhuǎn)入nmr試管。

將10mg樣品溶于0.7mlnaod并轉(zhuǎn)入nmr試管。

通過積分¹hnmr光譜的信號(hào)，確定ds為0.06。

實(shí)施例15：低分子量透明質(zhì)酸鈉鹽丁酸酯的合成，ds＝0.02(but14044)

將50.0ml軟化水導(dǎo)入0.5l燒瓶中，然后加入10.0gmw為45kda的透明質(zhì)酸鈉。將該混合物在25℃下恒溫并維持在恒定溫度下攪拌至完全溶解。

然后加入碳酸鈉(na2co3-0.1g)，然后在攪拌30分鐘后加入丁?；?咪唑交酯(0.1g)。將該溶液在25℃下保持?jǐn)嚢?小時(shí)，然后通過添加hcl和nacl的水溶液使反應(yīng)停止。

將該溶液保持?jǐn)嚢柚辽?0分鐘，然后通過在異丙醇中沉淀回收產(chǎn)物。當(dāng)沉淀完成時(shí)，將該溶液保持?jǐn)嚢柚辽?6小時(shí)；然后將該混合物轉(zhuǎn)移，并且通過過濾分離產(chǎn)物。

然后將產(chǎn)物通過在異丙醇中連續(xù)洗滌來純化，此后通過過濾回收產(chǎn)物。

將沉淀物在室溫下干燥至少16h，然后在真空烘箱中在≤60℃的溫度下干燥至少16小時(shí)。

將10mg樣品溶于0.7mld2o并轉(zhuǎn)入nmr試管。

將10mg樣品溶于0.7mlnaod并轉(zhuǎn)入nmr試管。

通過積分¹hnmr光譜的信號(hào)，確定ds為0.02。

實(shí)施例16：被tnf活化的pmns的超氧陰離子的產(chǎn)生。

在用如下包被的孔中用促炎細(xì)胞因子tnf刺激45min的pmns的超氧陰離子的產(chǎn)生：fbg(纖維蛋白原；允許pmn粘附的表面)；civ(iv型膠原蛋白-非允許表面)；ha：透明質(zhì)酸；habut：透明質(zhì)酸鈉丁酸酯ds＝0.3實(shí)施例4。

將被各種底物包被的孔中填充0.18mm細(xì)胞色素c溶液和0.15ng/mltnf在hepes緩沖液中的溶液。將由此制備的模塊在加濕的溫育箱中在37℃下加熱10min；向每個(gè)孔中加入在hepes緩沖液中1.5x10⁶pmn/ml的細(xì)胞懸浮液。以15分鐘的間隔將板從溫育箱中取出，并在微孔板讀數(shù)器中在550nm和540nm的波長(zhǎng)處進(jìn)行分光光度分析，其分別相當(dāng)于還原的細(xì)胞色素c的吸收峰和還原和氧化的細(xì)胞色素c的吸收光譜的等吸收點(diǎn)。在兩個(gè)波長(zhǎng)處記錄的吸光度值之差與減少的細(xì)胞色素c的量成正比。由10⁶個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的o2^-的量計(jì)算如下：

nmoleso2^-/10⁶pmn＝odx10⁶/0.0037xn

其中n為加入到每個(gè)孔中的細(xì)胞數(shù)量。

圖2中報(bào)告的柱狀圖顯示，與在ha表面溫育的那些相比，響應(yīng)于在包被有habut(具有取代度為0.3)的表面上溫育的pmns的tnf的超氧化物陰離子的產(chǎn)生顯著減少(p＜0.001，通過斯氏“t”檢驗(yàn)計(jì)算，n＝4)。

實(shí)施例17：pmn粘附生物表面的試驗(yàn)。

pmn粘附到包被有fbg(表面允許pmn粘附)；civ(非許可表面)；ha：透明質(zhì)酸；habut：透明質(zhì)酸鈉丁酸酯ds＝0.3實(shí)施例4的表面。靜止：pmn未被tnf活化。tnf：被tnf活化的pmn；pma：被佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯活化的pmn。

在取得用于測(cè)量o2^-生產(chǎn)的分光光度讀數(shù)后，將微孔板的孔用pbs填充，并以200rpm離心5分鐘以除去不附著于表面的細(xì)胞。通過測(cè)定在h2o2存在下mpo酶對(duì)3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)底物的氧化來測(cè)定髓過氧化物酶活性。向每個(gè)孔中加入包含tmb、十六烷基三甲基銨(ctab)和3-氨基-1，2，4-三唑(amt)的乙酸鹽緩沖液，并將板攪拌5min以促進(jìn)細(xì)胞裂解并促進(jìn)mpo從顆粒中釋放。用atm抑制來自可能污染pmn制備物的嗜酸細(xì)胞的嗜酸細(xì)胞過氧化物酶活性。在加入h2o2后2分鐘，用h2so4使反應(yīng)停止，并且在405nm的波長(zhǎng)處測(cè)定每個(gè)孔的吸光度。參考在每次實(shí)驗(yàn)中基于已知量的細(xì)胞計(jì)算的過氧化物酶活性值構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算粘附細(xì)胞的百分比。

圖3中報(bào)告的柱狀圖顯示，與粘附至包被有ha的pmns數(shù)量相比，粘附在包被有habut(具有取代度為0.3)的表面上的活化和非活化pmns的數(shù)量顯著減少(p＝0.001，用斯氏“t”檢驗(yàn)計(jì)算，n＝4)。

實(shí)施例18：丁酸酯的取代度和透明質(zhì)酸的分子量對(duì)活化和未活化pmfs的粘附的影響

用tnf刺激的pmns與包被有ha和habut的表面的粘附。habut：透明質(zhì)酸鈉丁酸酯ds＝0.3實(shí)施例4；habut樣品編號(hào)1：透明質(zhì)酸鈉丁酸酯ds＝1.3實(shí)施例7；habut樣品編號(hào)2：hmw透明質(zhì)酸鈉丁酸酯ds＝0.24實(shí)施例8；habut樣品編號(hào)3hmw透明質(zhì)酸鈉丁酸酯ds＝0.97實(shí)施例10。靜止：陰性對(duì)照。pma：陽性對(duì)照。

黑色柱：未被tnf活化的pmns。白色柱：被tnf活化的pmns。

如實(shí)施例18所述評(píng)價(jià)pmfs對(duì)表面的粘附。

圖4中報(bào)道的直方圖表明，當(dāng)丁酸酯的取代度增加時(shí)，habut表面逐漸變得較不易于與pmns發(fā)生粘附相互作用，而其分子量似乎不相關(guān)。