相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求2015年1月23日提交的美國臨時申請?zhí)?2/107,165的優(yōu)先權(quán)，所述申請的內(nèi)容以引用的方式整體并入本文。

本發(fā)明涉及一種針對豬流行性腹瀉病毒(pedv)的疫苗和一種施用所述疫苗的方法。

發(fā)明背景

豬流行性腹瀉病毒(pedv)(一種α冠狀病毒)是高度傳染性的，從而導(dǎo)致豬急性腹瀉和脫水。雖然成年豬通常從感染恢復(fù)，但是哺乳仔豬的死亡率可達(dá)100％。

pedv已經(jīng)成為幾個亞洲國家的重要關(guān)注，并且于2013年在美國首次鑒別。由僅美國33個州到2015年1月多于9000例確診病例所致的嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失就顯示對于安全且有效的疫苗的需要。

可商購的傳統(tǒng)滅活疫苗具有許多缺點，并且當(dāng)前證據(jù)表明，活pedv疫苗可發(fā)展成感染性的。此外，現(xiàn)在有證據(jù)表明全生物體疫苗可刺激對宿主蛋白質(zhì)的交叉反應(yīng)性免疫應(yīng)答。

因此，本領(lǐng)域中需要開發(fā)針對pedv的有效疫苗。本發(fā)明滿足了這一未滿足的需要。

發(fā)明概述

本發(fā)明的方面包括一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含核酸分子，其中所述核酸分子包含在選自包括seqidno:1和seqidno:4的組的核酸序列的全長上具有至少約90％同一性的核酸序列。

一方面，所述核酸分子包含選自包括seqidno:1和seqidno:4的組的核酸序列。

一方面，所述核酸序列連接至編碼前導(dǎo)序列的核苷酸。

一方面，所述前導(dǎo)序列由seqidno:6的核酸序列編碼。

一方面，所述前導(dǎo)序列是由seqidno:8的核酸序列編碼的ige前導(dǎo)序列。

一方面，權(quán)利要求的免疫原性組合物還包含肽，所述肽包含在選自包括seqidno:2和seqidno:5的組的氨基酸序列的全長上具有至少約90％同一性的氨基酸序列。

一方面，所述肽包含具有選自包括seqidno:2和seqidno:5的組的氨基酸序列的氨基酸序列。

一方面，所述氨基酸序列連接至前導(dǎo)序列。

一方面，所述前導(dǎo)序列包含seqidno:7的氨基酸序列。

一方面，所述前導(dǎo)序列是ige前導(dǎo)序列并且包含seqidno:9的氨基酸序列。

一方面，所述核酸分子包含表達(dá)載體。

一方面，所述核酸分子并入病毒顆粒中。

一方面，所述免疫原性組合物還包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。

一方面，所述免疫原性組合物還包含佐劑。

本發(fā)明的方面包括一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含核酸分子，其中所述核酸分子編碼包含氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列在選自包括seqidno:2和seqidno:5的組的氨基酸序列的全長上具有至少約90％同一性。

一方面，所述核酸分子編碼包含選自包括seqidno:2和seqidno:5的組的氨基酸序列的肽。

一方面，所述核酸序列連接至編碼前導(dǎo)序列的核苷酸。

一方面，所述前導(dǎo)序列由seqidno:6的核酸序列編碼。

一方面，所述前導(dǎo)序列是由seqidno:8的核酸序列編碼的ige前導(dǎo)序列。

本發(fā)明的方面包括一種包含肽的免疫原性組合物，所述肽包含在選自包括seqidno:2和seqidno:5的組的氨基酸序列的全長上具有至少約90％同一性的氨基酸序列。一方面，所述肽包含選自包括seqidno:2和seqidno:5的組的氨基酸序列。一方面，所述氨基酸序列連接至前導(dǎo)序列。一方面，所述前導(dǎo)序列包含seqidno:7的氨基酸序列。一方面，所述前導(dǎo)序列是ige前導(dǎo)序列。一方面，ige前導(dǎo)序列包含seqidno:9的氨基酸序列。

本發(fā)明的方面包括一種核酸分子，所述核酸分子包含在選自包括seqidno:1和seqidno:4的組的核酸序列的全長上具有至少約90％同一性的核酸序列。一方面，所述核酸序列選自包括seqidno:1和seqidno:4的組。一方面，所述核酸序列連接至前導(dǎo)序列。一方面，所述前導(dǎo)序列包含seqidno:6的核酸序列。一方面，所述前導(dǎo)序列是ige前導(dǎo)序列。一方面，ige前導(dǎo)序列包含seqidno:8的核酸序列。

本發(fā)明的方面包括一種肽，所述肽包含在選自包括seqidno:2和seqidno:5的組的氨基酸序列的全長上具有至少約90％同一性的氨基酸序列。一方面，所述肽包含選自包括seqidno:2和seqidno:5的組的氨基酸序列。一方面，所述氨基酸序列連接至前導(dǎo)序列。一方面，所述前導(dǎo)序列包含seqidno:7的氨基酸序列。一方面，所述前導(dǎo)序列是ige前導(dǎo)序列。一方面，ige前導(dǎo)序列包含seqidno:9的氨基酸序列。

本發(fā)明的方面包括一種在有需要的豬中誘導(dǎo)針對豬流行性腹瀉病毒(pedv)的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向所述豬施用本發(fā)明的免疫原性組合物。一方面，施用包括電穿孔和注射中的至少一種。

本發(fā)明的方面包括一種保護(hù)有需要的豬免于感染豬流行性腹瀉病毒(pedv)的方法，所述方法包括向所述豬施用本發(fā)明的免疫原性組合物。一方面，施用包括電穿孔和注射中的至少一種。

本發(fā)明的方面包括一種針對豬流行性腹瀉病毒(pedv)治療有需要的豬的方法，所述方法包括向所述豬施用本發(fā)明的免疫原性組合物，其中所述豬由此對一種或多種豬流行性腹瀉病毒(pedv)毒株具有抗性。一方面，施用包括電穿孔和注射中的至少一種。

附圖簡述

在結(jié)合附圖閱讀時，將更好地理解本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的以下詳細(xì)描述。為了說明本發(fā)明，附圖中示出了目前優(yōu)選的實施方案。然而，應(yīng)了解，本發(fā)明不限于圖中所示實施方案的精確布置以及儀器。

圖1(包括圖1a至圖1c)描繪ppedv-sdna疫苗構(gòu)建體的示意性圖示(圖1a)以及消化的和未消化的構(gòu)建體的凝膠電泳(圖1c)。圖1b描繪用于產(chǎn)生共有序列(其用箭頭標(biāo)記)的pedvs蛋白的所有可用全長序列的多樣性。

圖2是說明用各種劑量的ppedv-s或pvax1(對照)免疫的小鼠的免疫計劃的示意圖。

圖3描繪證明用ppedv-s免疫誘導(dǎo)對pedv刺突蛋白具有特異性的穩(wěn)健抗體應(yīng)答的實驗的結(jié)果。從免疫的小鼠分離血清，并且通過肽elisa評估共有pedv刺突序列的特異性線性表位的結(jié)合igg抗體應(yīng)答。圖3描繪對每個肽池具有特異性的總抗體應(yīng)答。誤差線是sem。

圖4是描繪針對與池4結(jié)合的抗體計算的終點滴度的圖。示出來自每個免疫組中的5只小鼠的平均數(shù)據(jù)。誤差線是sem。

圖5是描繪用于確定顯性線性結(jié)合抗體表位的實驗的結(jié)果的圖。從免疫的小鼠分離血清，并且通過肽elisa評估對線性表位具有特異性的結(jié)合igg水平。示出來自用25μgppedv-s免疫的5只小鼠的平均數(shù)據(jù)。誤差線是sem。

圖6是描繪證明用ppedv-s免疫誘導(dǎo)對pedv刺突蛋白具有特異性的穩(wěn)健ifnγt細(xì)胞應(yīng)答的實驗的結(jié)果的圖。從免疫的小鼠分離脾細(xì)胞，并且通過elispot測定評估t細(xì)胞應(yīng)答。示出來自每個免疫組中的5只小鼠的平均數(shù)據(jù)。誤差線是sem。

圖7是描繪鑒別顯性t細(xì)胞表位的實驗的結(jié)果的圖。從免疫的小鼠分離脾細(xì)胞，并且通過elispot測定評估t細(xì)胞應(yīng)答。示出來自用30ugppedv-s免疫的5只小鼠的平均數(shù)據(jù)。誤差線是sem。

圖8是描述與本文提及的每個seqidno相關(guān)的序列的描述的表。

詳述

本發(fā)明的方面包括一種包含豬流行性腹瀉病毒(pedv)抗原的疫苗。本發(fā)明的其他方面是使用所公開的疫苗用于這種病原性病毒的治療和/或預(yù)防。

本發(fā)明的pedv抗原可以是pedv共有刺突抗原。pedv共有刺突抗原可來源于來自pedv毒株的刺突抗原序列，且因此，本發(fā)明的pevd共有刺突抗原是獨特的。本發(fā)明的疫苗由于pevd共有刺突抗原的獨特序列而廣泛適用于pevd的多個毒株。這些獨特序列允許疫苗對pedv的多個毒株具有全面保護(hù)性，包括pedv的遺傳多樣變體。

所述疫苗可用于保護(hù)免于感染pedv的許多毒株并治療這些毒株。所述疫苗可引發(fā)靶向pedv刺突抗原的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。所述疫苗可引發(fā)與pedv刺突抗原反應(yīng)的中和抗體和免疫球蛋白g(igg)抗體。所述疫苗還可引發(fā)對pedv刺突抗原有反應(yīng)的cd8⁺和cd4⁺t細(xì)胞應(yīng)答并產(chǎn)生干擾素-γ(ifn-γ)、腫瘤壞死因子α(tnf-α)和白細(xì)胞介素-2(il-2)。

定義

除非另外定義，否則本文所用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。當(dāng)發(fā)生沖突時，以本文件(包括定義)為準(zhǔn)。雖然在本發(fā)明的實踐或測試中可使用與本文所描述的那些方法和材料類似或等效的方法和材料，但以下描述了優(yōu)選的方法和材料。本文提及的所有出版物、專利申請、專利以及其他參考文獻(xiàn)以引用的方式整體并入。本文公開的材料、方法和實施例僅是示例性的，并且不意圖為限制性的。

如本文所用，術(shù)語“包含(comprise)”、“包括(include)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“可以(can)”、“含有(contain)”以及其變化形式意圖是不排除另外行為或結(jié)構(gòu)的可能性的開放式連接詞、術(shù)語、或詞語。除非上下文另外清楚地說明，否則單數(shù)形式“一個/種(a)”、“一個/種(an)”以及“所述(the)”包括復(fù)數(shù)引用。本公開還涵蓋“包括本文所呈現(xiàn)的實施方案或要素”、“由本文所呈現(xiàn)的實施方案或要素組成”以及“主要由本文所呈現(xiàn)的實施方案或要素組成”的其他實施方案，無論是否明確地提出。

如本文所用的“佐劑”是指添加至本文所描述的疫苗中以增強(qiáng)抗原的免疫原性的任何分子。

如本文所用的“抗體”是指類型igg、igm、iga、igd或ige的抗體，或片段、其片段或衍生物，包括fab、f(ab')2、fd以及單鏈抗體、雙鏈抗體、雙特異性抗體、雙功能抗體及其衍生物。所述抗體可以是從哺乳動物的血清樣品中分離的抗體、多克隆抗體、親和純化抗體或其混合物，所述抗體對所需表位或源自其的序列表現(xiàn)出足夠的結(jié)合特異性。

如本文所用的“編碼序列”或“編碼核酸”是指包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸(rna或dna分子)。編碼序列還可包含可操作地連接至調(diào)控元件的起始信號和終止信號，所述調(diào)控元件包括能夠在施用核酸的個體或哺乳動物的細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)的啟動子和多腺苷酸化信號。

如本文所用的“補(bǔ)體”或“互補(bǔ)的”是指核酸分子的核苷酸或核苷酸類似物之間的沃森-克里克(watson-crick)(例如，a-t/u和c-g)或hoogsteen堿基配對。

如本文所用的“共有”或“共有序列”可指基于對特定抗原的多個亞型的比對的分析而構(gòu)建的合成核酸序列或相應(yīng)多肽序列。序列可用于誘導(dǎo)針對特定抗原的多種亞型、血清型或菌株的廣泛免疫性。合成抗原(如融合蛋白)可被操縱以產(chǎn)生共有序列(或共有抗原)。

如本文可互換使用的“電穿孔”、“電-透化作用”或“電動增強(qiáng)”(“ep”)是指使用跨膜電場脈沖來誘導(dǎo)生物膜中的微觀途徑(孔隙)；所述微觀途徑的存在允許生物分子如質(zhì)粒、寡核苷酸、sirna、藥物、離子以及水從細(xì)胞膜的一側(cè)穿至另一側(cè)。

如本文所用的“片段”是指編碼能夠在哺乳動物中引發(fā)免疫應(yīng)答的多肽的核酸序列或其部分。所述片段可以是選自編碼下文所述的蛋白質(zhì)片段的各種核苷酸序列中的至少一種的dna片段。

關(guān)于多肽序列的“片段”或“免疫原性片段”是指與全長野生型毒株pedv抗原交叉反應(yīng)的能夠在哺乳動物中引發(fā)免疫應(yīng)答的多肽。共有蛋白的片段可包含共有蛋白的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些實施方案中，共有蛋白的片段可包含共有蛋白的至少20個氨基酸或更多、至少30個氨基酸或更多、至少40個氨基酸或更多、至少50個氨基酸或更多、至少60個氨基酸或更多、至少70個氨基酸或更多、至少80個氨基酸或更多、至少90個氨基酸或更多、至少100個氨基酸或更多、至少110個氨基酸或更多、至少120個氨基酸或更多、至少130個氨基酸或更多、至少140個氨基酸或更多、至少150個氨基酸或更多、至少160個氨基酸或更多、至少170個氨基酸或更多、至少180個氨基酸或更多、至少190個氨基酸或更多、至少200個氨基酸或更多、至少210個氨基酸或更多、至少220個氨基酸或更多、至少230個氨基酸或更多或至少240個氨基酸或更多。

如本文所用，術(shù)語“遺傳構(gòu)建體”是指包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的dna或rna分子。所述編碼序列包含可操作地連接至調(diào)控元件的起始信號和終止信號，所述調(diào)控元件包括能夠在施用核酸分子的個體的細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)的啟動子和多腺苷酸化信號。如本文所用，術(shù)語"可表達(dá)的形式"是指含有可操作地連接至編碼蛋白質(zhì)的編碼序列的必需調(diào)控元件的基因構(gòu)建體，以使得當(dāng)存在于個體的細(xì)胞中時，編碼序列將被表達(dá)。

如本文在兩種或更多種核酸或多肽序列的背景下所用的術(shù)語“相同的”或“同一性”是指序列具有指定百分比的在指定區(qū)上相同的殘基?？赏ㄟ^以下來計算所述百分比：最優(yōu)比對兩個序列，在指定區(qū)域上比較兩個序列，確定在兩個序列中出現(xiàn)相同殘基的位置的數(shù)目以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)目，用匹配位置的數(shù)目除以指定區(qū)中的位置的總數(shù)目，并且將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性的百分比。在兩個序列具有不同的長度或者比對產(chǎn)生一個或多個交錯的末端并且比較的指定區(qū)域僅包含單個序列的情況下，單個序列的殘基被包括在計算的分母中而不是分子中。當(dāng)比較dna和rna時，胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)可被認(rèn)為是等同的。同一性可手動地或者通過使用計算機(jī)序列算法如blast或者blast2.0來執(zhí)行。

如本文所用的“免疫應(yīng)答”是指響應(yīng)于抗原的引入而產(chǎn)生的宿主的免疫系統(tǒng)(例如，哺乳動物的免疫系統(tǒng))的活化。免疫應(yīng)答可以是細(xì)胞應(yīng)答或體液應(yīng)答或兩者的形式。

如本文所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”是指共價連接在一起的至少兩個核苷酸。單鏈的描述還定義了互補(bǔ)鏈的序列。因此，核酸還涵蓋了所描述的單鏈的互補(bǔ)鏈。核酸的許多變體可用于與給定核酸相同的目的。因此，核酸還涵蓋了基本上相同的核酸及其補(bǔ)體。單鏈提供可在嚴(yán)格雜交條件下與靶序列雜交的探針。因此，核酸還涵蓋了在嚴(yán)格雜交條件下雜交的探針。

核酸可以是單鏈的或者雙鏈的，或可含有雙鏈序列和單鏈序列兩者的部分。核酸可以是dna、基因組和cdna兩者、rna或雜合體，其中所述核酸可含有脫氧核糖核苷酸與核糖核苷酸的組合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、肌苷、黃嘌呤次黃嘌呤、異胞嘧啶以及異鳥嘌呤的堿基的組合。核酸可通過化學(xué)合成方法或者通過重組方法來獲得。

如本文所用的“可操作地連接”是指基因的表達(dá)受其在空間上所連接的啟動子的控制。啟動子可位于受其控制的基因的5'(上游)或3'(下游)。啟動子與基因之間的距離可與所述啟動子與其所控制的基因(即啟動子的來源基因)之間的距離大約相同。如本領(lǐng)域所已知，這個距離的變化可在沒有失去啟動子功能的情況下進(jìn)行調(diào)整。

如本文所用的“肽”、“蛋白質(zhì)”或“多肽”可指氨基酸的連接序列，并且可以是天然的、合成的、或天然與合成的修飾或組合。

如本文所用的“啟動子”是指合成的或天然來源的分子，所述分子能夠賦予、活化或增強(qiáng)細(xì)胞中的核酸的表達(dá)。啟動子可包含一個或多個特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列以進(jìn)一步增強(qiáng)表達(dá)和/或改變其空間表達(dá)和/或時間表達(dá)。啟動子還可包含遠(yuǎn)端增強(qiáng)子或阻遏子元件，它們可位于與轉(zhuǎn)錄起始位點相距多達(dá)數(shù)千個堿基對處。啟動子可源自包括病毒、細(xì)菌、真菌、植物、昆蟲以及動物的來源。啟動子可調(diào)控基因組分相對于其中發(fā)生表達(dá)的細(xì)胞、組織或器官或相對于發(fā)生表達(dá)所處的發(fā)育階段或響應(yīng)于外部刺激(如生理應(yīng)激、病原體、金屬離子或誘導(dǎo)劑)而組成型地或差異性地表達(dá)。啟動子的代表性實例包括噬菌體t7啟動子、噬菌體t3啟動子、sp6啟動子、lac操縱子-啟動子、tac啟動子、sv40后期啟動子、sv40早期啟動子、rsv-ltr啟動子、cmvie啟動子、sv40早期啟動子或者sv40后期啟動子以及cmvie啟動子。

“信號肽”和“前導(dǎo)序列”在本文可互換使用并且是指可被連接在本文所述的pedv蛋白的氨基末端的氨基酸序列。信號肽/前導(dǎo)序列通常指導(dǎo)蛋白質(zhì)的定位。本文所用的信號肽/前導(dǎo)序列優(yōu)選地促進(jìn)蛋白質(zhì)從產(chǎn)生其的細(xì)胞中分泌。信號肽/前導(dǎo)序列常常從蛋白質(zhì)的剩余部分裂解，所述蛋白質(zhì)在從細(xì)胞分泌后經(jīng)常被稱為成熟蛋白質(zhì)。信號肽/前導(dǎo)序列連接在所述蛋白質(zhì)的n末端。

如本文所用的“受試者”可指想要或需要用本文所描述的疫苗進(jìn)行免疫的哺乳動物。

如本文所用的“大致上相同的”可指第一氨基酸序列和第二氨基酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或更多個氨基酸的區(qū)域上至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。大致上相同的還可指第一核酸序列和第二核酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或更多個核苷酸的區(qū)域上至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。

如本文所用的“治療(treatment)”或“治療(treating)”可以意指通過預(yù)防、抑制、阻遏的手段保護(hù)動物免于疾病或完全消除疾病。預(yù)防疾病涉及在疾病發(fā)作之前向動物施用本發(fā)明的疫苗。抑制疾病涉及在疾病誘發(fā)之后但在其臨床出現(xiàn)之前向動物施用本發(fā)明的疫苗。阻遏疾病涉及在疾病的臨床出現(xiàn)之后向動物施用本發(fā)明的疫苗。

本文關(guān)于核酸所用的“變體”是指(i)參考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)參考核苷酸序列或其部分的補(bǔ)體；(iii)與參考核酸或其互體大致上相同的核酸；或者(iv)在嚴(yán)格條件下與參考核酸、其補(bǔ)體或與其大致上相同的序列雜交的核酸。

變體可進(jìn)一步定義為通過氨基酸的插入、缺失、或保守性取代而在氨基酸序列上有所不同、但保留至少一種生物活性的肽或多肽。“生物活性”的代表性實例包括被特異性抗體結(jié)合或促進(jìn)免疫應(yīng)答的能力。變體還可指具有與參考蛋白質(zhì)大致上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，所述參考蛋白質(zhì)具有保留至少一種生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守性取代，即用具有類似性質(zhì)(例如，親水性、帶電區(qū)域的程度和分布)的不同氨基酸置換氨基酸，在本領(lǐng)域中被認(rèn)為通常涉及微小變化。這些微小變化可部分地通過考慮氨基酸的親水指數(shù)來鑒定，如本領(lǐng)域中所理解的。kyte等人,j.mol.biol.157:105-132(1982)。氨基酸的親水指數(shù)是基于其疏水性和電荷的考慮。本領(lǐng)域已知具有類似親水指數(shù)的氨基酸可被取代并且仍然保留蛋白質(zhì)功能。一方面，親水指數(shù)為±2的氨基酸被取代。氨基酸的親水性還可用于揭示將產(chǎn)生保留生物功能的蛋白質(zhì)的取代。在肽的背景下氨基酸的親水性的考慮允許計算所述肽的最大局部平均親水性，其是據(jù)報道與抗原性和免疫原性良好相關(guān)的有用測量。如本領(lǐng)域所了解的，具有相似親水性值的氨基酸的取代可產(chǎn)生保留生物活性(例如免疫原性)的肽?？捎帽舜司哂小?之內(nèi)的親水性值的氨基酸執(zhí)行取代。氨基酸的疏水性指數(shù)和親水性值兩者均受所述氨基酸的具體側(cè)鏈影響。與所述觀察一致的是，可與生物功能相容的氨基酸取代被理解為取決于所述氨基酸的相對類似性，并且特別是那些氨基酸的側(cè)鏈的相對類似性，如通過疏水性、親水性、電荷、大小及其他性質(zhì)所揭示。

變體可以是在全基因序列或其片段的全長上大致相同的核酸序列。核酸序列可在基因序列或其片段的全長上80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。變體可以是在氨基酸序列或其片段的全長上大致相同的氨基酸序列。氨基酸序列可在氨基酸序列或其片段的全長上80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

如本文所用的“載體”是指含有復(fù)制起點的核酸序列。載體可以是病毒載體、噬菌體、細(xì)菌人工染色體或酵母人工染色體。載體可以是dna或rna載體。載體可以是自我復(fù)制的染色體外載體，并且優(yōu)選地是dna質(zhì)粒。

對于本文的數(shù)值范圍的敘述來說，明確地涵蓋具有相同精確度的介于其間的每個中間數(shù)字。例如，對于6-9的范圍來說，除6和9之外，還涵蓋數(shù)字7和8，并且對于范圍6.0-7.0來說，明確地涵蓋數(shù)字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

描述

本發(fā)明提供pedv抗原的共有序列。pedv共有抗原可以是pedv共有刺突抗原、其片段、其變體或其組合。pedv刺突抗原能夠在哺乳動物中引發(fā)針對一種或多種pedv毒株的免疫應(yīng)答。pedv刺突抗原可包含使其作為可誘導(dǎo)抗pedv免疫應(yīng)答的免疫原尤其有效的表位。

pedv共有刺突抗原可以是來源于兩種或更多種pedv毒株的共有序列。pedv刺突抗原可包含共有序列和/或用于改善表達(dá)的修飾。修飾可包括密碼子優(yōu)化、rna優(yōu)化、加入kozak序列以便增加翻譯起始和/或加入免疫球蛋白前導(dǎo)序列以提高pedv共有刺突抗原的免疫原性。

pedv共有刺突抗原可包含信號肽如免疫球蛋白信號肽，例如但不限于免疫球蛋白e(ige)或免疫球蛋白(igg)信號肽。在一些實施方案中，pedv共有刺突抗原可包含血凝素(ha)標(biāo)簽。pedv共有刺突抗原可被設(shè)計來引發(fā)比相應(yīng)的密碼子優(yōu)化的刺突抗原更強(qiáng)且更廣泛的細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答。

在一些實施方案中，pedv共有刺突抗原連接至天然前導(dǎo)序列。在一些實施方案中，pedv共有刺突抗原連接至ige前導(dǎo)序列。在一些實施方案中，天然前導(dǎo)序列具有seqidno:7的氨基酸序列。在一些實施方案中，ige前導(dǎo)序列具有seqidno:9的序列。

在一個實施方案中，pedv共有刺突抗原由seqidno:1的核酸序列編碼。在一個實施方案中，pedv共有刺突抗原由包含seqidno:1的核酸序列和可操作地連接在seqidno:1的5’端的seqidno:6的核酸序列的核酸分子編碼。在一個實施方案中，pedv共有刺突抗原由包含seqidno:1和可操作地連接在seqidno:1的5’端的seqidno:8的核酸序列的核酸分子編碼。在一個實施方案中，pedv共有刺突抗原由seqidno:4的核酸序列編碼。在一個實施方案中，pedv共有刺突抗原由包含seqidno:4的核酸序列和可操作地連接在seqidno:4的5’端的seqidno:6的核酸序列的核酸分子編碼。在一個實施方案中，pedv共有刺突抗原由包含seqidno:4和可操作地連接在seqidno:4的5’端的seqidno:8的核酸序列的核酸分子編碼。

pedv共有刺突抗原可由seqidno:1的核酸序列編碼。在一些實施方案中，pedv共有刺突抗原可以是在seqidno:1中列出的核酸序列的全長上具有至少約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。在其他實施方案中，pedv共有刺突抗原可由編碼在seqidno:2中列出的氨基酸序列的全長上具有至少約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的核酸序列編碼。在一些實施方案中，在seqidno:1中所列出的核酸序列的全長上具有至少約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列可操作地連接至編碼前導(dǎo)序列(如天然前導(dǎo)序列或ige前導(dǎo)序列)的核酸序列。在一些實施方案中，前導(dǎo)序列由seqidno:6編碼。在一些實施方案中，前導(dǎo)序列由seqidno:8編碼。在一些實施方案中，在seqidno:1中列出的核酸序列的全長上具有至少約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列不含編碼前導(dǎo)序列的核酸分子。

pedv共有刺突抗原可由seqidno:4的核酸序列編碼。在一些實施方案中，pedv共有刺突抗原可由在seqidno:4中列出的核酸序列的全長上具有至少約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列編碼。在其他實施方案中，pedv共有刺突抗原可由編碼在seqidno:5中列出的氨基酸序列的全長上具有至少約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的核酸序列編碼。在一些實施方案中，在seqidno:4中列出的核酸序列的全長上具有至少約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列可操作地連接至編碼前導(dǎo)序列(如天然前導(dǎo)序列或ige前導(dǎo)序列)的核酸序列。在一些實施方案中，前導(dǎo)序列由seqidno:6編碼。在一些實施方案中，前導(dǎo)序列由seqidno:8編碼。在一些實施方案中，在seqidno:4中列出的核酸序列的全長上具有至少約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列不含編碼前導(dǎo)序列的核酸序列。

在一個實施方案中，pedv共有刺突抗原包含seqidno:2的氨基酸序列。在一些實施方案中，pedv共有刺突抗原包含在seqidno:2中列出的氨基酸序列的全長上具有至少約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一個實施方案中，pedv共有刺突抗原包含seqidno:5的氨基酸序列。在一些實施方案中，pedv共有刺突抗原包含在seqidno:5中列出的氨基酸序列的全長上具有至少約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

可提供seqidno:2的免疫原性片段。免疫原性片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的seqidno:2。在一些實施方案中，pedv共有刺突抗原或免疫原性片段可操作地連接至前導(dǎo)序列，如天然前導(dǎo)序列或ige前導(dǎo)序列。在一些實施方案中，前導(dǎo)序列是seqidno:7。在一些實施方案中，前導(dǎo)序列是seqidno:9。在一些實施方案中，免疫原性片段不含前導(dǎo)序列。

可提供seqidno:5的免疫原性片段。免疫原性片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的seqidno:5。在一些實施方案中，pedv共有刺突抗原或免疫原性片段可操作地連接至前導(dǎo)序列，如天然前導(dǎo)序列或ige前導(dǎo)序列。在一些實施方案中，前導(dǎo)序列是seqidno:7。在一些實施方案中，前導(dǎo)序列是seqidno:9。在一些實施方案中，免疫原性片段不含前導(dǎo)序列。

可提供具有與seqidno:2的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的免疫原性片段。此類免疫原性片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的與seqidno:295％同源的蛋白質(zhì)。一些實施方案涉及與本文的共有蛋白質(zhì)序列的免疫原性片段具有96％同源性的免疫原性片段。一些實施方案涉及與本文的共有蛋白質(zhì)序列的免疫原性片段具有97％同源性的免疫原性片段。一些實施方案涉及與本文的共有蛋白質(zhì)序列的免疫原性片段具有98％同源性的免疫原性片段。一些實施方案涉及與本文共有蛋白質(zhì)序列的免疫原性片段具有99％同源性的免疫原性片段。在一些實施方案中，免疫原性片段可操作地連接至前導(dǎo)序列，例如像免疫球蛋白前導(dǎo)序列，如ige前導(dǎo)序列。在一些實施方案中，免疫原性片段不含前導(dǎo)序列。

可提供具有與seqidno:5的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的免疫原性片段。此類免疫原性片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的與seqidno:595％同源的蛋白質(zhì)。一些實施方案涉及與本文的共有蛋白質(zhì)序列的免疫原性片段具有96％同源性的免疫原性片段。一些實施方案涉及與本文的共有蛋白質(zhì)序列的免疫原性片段具有97％同源性的免疫原性片段。一些實施方案涉及與本文的共有蛋白質(zhì)序列的免疫原性片段具有98％同源性的免疫原性片段。一些實施方案涉及與本文的共有蛋白質(zhì)序列的免疫原性片段具有99％同源性的免疫原性片段。在一些實施方案中，免疫原性片段可操作地連接至前導(dǎo)序列，例如像免疫球蛋白前導(dǎo)序列，如ige前導(dǎo)序列。在一些實施方案中，免疫原性片段不含前導(dǎo)序列。

一些實施方案涉及seqidno:1的免疫原性片段。免疫原性片段可以是至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的seqidno:1。免疫原性片段可與seqidno:1的片段至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源。在一些實施方案中，免疫原性片段可操作地連接至編碼前導(dǎo)序列的序列，所述前導(dǎo)序列例如像免疫球蛋白前導(dǎo)序列，如ige前導(dǎo)序列。在一些實施方案中，免疫原性片段可操作地連接至seqidno:6。在一些實施方案中，免疫原性片段可操作地連接至seqidno:8。在一些實施方案中，片段不含編碼前導(dǎo)序列的編碼序列。

一些實施方案涉及seqidno:4的免疫原性片段。免疫原性片段可以是至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的seqidno:4。免疫原性片段可與seqidno:4的片段至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源。在一些實施方案中，免疫原性片段可操作地連接至編碼前導(dǎo)序列的序列，所述前導(dǎo)序列例如像免疫球蛋白前導(dǎo)序列，如ige前導(dǎo)序列。在一些實施方案中，免疫原性片段可操作地連接至seqidno:6。在一些實施方案中，免疫原性片段可操作地連接至seqidno:8。在一些實施方案中，片段不含編碼前導(dǎo)序列的編碼序列。

疫苗

本文提供免疫原性組合物如疫苗，其包含豬流行性腹瀉病毒(pedv)抗原、其片段、其變體或其組合。所述疫苗可用于保護(hù)免于感染pedv的許多毒株，由此治療、預(yù)防和/或保護(hù)免于基于pedv的病變。所述疫苗可顯著地誘導(dǎo)施用所述疫苗的受試者(例如，豬)的免疫應(yīng)答，由此保護(hù)免于pedv感染并治療pedv感染。

所述疫苗可以是dna疫苗、肽疫苗、或dna與肽疫苗的組合。dna疫苗可包含編碼pedv共有刺突抗原的核酸序列。所述核酸序列可以是dna、rna、cdna、其變體、其片段或其組合。所述核酸序列還可包含編碼通過肽鍵與pedv共有刺突抗原連接的接頭序列、前導(dǎo)序列或標(biāo)簽序列的另外的序列。肽疫苗可包含pedv共有抗原肽、pedv共有刺突抗原、其變體、其片段或其組合。dna與肽疫苗的組合可包含以上描述的編碼pedv共有刺突抗原的核酸序列。

疫苗可在施用所述疫苗的受試者中誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。所誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答可對pedv共有刺突抗原具有特異性。所誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答可與pedv共有刺突抗原反應(yīng)。體液免疫應(yīng)答可在施用疫苗的受試者中被誘導(dǎo)約1.5倍至約16倍、約2倍至約12倍、或約3倍至約10倍。體液免疫應(yīng)答可在施用疫苗的受試者中被誘導(dǎo)至少約1.5倍、至少約2.0倍、至少約2.5倍、至少約3.0倍、至少約3.5倍、至少約4.0倍、至少約4.5倍、至少約5.0倍、至少約5.5倍、至少約6.0倍、至少約6.5倍、至少約7.0倍、至少約7.5倍、至少約8.0倍、至少約8.5倍、至少約9.0倍、至少約9.5倍、至少約10.0倍、至少約10.5倍、至少約11.0倍、至少約11.5倍、至少約12.0倍、至少約12.5倍、至少約13.0倍、至少約13.5倍、至少約14.0倍、至少約14.5倍、至少約15.0倍、至少約15.5倍、或至少約16.0倍。

由疫苗誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答可包括與不施用疫苗的受試者相比與施用疫苗的受試者相關(guān)的增加水平的中和抗體。中和抗體可對pedv共有刺突抗原具有特異性。中和抗體可與pedv共有刺突抗原反應(yīng)。中和抗體可在施用疫苗的受試者中提供針對pedv感染的保護(hù)和/或治療pedv感染及其相關(guān)病變。

由疫苗誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答可包括與不施用疫苗的受試者相比與施用疫苗的受試者相關(guān)的增加水平的igg抗體。這些igg抗體可對pedv共有刺突抗原具有特異性。這些igg抗體可與pedv共有刺突抗原反應(yīng)。優(yōu)選地，體液應(yīng)答對pedv的兩種或更多種毒株有交叉反應(yīng)性。與施用疫苗的受試者有關(guān)的igg抗體水平與不施用疫苗的受試者相比可提高了約1.5倍至約16倍、約2倍至約12倍、或約3倍至約10倍。與施用疫苗的受試者相關(guān)的igg抗體水平與未施用疫苗的受試者相比可提高至少約1.5倍、至少約2.0倍、至少約2.5倍、至少約3.0倍、至少約3.5倍、至少約4.0倍、至少約4.5倍、至少約5.0倍、至少約5.5倍、至少約6.0倍、至少約6.5倍、至少約7.0倍、至少約7.5倍、至少約8.0倍、至少約8.5倍、至少約9.0倍、至少約9.5倍、至少約10.0倍、至少約10.5倍、至少約11.0倍、至少約11.5倍、至少約12.0倍、至少約12.5倍、至少約13.0倍、至少約13.5倍、至少約14.0倍、至少約14.5倍、至少約15.0倍、至少約15.5倍或至少約16.0倍。

疫苗可在施用所述疫苗的受試者中誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答可對pedv共有刺突抗原具有特異性。所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答可與pedv共有刺突抗原反應(yīng)。優(yōu)選地，細(xì)胞應(yīng)答對pedv的兩種或更多種毒株有交叉反應(yīng)性。所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答可包括引發(fā)cd8⁺t細(xì)胞應(yīng)答。所引發(fā)的cd8⁺t細(xì)胞應(yīng)答可與pedv抗原反應(yīng)。所引發(fā)的cd8⁺t細(xì)胞應(yīng)答可以是多功能的。所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答可包括引發(fā)cd8⁺t細(xì)胞應(yīng)答，其中cd8⁺t細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-γ(ifn-γ)、腫瘤壞死因子α(tnf-α)、白細(xì)胞介素-2(il-2)、或ifn-γ與tnf-α的組合。

所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答可包括與不施用疫苗的受試者相比與施用疫苗的受試者相關(guān)的增加的cd8⁺t細(xì)胞應(yīng)答。與施用疫苗的受試者相關(guān)的cd8⁺t細(xì)胞應(yīng)答與未施用疫苗的受試者相比可增加約2倍至約30倍、約3倍至約25倍、或約4倍至約20倍。與施用疫苗的受試者相關(guān)的cd8⁺t細(xì)胞應(yīng)答與未施用疫苗的受試者相比可增加至少約1.5倍、至少約2.0倍、至少約3.0倍、至少約4.0倍、至少約5.0倍、至少約6.0倍、至少約6.5倍、至少約7.0倍、至少約7.5倍、至少約8.0倍、至少約8.5倍、至少約9.0倍、至少約9.5倍、至少約10.0倍、至少約10.5倍、至少約11.0倍、至少約11.5倍、至少約12.0倍、至少約12.5倍、至少約13.0倍、至少約13.5倍、至少約14.0倍、至少約14.5倍、至少約15.0倍、至少約16.0倍、至少約17.0倍、至少約18.0倍、至少約19.0倍、至少約20.0倍、至少約21.0倍、至少約22.0倍、至少約23.0倍、至少約24.0倍、至少約25.0倍、至少約26.0倍、至少約27.0倍、至少約28.0倍、至少約29.0倍、或至少約30.0倍。

所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答可包括產(chǎn)生ifn-γ的cd3⁺cd8⁺t細(xì)胞的出現(xiàn)率增加。與施用疫苗的受試者相關(guān)的cd3⁺cd8⁺ifn-γ⁺t細(xì)胞的出現(xiàn)率與未施用疫苗的受試者相比可增加至少約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、或20倍。

所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答可包括產(chǎn)生tnf-α的cd3⁺cd8⁺t細(xì)胞的出現(xiàn)率增加。與施用疫苗的受試者相關(guān)的cd3⁺cd8⁺tnf-α⁺t細(xì)胞的出現(xiàn)率與未施用疫苗的受試者相比可增加至少約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、或14倍。

所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答可包括產(chǎn)生il-2的cd3⁺cd8⁺t細(xì)胞的出現(xiàn)率增加。與施用疫苗的受試者相關(guān)的cd3⁺cd8⁺il-2⁺t細(xì)胞的出現(xiàn)率與未施用疫苗的受試者相比可增加至少約0.5倍、1.0倍、1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、或5.0倍。

所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答可包括產(chǎn)生ifn-γ和tnf-α的cd3⁺cd8⁺t細(xì)胞的出現(xiàn)率增加。與施用疫苗的受試者相關(guān)的cd3⁺cd8⁺ifn-γ⁺tnf-α⁺t細(xì)胞的出現(xiàn)率與未施用疫苗的受試者相比可增加至少約25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍、160倍、170倍、或180倍。

由疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答可包括引發(fā)cd4⁺t細(xì)胞應(yīng)答。所引發(fā)的cd4⁺t細(xì)胞應(yīng)答可與pedv抗原反應(yīng)。所引發(fā)的cd4⁺t細(xì)胞應(yīng)答可以是多功能的。所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答可包括引發(fā)cd4⁺t細(xì)胞應(yīng)答，其中cd4⁺t細(xì)胞產(chǎn)生ifn-γ、tnf-α、il-2、或ifn-γ與tnf-α的組合。

所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答可包括產(chǎn)生ifn-γ的cd3⁺cd4⁺t細(xì)胞的出現(xiàn)率增加。與施用疫苗的受試者相關(guān)的cd3⁺cd4⁺ifn-γ⁺t細(xì)胞的出現(xiàn)率與未施用疫苗的受試者相比可增加至少約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、或20倍。

所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答可包括產(chǎn)生tnf-α的cd3⁺cd4⁺t細(xì)胞的出現(xiàn)率增加。與施用疫苗的受試者相關(guān)的cd3⁺cd4⁺tnf-α⁺t細(xì)胞的出現(xiàn)率與未施用疫苗的受試者相比可增加至少約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍或22倍。

所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答可包括產(chǎn)生il-2的cd3⁺cd4⁺t細(xì)胞的出現(xiàn)率增加。與施用疫苗的受試者相關(guān)的cd3⁺cd4⁺il-2⁺t細(xì)胞的出現(xiàn)率與未施用疫苗的受試者相比可增加至少約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、45倍、50倍、55倍、或60倍。

所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答可包括產(chǎn)生ifn-γ和tnf-α的cd3⁺cd4⁺t細(xì)胞的出現(xiàn)率增加。與施用疫苗的受試者相關(guān)的cd3⁺cd4⁺ifn-γ⁺tnf-α⁺的出現(xiàn)率與未施用疫苗的受試者相比可增加至少約2倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、5.5倍、6.0倍、6.5倍、7.0倍、7.5倍、8.0倍、8.5倍、9.0倍、9.5倍、10.0倍、10.5倍、11.0倍、11.5倍、12.0倍、12.5倍、13.0倍、13.5倍、14.0倍、14.5倍、15.0倍、15.5倍、16.0倍、16.5倍、17.0倍、17.5倍、18.0倍、18.5倍、19.0倍、19.5倍、20.0倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、或35倍。

本發(fā)明的疫苗可具有有效疫苗所要求的特征，如為安全的，以使得疫苗本身不會引起疾病或死亡；保護(hù)免受由暴露于活的病原體(如病毒或細(xì)菌)引起的疾?。徽T導(dǎo)中和抗體來預(yù)防細(xì)胞的感染；誘導(dǎo)針對細(xì)胞內(nèi)病原體的保護(hù)性t細(xì)胞；以及提供施用容易性、很少副作用、生物穩(wěn)定性以及每劑量的低成本。

當(dāng)施用至不同組織如肌肉或皮膚時，疫苗可進(jìn)一步誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。當(dāng)經(jīng)由電穿孔或注射或皮下或肌內(nèi)施用時，疫苗可進(jìn)一步誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。

載體

所述疫苗可包含一種或多種包含編碼pedv共有刺突抗原的核酸的載體。所述一種或多種載體可能能夠表達(dá)pedv共有刺突抗原。載體可具有含有復(fù)制起點的核酸序列。載體可以是質(zhì)粒、噬菌體、細(xì)菌人工染色體或酵母人工染色體。載體可以是自我復(fù)制的染色體外載體，或整合到宿主基因組中的載體。

一種或多種載體可以是表達(dá)構(gòu)建體，所述表達(dá)構(gòu)建體通常是用于將特定基因引入靶細(xì)胞中的質(zhì)粒。一旦表達(dá)載體位于細(xì)胞內(nèi)部，就通過細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)器核糖體復(fù)合物產(chǎn)生由基因編碼的蛋白質(zhì)。質(zhì)粒經(jīng)常經(jīng)過工程改造以含有調(diào)控序列，所述調(diào)控序列充當(dāng)增強(qiáng)子和啟動子區(qū)域，并且導(dǎo)致表達(dá)載體上攜帶的基因的有效轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明的載體表達(dá)大量的穩(wěn)定信使rna，且因此表達(dá)蛋白質(zhì)。

載體可具有表達(dá)信號(如強(qiáng)啟動子、強(qiáng)終止密碼子)、啟動子與克隆基因之間的距離的調(diào)節(jié)以及轉(zhuǎn)錄終止序列和ptis(可移動翻譯起始序列)的插入。

在一些實施方案中，載體還包含連接至編碼序列的n末端并且可操作地連接至啟動子的編碼前導(dǎo)序列(如天然前導(dǎo)序列或ige前導(dǎo)序列)的核酸序列。在一些實施方案中，天然前導(dǎo)序列具有seqidno:7中列出的氨基酸序列。在一些實施方案中，ige前導(dǎo)序列具有seqidno:9中列出的氨基酸序列。載體還可包含連接至所述編碼序列的c末端的聚腺苷酸化序列。

(1)表達(dá)載體

載體可以是環(huán)狀質(zhì)粒或線性核酸。環(huán)狀質(zhì)粒和線性核酸能夠指導(dǎo)適當(dāng)?shù)氖茉囌呒?xì)胞中的特定核苷酸序列的表達(dá)。載體可具有可操作地連接至編碼抗原的核苷酸序列的啟動子，所述核苷酸序列可以可操作地連接至終止信號。載體還可含有核苷酸序列的正確翻譯所需的序列。包含目標(biāo)核苷酸序列的載體可以是嵌合的，這意味著至少一種其組分相對于至少一種它的其他組分是異源的。表達(dá)盒中的核苷酸序列的表達(dá)可在組成型啟動子或誘導(dǎo)型啟動子的控制下，所述啟動子僅在宿主細(xì)胞暴露于一些特定外部刺激時起始轉(zhuǎn)錄。在多細(xì)胞生物體的情況下，啟動子還可以是對特定組織或器官或發(fā)育階段特異性的。

(2)環(huán)狀載體和線性載體

載體可以是環(huán)狀質(zhì)粒，所述環(huán)狀質(zhì)?？赏ㄟ^整合至細(xì)胞基因組中來轉(zhuǎn)化靶細(xì)胞或存在于染色體外(例如，具有復(fù)制起點的自主復(fù)制質(zhì)粒)。

載體可以是pvax、pcdna3.0或provax，或能夠表達(dá)編碼抗原的dna并且使細(xì)胞能將序列翻譯成由免疫系統(tǒng)識別的抗原的任何其他表達(dá)載體。

本文還提供一種能夠通過電穿孔有效遞送至受試者且表達(dá)一種或多種所需抗原的線性核酸疫苗或線性表達(dá)盒(“l(fā)ec”)。lec可以是沒有任何磷酸主鏈的任何線性dna。dna可編碼一種或多種抗原。lec可包含啟動子、內(nèi)含子、終止密碼子和/或聚腺苷酸化信號?？乖谋磉_(dá)可受啟動子控制。lec可不包含任何抗生素抗性基因和/或磷酸主鏈。lec可不含有與所需抗原基因表達(dá)無關(guān)的其他核酸序列。

lec可源自能夠線性化的任何質(zhì)粒。質(zhì)?？赡軌虮磉_(dá)抗原。質(zhì)?？梢允莗np(puertorico/34)或pm2(newcaledonia/99)。質(zhì)?？梢允莣lv009、pvax、pcdna3.0或provax，或能夠表達(dá)編碼抗原的dna并且使細(xì)胞能將序列翻譯成由免疫系統(tǒng)識別的抗原的任何其他表達(dá)載體。

lec可以是pcrm2。lec可以是pcrnp。pcrnp和pcrmr可分別源自pnp(puertorico/34)和pm2(newcaledonia/99)。

(3)啟動子、內(nèi)含子、終止密碼子和聚腺苷酸化信號

載體可具有啟動子。啟動子可以是能夠驅(qū)動基因表達(dá)并且調(diào)控所分離核酸的表達(dá)的任何啟動子。這種啟動子是通過dna依賴性rna聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄所需的順式作用序列元件，所述rna聚合酶轉(zhuǎn)錄本文所述的抗原序列。用于指導(dǎo)異源核酸表達(dá)的啟動子的選擇取決于具體應(yīng)用。在載體中，啟動子可定位在距離轉(zhuǎn)錄起始點與其天然環(huán)境中距離轉(zhuǎn)錄起始位點大約相同的距離處。然而，可容許所述距離的變化而不損失啟動子功能。

啟動子可以可操作地連接至編碼抗原以及轉(zhuǎn)錄物的有效聚腺苷酸化、核糖體結(jié)合位點和翻譯終止所需的信號的核酸序列。啟動子可以是cmv啟動子、sv40早期啟動子、sv40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠乳腺腫瘤病毒啟動子、勞斯(rous)肉瘤病毒啟動子、多角體蛋白啟動子，或?qū)τ谡婧思?xì)胞中的表達(dá)顯示有效的另一種啟動子。

載體可包含增強(qiáng)子和具有功能性剪接供體和受體位點的內(nèi)含子。載體可含有位于結(jié)構(gòu)基因下游的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)以提供有效終止?？蓮呐c啟動子序列相同的基因獲得或可從不同的基因獲得終止區(qū)。

賦形劑和疫苗的其他組分

本發(fā)明的疫苗還可包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。藥學(xué)上可接受的賦形劑可以是功能性分子，如媒介物、載體或稀釋劑。藥學(xué)上可接受的賦形劑可以是轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑，其可包括表面活性劑如免疫刺激復(fù)合物(iscoms)、弗氏(freunds)不完全佐劑、lps類似物(包括單磷?；|(zhì)a)、胞壁酰肽、醌類似物、囊泡如角鯊烯和角鯊烯、透明質(zhì)酸、脂質(zhì)、脂質(zhì)體、鈣離子、病毒蛋白質(zhì)、聚陰離子、聚陽離子或納米粒子或其他已知的轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑。

所述轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑是聚陰離子、聚陽離子(包括聚-l-谷氨酸(lgs))或脂質(zhì)。轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑是聚-l-谷氨酸，并且聚-l-谷氨酸可以小于6mg/ml的濃度存在于疫苗中。轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑還可包括表面活性劑，如免疫刺激復(fù)合物(iscoms)、弗氏不完全佐劑、lps類似物(包括單磷?；|(zhì)a)、胞壁酰肽、苯醌類似物以及囊泡(如角鯊烯和角鯊烯)，并且透明質(zhì)酸還可結(jié)合基因構(gòu)建體施用而使用。dna質(zhì)粒疫苗還可包含轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑，如脂質(zhì)、脂質(zhì)體(包括卵磷脂脂質(zhì)體或本領(lǐng)域已知的其他脂質(zhì)體，如dna-脂質(zhì)體混合物(參見例如w09324640))、鈣離子、病毒蛋白、聚陰離子、聚陽離子或納米粒子，或其他已知的轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑。所述轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑是聚陰離子、聚陽離子(包括聚-l-谷氨酸(lgs))或脂質(zhì)。轉(zhuǎn)染劑在疫苗中的濃度是小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。

藥學(xué)上可接受的賦形劑可以是佐劑。佐劑可以是在替代質(zhì)粒中表達(dá)或作為蛋白質(zhì)與在疫苗中的以上質(zhì)粒組合而被遞送的其他基因。

可根據(jù)待使用的施用方式來配制疫苗?？勺⑸涞囊呙缢幬锝M合物可以是無菌、不含熱原并且不含微粒的。可使用等滲制劑或溶液。用于等滲性的添加劑可包括氯化鈉、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。疫苗可包含血管收縮劑。等滲溶液可包括磷酸鹽緩沖鹽水。疫苗還可包含穩(wěn)定劑(包括明膠和白蛋白)。穩(wěn)定劑可允許制劑在室溫或環(huán)境溫度下穩(wěn)定持續(xù)延長的時間段，所述穩(wěn)定劑包括lgs或聚陽離子或聚陰離子。

疫苗接種的方法

本文還提供一種通過向有需要的受試者施用疫苗來在受試者中治療、保護(hù)免于和/或預(yù)防疾病的方法。向受試者施用疫苗可在所述受試者中誘導(dǎo)或引發(fā)免疫應(yīng)答。所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答可用于治療、預(yù)防和/或保護(hù)免于疾病，例如與pedv感染有關(guān)的病變。所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答提供施用疫苗的受試者對一種或多種pedv毒株的抗性。

所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答可包括誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答和/或誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。體液免疫應(yīng)答可被誘導(dǎo)約1.5倍至約16倍、約2倍至約12倍、或約3倍至約10倍。所誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答可包括對抗原有反應(yīng)性的igg抗體和/或中和抗體。所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答可包括cd8⁺t細(xì)胞應(yīng)答，其被誘導(dǎo)約2倍至約30倍、約3倍至約25倍、或約4倍至約20倍。

疫苗劑量可介于1μg至10mg之間的活性組分/kg體重/時間，并且可以是20μg至10mg組分/kg體重/時間。可每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗。用于有效治療的疫苗劑量的數(shù)目可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

所述疫苗可根據(jù)藥物領(lǐng)域中的技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來配制。所述組合物可由醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員在考慮了如具體受試者的年齡、性別、體重和病狀以及施用途徑的這類因素之后，按其熟知的劑量和技術(shù)進(jìn)行施用。受試者可以是豬。

可預(yù)防性地或治療性地施用疫苗。在預(yù)防性施用中，可以足以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的量施用疫苗。在治療性應(yīng)用中，以足以引發(fā)治療效果的量向有需要的受試者施用疫苗。將足以實現(xiàn)此目標(biāo)的量定義為“治療有效劑量”。對于這種用途有效的量將取決于(例如)所施用的疫苗方案的具體組成、施用方式、疾病的階段和嚴(yán)重程度、受試者的總體健康狀況以及處方醫(yī)師的判斷。

疫苗可通過如下文獻(xiàn)中所描述的本領(lǐng)域中熟知的方法來施用：donnelly等人(ann.rev.immunol.15:617-648(1997))；felgner等人(美國專利號5,580,859，1996年12月3日頒布)；felgner(美國專利號5,703,055，1997年12月30日頒布)；以及carson等人(美國專利號5,679,647，1997年10月21日頒布)，所有文獻(xiàn)的內(nèi)容以引用的方式整體并入本文?？?例如)使用疫苗槍將疫苗的dna與可施用至個體的顆?；蛑榱＿M(jìn)行復(fù)合。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將知道藥學(xué)上可接受的載體(包括生理學(xué)上可接受的化合物)的選擇取決于(例如)表達(dá)載體的施用途徑。

可經(jīng)由多種途徑來遞送疫苗。典型的遞送途徑包括胃腸外施用，例如，皮內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下遞送。其他途徑包括口服施用、鼻內(nèi)和陰道內(nèi)途徑。特別是對于疫苗的dna來說，可將疫苗遞送至個體的組織的間隙空間(felgner等人，美國專利號5,580,859和5,703,055，所有所述專利的內(nèi)容以引用的方式整體并入本文)。還可將疫苗施用至肌肉，或可經(jīng)由皮內(nèi)或皮下注射或經(jīng)皮(如通過離子電滲療法)施用。還可采用疫苗的表皮施用。表皮施用可涉及機(jī)械地或化學(xué)地刺激表皮的最外層，以刺激對刺激物的免疫應(yīng)答(carson等人，美國專利號5,679,647，所述專利的內(nèi)容以引用的方式整體并入本文)。

還可配制疫苗以用于經(jīng)由鼻通道施用。適合用于經(jīng)鼻施用的制劑(其中載體是固體)可包括具有(例如)在約10微米至約500微米范圍中的顆粒大小的粗糙粉末，所述粗糙粉末以其中采用鼻吸的方式來施用，即，通過鼻通道從靠近鼻子的粉末的容器中快速吸入。制劑可以是鼻用噴霧劑、滴鼻劑或通過噴霧器進(jìn)行氣霧劑施用。制劑可包含疫苗的水性溶液或油性溶液。

疫苗可以是液體制劑，如混懸劑、糖漿劑或酏劑。疫苗還可以是用于胃腸外、皮下、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)施用(例如，可注射施用)的制劑，如無菌混懸劑或乳劑。

疫苗可并入脂質(zhì)體、微球體或其他聚合物基質(zhì)中(felgner等人，美國專利號5,703,055；gregoriadis,liposometechnology,第i卷至第iii卷(第二版，1993)，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容以引用的方式整體并入本文)。脂質(zhì)體可由磷脂或其他脂質(zhì)組成，并且可以是制造和施用相對簡單的無毒的、生理學(xué)上可接受的和可代謝的載體。

可經(jīng)由電穿孔，如通過美國專利號7,664,545中所描述的方法來施用疫苗，所述專利的內(nèi)容以引用的方式并入本文。電穿孔可通過美國專利號6,302,874、5,676,646、6,241,701、6,233,482、6,216,034、6,208,893、6,192,270、6,181,964、6,150,148、6,120,493、6,096,020、6,068,650和5,702,359中所描述的方法和/或設(shè)備進(jìn)行，所述專利的內(nèi)容以引用的方式整體并入本文?？山?jīng)由微創(chuàng)裝置來進(jìn)行電穿孔。

微創(chuàng)電穿孔裝置(“mid”)可以是用于將以上所描述的疫苗和相關(guān)流體注射至身體組織中的設(shè)備。所述裝置可包括中空針、dna盒和流體遞送部件，其中所述裝置適于在使用中致動流體遞送部件，以便在將針插入身體組織中的過程中同時(例如，自動地)將dna注射至所述身體組織中。這具有以下優(yōu)點：在插入針的同時逐漸注射dna和相關(guān)流體的能力導(dǎo)致通過身體組織的流體的更均勻分布。由于注射的dna分布在較大面積上，所以可減少注射過程中經(jīng)受的疼痛。

mid可在不使用針的情況下將疫苗注射至組織中。mid可將疫苗作為小的流或射流以使得疫苗穿透組織的表面并且進(jìn)入下層組織和/或肌肉的力進(jìn)行注射。小的流或射流之后的力可由壓縮氣體(如在幾分之一秒內(nèi)通過微小孔的二氧化碳)的膨脹提供。微創(chuàng)電穿孔裝置的實例和使用它們的方法在公布的美國專利申請?zhí)?0080234655、美國專利號6,520,950、美國專利號7,171,264、美國專利號6,208,893、美國專利號6,009,347、美國專利號6,120,493、美國專利號7,245,963、美國專利號7,328,064和美國專利號6,763,264中描述，所述專利各自的內(nèi)容以引用的方式并入本文。

mid可包括產(chǎn)生無痛地穿透組織的液體的高速射流的注射器。此類無針注射器可商購獲得。本文可使用的無針注射器的實例包括美國專利號3,805,783、4,447,223、5,505,697和4,342,310中所描述的那些，所述專利各自的內(nèi)容以引用的方式并入本文。

可使用無針注射器將呈適用于直接或間接電轉(zhuǎn)運形式的所需疫苗引入(例如注射)至待治療的組織中，通常通過將組織表面與注射器接觸，以便以足以導(dǎo)致疫苗滲透至組織中的力致動藥劑射流的遞送。例如，如果待治療的組織是粘膜、皮膚或肌肉，那么將藥劑朝向粘膜或皮膚表面以足以導(dǎo)致藥劑滲透穿過角質(zhì)層并且進(jìn)入真皮層中或分別進(jìn)入下層組織和肌肉中的力進(jìn)行噴射。

無針注射器非常適合于將疫苗遞送至所有類型的組織，特別是遞送至皮膚和粘膜。在一些實施方案中，無針注射器可用于將含有疫苗的液體推送至表面并且進(jìn)入受試者的皮膚或粘膜中。可使用本發(fā)明的方法治療的各種類型的組織的代表性實例包括胰腺、喉、鼻咽、下咽部、口咽、唇、咽、肺、心臟、腎、肌肉、乳房、結(jié)腸、前列腺、胸腺、睪丸、皮膚、粘膜組織、卵巢、血管或其任何組合。

mid可具有將組織電穿孔的針電極。通過在多電極陣列(例如設(shè)置成矩形或正方形圖案)中的多對電極之間脈沖來提供優(yōu)于在一對電極之間脈沖的結(jié)果的改進(jìn)的結(jié)果。例如于名稱為“needleelectrodesformediateddeliveryofdrugsandgenes”的美國專利號5,702,359中公開針陣列，其中可在治療性處理過程中對多對針產(chǎn)生脈沖。在所述申請中(其以引用的方式并入本文，如同其全文陳述一樣)，針安置在環(huán)形陣列中，但具有連接器和轉(zhuǎn)換裝置，從而實現(xiàn)相對的針電極對之間的脈沖。可使用用于將重組表達(dá)載體遞送至細(xì)胞的一對針電極。這種裝置和系統(tǒng)在美國專利號6,763,264中進(jìn)行描述，所述專利的內(nèi)容以引用的方式并入本文?；蛘?，可使用單針裝置，所述裝置允許dna注射和使用類似于正常注射針的單針電穿孔并且施加比通過目前所使用的裝置遞送的電壓低的電壓的脈沖，從而減少患者經(jīng)受的電感覺。

mid可包括一個或多個電極陣列。陣列可包括具有相同直徑或不同直徑的兩個或多個針。針可均勻或不均勻地間隔開。針可介于0.005英寸與0.03英寸之間、介于0.01英寸與0.025英寸之間，或介于0.015英寸與0.020英寸之間。針的直徑可以是0.0175英寸。針可間隔開0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm或更多。

mid可由脈沖發(fā)生器和在單個步驟中遞送疫苗和電穿孔脈沖的兩個或更多個針疫苗注射器組成。脈沖發(fā)生器可允許經(jīng)由閃存卡操作的個人計算機(jī)靈活地編程脈沖和注射參數(shù)，以及全面記錄和儲存電穿孔和患者數(shù)據(jù)。脈沖發(fā)生器可在短的時間段期間遞送多種伏特脈沖。例如，脈沖發(fā)生器可遞送100ms持續(xù)時間的三個15伏特脈沖。這種mid的實例是inoviobiomedicalcorporation的elgen1000系統(tǒng)，所述系統(tǒng)在美國專利號7,328,064中進(jìn)行描述，所述專利的內(nèi)容以引用的方式并入本文。

mid可以是cellectra(inoviopharmaceuticals,bluebellpa)裝置和系統(tǒng)，其是便于將大分子(如dna)引入身體或植物中選定組織的細(xì)胞中的模塊化電極系統(tǒng)。模塊化電極系統(tǒng)可包括多個針電極、皮下針、提供從可編程恒流脈沖控制器至多個針電極的導(dǎo)電鏈路的電連接器，以及電源。操作者可抓住固定在支撐結(jié)構(gòu)上的多個針電極并將它們堅固地插入到身體或植物中的選定組織中。然后經(jīng)由皮下針將大分子遞送至選定組織中。啟動可編程的恒定電流脈沖控制器，并將恒定電流電脈沖施加至多個針電極。所施加的恒定電流脈沖促進(jìn)將大分子引入多個電極之間的細(xì)胞中。由于細(xì)胞的過度加熱造成的細(xì)胞死亡通過借助于恒定電流脈沖限制組織中的功率消耗而得以最小化。cellectra裝置和系統(tǒng)在美國專利號7,245,963中進(jìn)行描述，所述專利的內(nèi)容以引用的方式并入本文。

mid可以是elgen1000系統(tǒng)(inoviopharmaceuticals)。elgen1000系統(tǒng)可包括提供中空針的裝置；和流體遞送部件，其中裝置適于在使用中致動流體遞送部件，以便在將針插入身體組織中的過程中同時(例如，自動地)將流體(本文所描述的疫苗)注射至所述身體組織中。優(yōu)點是：在插入針的同時逐漸注射流體的能力導(dǎo)致通過身體組織的流體的更均勻分布。還據(jù)信，由于注射的流體的體積分布在較大面積上，所以減少了在注射過程中經(jīng)受的疼痛。

此外，流體的自動注射有助于所注射流體的實際劑量的自動監(jiān)測和配準(zhǔn)?？筛鶕?jù)需要出于文件編制目的通過控制單元來儲存這一數(shù)據(jù)。

應(yīng)理解，注射速率可以是線性或非線性的，并且可在已經(jīng)將針插入穿過待治療的受試者的皮膚之后并且在將所述針進(jìn)一步插入身體組織中時進(jìn)行注射。

可通過本發(fā)明的裝置將流體注射至其中的適合組織包括腫瘤組織、皮膚或肝組織，但也可以是肌肉組織。

裝置還包括用于引導(dǎo)針插入身體組織中的針插入部件。通過針插入的速率來控制流體注射的速率。這具有以下優(yōu)點：可控制針插入與注射流體兩者以使得可根據(jù)需要使插入速率與注射速率匹配。它還使設(shè)備更易于使用者操作。如果需要，可提供用于將針自動地插入身體組織中的部件。

使用者可選擇何時開始流體的注射。然而，理想地，在針的尖端到達(dá)肌肉組織時開始注射，并且設(shè)備可包括用于感測針何時插入至足以開始注射流體的深度的部件。這意味著當(dāng)針達(dá)到所需深度(其將通常是肌肉組織開始處的深度)時，可提示以自動地開始流體的注射。肌肉組織開始處的深度可以(例如)采用為預(yù)設(shè)針插入深度(如4mm的值)，所述深度將被認(rèn)為是對于針穿過皮膚層來說是足夠的。

感測部件可包括超聲探針。感測部件可包括用于感測阻抗或電阻的變化的部件。在這種情況下，部件可不如此記錄針在身體組織中的深度，而將相反適于隨著針從不同類型的身體組織移動至肌肉中來感測阻抗或電阻的變化。這些替代方案的任一者提供相對準(zhǔn)確且操作簡單的感測可開始注射的部件?？筛鶕?jù)需要進(jìn)一步記錄針的插入深度，并且所述深度可以用于控制流體的注射，以使得根據(jù)正被記錄的針的插入深度來確定待注射的流體的體積。

設(shè)備可還包括：用于支撐針的底座；和用于在其中接納底座的殼體，其中所述底座可相對于所述殼體移動，以使得當(dāng)所述底座相對于所述殼體處于第一向后位置時，針縮回所述殼體內(nèi)，并且當(dāng)所述底座在所述殼體內(nèi)處于第二向前位置時，針延伸出所述殼體。由于殼體可在患者的皮膚上對準(zhǔn)，并且然后可通過相對于底座移動殼體來將針插入患者的皮膚中，所以這對于使用者來說是有利的。

如上所述，希望實現(xiàn)流體注射的受控速率，以使得在將針插入皮膚中時，流體在針的長度上均勻分布。流體遞送部件可包括適于以受控速率注射流體的活塞驅(qū)動部件。可(例如)通過伺服電機(jī)來激活活塞驅(qū)動部件。然而，可通過在軸向方向上相對于殼體移動的底座來致動活塞驅(qū)動部件。應(yīng)理解，可提供用于流體遞送的替代裝置。因此，(例如)可提供可被擠壓用于以受控或非受控速率流體遞送的封閉容器來代替注射器和活塞系統(tǒng)。

以上所描述的裝置可用于任何類型的注射。然而，設(shè)想到它在電穿孔的領(lǐng)域中尤其有用，并且因此它可還包括用于向針施加電壓的部件。這允許針不僅用于注射，而且還用作電穿孔過程中的電極。這一點是尤其有利的，因為它意味著電場被施加至與所注射的流體相同的面積上。電穿孔在傳統(tǒng)上存在的問題在于很難使電極與先前注射的流體準(zhǔn)確對準(zhǔn)，且因此使用者已傾向于在較大的面積上注射大于所需體積的流體且在較大面積上施加電場以試圖確保所注射物質(zhì)與電場之間的重疊。使用本發(fā)明，可減少所注射流體的體積和所施加電場的大小，同時實現(xiàn)電場與流體之間的良好配合。

試劑盒

本文提供一種試劑盒，其可用于使用如上所述的疫苗接種方法治療受試者。所述試劑盒可包括疫苗。

試劑盒還可包括用于進(jìn)行如上所述的疫苗接種方法和/或如何使用試劑盒的說明書。試劑盒中所包括的說明書可附于包裝材料上或可作為包裝插入物包括在內(nèi)。雖然說明書通常是書寫或印刷的材料，但它們不限于此類。本公開涵蓋能夠存儲說明書并且將它們傳達(dá)給最終使用者的任何介質(zhì)。所述介質(zhì)包括但不限于電子存儲介質(zhì)(例如，磁盤、磁帶、盒式磁帶)、光學(xué)介質(zhì)(例如，cdrom)等。如本文所用，術(shù)語“說明書”可包括提供說明書的互聯(lián)網(wǎng)站點的地址。

本發(fā)明具有多個方面，所述方面通過以下非限制性實施例說明。

示例性實施例

可參考以下示例性實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳述。這些實施例僅出于提說明的目的提供，并且不意圖進(jìn)行限制，除非另有規(guī)定。因此，本發(fā)明不應(yīng)以任何方式被解釋為限于以下實施例，而是應(yīng)被解釋為涵蓋因本文提供的教導(dǎo)而變得顯而易見的任何和所有變化。

無需進(jìn)一步描述，據(jù)信本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可使用前述的描述和以下說明性實施例，制備和利用本發(fā)明并實踐所要求保護(hù)的方法。因此，以下工作實施例特別指出本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，并且不應(yīng)被解釋為以任何方式限制本公開的其余部分。

實施例1：共有pedv-刺突疫苗

刺突(s)蛋白是表面糖蛋白pedv，其可誘導(dǎo)中和抗體并且被認(rèn)為是用于開發(fā)針對pedv的有效疫苗的初級靶抗原。刺突蛋白由s1和s2結(jié)構(gòu)域組成并且負(fù)責(zé)病毒附著和與宿主細(xì)胞膜融合。

本文描述開發(fā)僅編碼刺突蛋白的新型共有dna疫苗，其中編碼刺突蛋白的核酸序列被插入真核dna表達(dá)載體中。通過設(shè)計表達(dá)共有s免疫原的基于dna的疫苗，所述疫苗可保護(hù)免于pedv的各種流行毒株，同時利用dna疫苗的安全性和易于產(chǎn)生的優(yōu)點。本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)證明，與對照pvax免疫的組相比，ppedv-s顯著增加產(chǎn)生ifnγ的細(xì)胞的數(shù)目并且誘導(dǎo)對pedv刺突蛋白具有特異性的10⁴的總igg終點滴度。pedvs蛋白內(nèi)的顯性t細(xì)胞表位和顯性線性抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過用重疊11個氨基酸的15聚體肽表位作圖來鑒別。這種研究是開發(fā)針對pedv的新型基于共有dna的疫苗的第一步驟。

通過產(chǎn)生pedv-s蛋白的64個不同的氨基酸序列的共有序列來產(chǎn)生共有氨基酸序列。所有可獲得的全長序列的多樣性在圖1b中示出。共有序列用箭頭標(biāo)記。疫苗的共有pedv刺突的氨基酸序列在seqidno:2中列出。

編碼seqidno:2(疫苗的共有pedv刺突的氨基酸序列)的核酸序列在seqidno:1中列出。

圖1a描繪ppedv-sdna疫苗構(gòu)建體的示意性圖示，所述構(gòu)建體包含編碼共有刺突蛋白的核酸序列。消化的和未消化的構(gòu)建體的凝膠電泳在圖1c中示出。

使用用各種劑量的ppedv-s或pvax1、空載體對照免疫的小鼠，用電穿孔(ep)每2周3次進(jìn)行實驗(圖2)。在第三次免疫2周后分離來自個體小鼠(n＝5)的血清和脾細(xì)胞。進(jìn)行elisa和elispot測定以測量體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。.

將跨越整個共有pedv刺突序列重疊11個氨基酸的15聚體肽混合至6個池中。從免疫的小鼠分離血清，并且通過肽elisa評估對線性表位具有特異性的結(jié)合igg水平。觀察到對每個肽池具有特異性的總抗體應(yīng)答并且在圖3中示出。通過ppedv-s誘導(dǎo)的igg抗體應(yīng)答僅對池4有反應(yīng)。顯性抗體結(jié)合表位的另外表征在進(jìn)行中。

對于與池4的抗體結(jié)合計算終點滴度。池4的總igg終點滴度顯示ppedv-s誘導(dǎo)高水平的pedv刺突蛋白特異性抗體(圖4)。將所有免疫的動物進(jìn)行血清轉(zhuǎn)化。

從免疫的小鼠分離血清，并且通過肽elisa評估對線性表位具有特異性的結(jié)合igg水平。在圖5中示出來自用25ugppedv-s免疫的5只小鼠的平均數(shù)據(jù)。在刺突蛋白的s2區(qū)域中鑒別了顯性表位區(qū)域。

進(jìn)行ifnγelispot測定，其展示ppedv-s疫苗接種的動物中的穩(wěn)健t細(xì)胞應(yīng)答(圖6和圖7)。從免疫的小鼠分離脾細(xì)胞，并且通過elispot測定評估t細(xì)胞應(yīng)答(圖6和圖7)。t細(xì)胞應(yīng)答在所有肽池中是反應(yīng)性的，但是大多數(shù)應(yīng)答是針對池4和池20。顯性t細(xì)胞表位被鑒別為肽65(kvdtynstvykflav(seqidno:3))(圖7)。

實施例2：本發(fā)明的替代共有pedv-s序列

通過產(chǎn)生pedv-s蛋白的多于64個不同的氨基酸序列的共有序列來產(chǎn)生另外的共有pedv-s氨基酸序列。共有氨基酸序列在seqidno:5中列出。編碼seqidno:5的核酸序列在seqidno:4中列出。

seqidno:2和5可在其n末端另外地連接至前導(dǎo)序列。前導(dǎo)序列可以是天然的,如在seqidno:7中列出且由seqidno:6中列出的核酸序列編碼的氨基酸序列，或可以是ige前導(dǎo)序列，如在seqidno:9中列出且由seqidno:8中列出的核酸序列編碼的氨基酸序列。所有序列id的描述提供于圖8中。

總之，本文描述合成dna共有pedv刺突疫苗的開發(fā)和測試。證明ppedv-s在小鼠中是免疫原性的。在所有免疫的動物中觀察到血清轉(zhuǎn)化和產(chǎn)生ifn-g的t細(xì)胞。鑒別了顯性t細(xì)胞表位以及顯性抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。據(jù)信這是用于引發(fā)體液應(yīng)答和細(xì)胞應(yīng)答兩者的靶向pedv的首例基于共有合成dna的疫苗。在這種非活的平臺中使用合成共有序列可提高疫苗跨各種流行pedv毒株的功效。

應(yīng)理解前述詳述和隨附實施例僅是說明性的，并且不應(yīng)視為對本發(fā)明的范圍的限制，所述范圍僅由隨附權(quán)利要求書和它們的等效物限定。

所公開的實施方案的各種變化和修改對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的?？稍诓槐畴x本發(fā)明的精神和范圍的情況下做出此類變化和修改，包括但不限于與本發(fā)明的化學(xué)結(jié)構(gòu)、取代基、衍生物、中間體、合成、組合物、制劑或使用方法有關(guān)的那些變化和修改。

序列表

<110>賓夕法尼亞大學(xué)理事會(thetrusteesoftheuniversityofpennsylvania)

weiner,david

reuschel,emmal

muthumani,karuppiah

<120>針對豬流行性腹瀉病毒的優(yōu)化的合成共有dna疫苗的免疫原性

<130>206108-0056-00-wo.604992

<150>us62/107,165

<151>2015-01-23

<160>9

<170>patentin3.5版

<210>1

<211>4119

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pedv-s64共有

<400>1

ctgcctcaggatgtcacaagatgctctgctaataccaacttcaggagattctttagcaag60

tttaatgtgcaggcaccagctgtggtcgtgctcggcggatacctgcctatcggggagaat120

cagggcggcgtgaactccacttggtattgcgctggccagcaccctaccgcatctggagtg180

catgggatcttcctgtcacacattcggggagggcatgggttcgagatcggcattagccag240

gagccatttgacccttccgggtaccagctgtatctccacaaggccaccaacggcaataca300

aacgcaactgcccgactgaggatctgccagttccctagcattaagaccctggggcccaca360

gccaacaatgacgtgaccacaggccgcaattgtctgtttaacaaagctattcccgcacac420

atgtccgatggcgagcattctgtcgtgggaatcacttgggacaacgatagggtcaccgtg480

ttctccgacaagatctactatttctactttaaaaacgattggagcagagtggccaccaag540

tgctataattccggcggatgtgctatgcagtacgtctatgagcccacatactatatgctg600

aacgtgacttctgccggcgaagacggaatttcataccagccatgcaccgccaattgtatc660

ggctatgccgctaacgtgttcgctacagagcccaatggccacatcccagaaggattcagc720

tttaacaattggtttctgctctctaacgattcaaccctggtgcatggcaaggtcgtgtcc780

aatcagcccctgctcgtgaactgcctgctcgccatcccaaaaatctacggactggggcag840

ttctttagcttcaaccagaccatcgacggagtctgtaatggagcagcagtgcagcgagca900

ccagaggctctgaggttcaatatcaacgatacaagtgtcattctggctgaaggaagcatc960

gtgctccacactgcactggggaccaacctctcattcgtgtgcagtaatagctccgaccct1020

catctggcaacatttgccatcccactcggcgccactcaggtcccttactattgtttcctg1080

aaggtggatacatacaactccactgtctataaatttctggccgtgctgcccccaaccgtc1140

agggagatcgtgattacaaagtacggcgacgtgtacgtgaacggcttcggatacctgcac1200

ctcggactgctcgatgccgtgaccatcaacttcaccgggcatggcactgacgatgacgtg1260

tccggcttctggaccattgcatctacaaactttgtcgacgccctgatcgaggtgcaggga1320

accgccatccagagaattctgtactgcgatgaccctgtctcacagctcaaatgtagtcag1380

gtggctttcgacctggatgacggcttttatcccatttcttcacggaacctgctcagtcac1440

gagcagcccatcagcttcgtgaccctgccaagcttcaatgatcactcctttgtcaacatc1500

acagtgtcagccagttttgggggccattcaggagccaacctgattgctagtgacactacc1560

atcaatgggttcagtagcttttgcgtggatactagacagttcaccatcagtctgttttac1620

aatgtcaccaactcatacggctatgtgagcaagtcccaggacagcaactgtcccttcaca1680

ctgcagtccgtcaacgattacctctctttctcaaagttctgcgtgagtaccagcctgctc1740

gcttctgcatgtacaatcgacctgttcgggtacccagagtttggctcctcttcaggaggg1800

ggcgtgaagttcacttccctgtatttccagtttaccaagggagagctgatcaccgggaca1860

cctaaacccctcgaaggggtcaccgacgtgagcttcatgacactggacgtgtgcaccaag1920

tacacaatctacggcttcaaaggagaggggatcattactctgaccaacagtagctttctc1980

gccggcgtgtactatacctccgactctggacagctgctcgccttcaagaatgtgacttct2040

ggcgctgtctactcagtgaccccatgtagcttcagcgagcaggctgcatatgtggatgac2100

gatatcgtcggagtgatttcctctctgtcaagtagcacattcaacagcactagggagctg2160

ccagggttcttttaccacagcaatgacggctccaactgcaccgaacctgtcctggtgtac2220

tccaacattggcgtctgtaagagcgggtccatcggctatgtgccttctcagtcaggacag2280

gtcaaaatcgcccctacagtgactgggaatatcagcattcccacaaacttcagtatgagc2340

attagaactgagtacctgcagctctataacacccccgtctctgtggactgcgccacatac2400

gtgtgcaatggcaacagccgatgcaagcagctgctcactcagtataccgccgcttgtaaa2460

accatcgaaagtgctctgcagctcagcgcaaggctggagtccgtcgaagtgaactctatg2520

ctgacaatttcagaggaagcactgcagctcgccactatctcctctttcaatggcgacgga2580

tacaacttcaccaacgtgctgggcgtctccgtgtatgatcccgcctctggaagagtcgtg2640

cagaagcggtccttcatcgaggacctgctgttcaacaaggtcgtgaccaacgggctgggc2700

acagtggacgaagattacaagaggtgctctaacggccgatcagtcgcagacctggtgtgc2760

gctcagtactatagcggggtcatggtgctgccaggagtcgtggatgcagagaaactgcac2820

atgtactccgcctctctgatcggagggatggtgctcggcggattcaccgcagccgctctg2880

cctttttcctacgctgtgcaggcaagactgaactatctggccctccagacagacgtgctg2940

cagcggaatcagcagctgctcgccgagagtttcaatagcgccatcggaaacattaccagt3000

gcttttgagagcgtgaaggaagcaatctcccagacttctaaagggctgaacaccgtcgcc3060

cacgctctcacaaaggtgcaggaagtcgtgaatagccagggagcagccctgacacagctc3120

actgtgcagctgcagcacaacttccaggccatctcaagtagcatcgacgatatctacagc3180

aggctggacattctcagtgctgacgtgcaggtggataggctgatcaccggcagactgtcc3240

gccctcaacgctttcgtcgcacagaccctgacaaagtacacagaggtgcaggcatctcgc3300

aagctggcccagcagaaagtcaacgaatgcgtgaaatcacagagtcagcgatacggattc3360

tgtgggggcgacggggagcacatcttttccctggtgcaggctgcacctcagggactgctc3420

ttcctgcataccgtcctcgtgcccggcgactttgtcgatgtgatcgcaattgccggactg3480

tgcgtgaacgatgagatcgccctgaccctccgagaaccaggactggtgctcttcacacac3540

gagctgcagaatcatactgctaccgaatacttcgtgtcctctcggcgcatgtttgagccc3600

cggaagccaaccgtcagcgacttcgtgcagatcgaatcctgcgtcgtgacttacgtgaac3660

ctgacccgcgaccagctcccagatgtcatccctgactatattgatgtgaacaaaactctg3720

gatgagatcctggcctctctccccaatcgaaccggacctagcctgccactcgacgtgttc3780

aatgcaacatacctgaacctcactggggaaatcgctgatctggagcagcggagcgaatcc3840

ctccgcaacacaactgaggaactgcagtccctcatctacaatattaacaatacactggtc3900

gacctggagtggctgaaccgagtggaaacttatatcaagtggccatggtgggtctggctg3960

atcattttcatcgtgctcatttttgtcgtgtccctgctcgtgttctgctgtatttctacc4020

ggatgctgtgggtgctgtggctgctgtggagcctgcttttcaggatgttgtcgggggcca4080

agactccagccatacgaatttgaaaaggtccacgtccag4119

<210>2

<211>1373

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>pedv-s64共有

<400>2

leuproglnaspvalthrargcysseralaasnthrasnpheargarg

151015

phepheserlyspheasnvalglnalaproalavalvalvalleugly

202530

glytyrleuproileglygluasnglnglyglyvalasnserthrtrp

354045

tyrcysalaglyglnhisprothralaserglyvalhisglyilephe

505560

leuserhisileargglyglyhisglyphegluileglyilesergln

65707580

glupropheaspproserglytyrglnleutyrleuhislysalathr

859095

asnglyasnthrasnalathralaargleuargilecysglnphepro

100105110

serilelysthrleuglyprothralaasnasnaspvalthrthrgly

115120125

argasncysleupheasnlysalaileproalahismetseraspgly

130135140

gluhisservalvalglyilethrtrpaspasnaspargvalthrval

145150155160

pheserasplysiletyrtyrphetyrphelysasnasptrpserarg

165170175

valalathrlyscystyrasnserglyglycysalametglntyrval

180185190

tyrgluprothrtyrtyrmetleuasnvalthrseralaglygluasp

195200205

glyilesertyrglnprocysthralaasncysileglytyralaala

210215220

asnvalphealathrgluproasnglyhisileprogluglypheser

225230235240

pheasnasntrppheleuleuserasnaspserthrleuvalhisgly

245250255

lysvalvalserasnglnproleuleuvalasncysleuleualaile

260265270

prolysiletyrglyleuglyglnphepheserpheasnglnthrile

275280285

aspglyvalcysasnglyalaalavalglnargalaproglualaleu

290295300

argpheasnileasnaspthrservalileleualagluglyserile

305310315320

valleuhisthralaleuglythrasnleuserphevalcysserasn

325330335

serseraspprohisleualathrphealaileproleuglyalathr

340345350

glnvalprotyrtyrcyspheleulysvalaspthrtyrasnserthr

355360365

valtyrlyspheleualavalleuproprothrvalarggluileval

370375380

ilethrlystyrglyaspvaltyrvalasnglypheglytyrleuhis

385390395400

leuglyleuleuaspalavalthrileasnphethrglyhisglythr

405410415

aspaspaspvalserglyphetrpthrilealaserthrasnpheval

420425430

aspalaleuilegluvalglnglythralaileglnargileleutyr

435440445

cysaspaspprovalserglnleulyscysserglnvalalapheasp

450455460

leuaspaspglyphetyrproileserserargasnleuleuserhis

465470475480

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485490495

phevalasnilethrvalseralaserpheglyglyhisserglyala

500505510

asnleuilealaseraspthrthrileasnglypheserserphecys

515520525

valaspthrargglnphethrileserleuphetyrasnvalthrasn

530535540

sertyrglytyrvalserlysserglnaspserasncysprophethr

545550555560

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565570575

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580585590

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595600605

pheglnphethrlysglygluleuilethrglythrprolysproleu

610615620

gluglyvalthraspvalserphemetthrleuaspvalcysthrlys

625630635640

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645650655

serserpheleualaglyvaltyrtyrthrseraspserglyglnleu

660665670

leualaphelysasnvalthrserglyalavaltyrservalthrpro

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cysserphesergluglnalaalatyrvalaspaspaspilevalgly

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valileserserleuserserserthrpheasnserthrarggluleu

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valleuvaltyrserasnileglyvalcyslysserglyserilegly

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tyrvalproserglnserglyglnvallysilealaprothrvalthr

755760765

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valcysasnglyasnserargcyslysglnleuleuthrglntyrthr

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930935940

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prophesertyralavalglnalaargleuasntyrleualaleugln

965970975

thraspvalleuglnargasnglnglnleuleualagluserpheasn

980985990

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99510001005

ileserglnthrserlysglyleuasnthrvalalahisalaleu

101010151020

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serarglysleualaglnglnlysvalasnglucysvallysser

110011051110

glnserglnargtyrglyphecysglyglyaspglygluhisile

111511201125

pheserleuvalglnalaalaproglnglyleuleupheleuhis

113011351140

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ilevalleuilephevalvalserleuleuvalphecyscysile

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1370

<210>3

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>顯性t細(xì)胞表位

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<212>prt

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leuhisthralaleuglythrasnleuserphevalcysserasnser

325330335

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725730735

asnileglyvalcyslysserglyserileglytyrvalprosergln

740745750

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ilegluseralaleuglnleuseralaargleugluservalgluval

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835840845

serserpheasnglyaspglytyrasnphethrasnvalleuglyval

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servaltyraspproalaserglyargvalvalglnlysargserphe

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ilegluaspleuleupheasnlysvalvalthrasnglyleuglythr

885890895

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<223>天然前導(dǎo)

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151015

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151015

hisser