相關(guān)專(zhuān)利申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求提交于2015年2月10日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)no.62/114,349和提交于2015年10月29日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)no.62/247,827的權(quán)益，這兩篇申請(qǐng)全文以引用方式并入本文中。

背景技術(shù)：

樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)被認(rèn)為是有效的抗原呈遞細(xì)胞(apc)，并且是對(duì)感染性疾病和癌癥的保護(hù)性免疫的有效誘導(dǎo)物。這些引發(fā)了對(duì)使用dc作為細(xì)胞疫苗，尤其是分化形成外周血單核細(xì)胞的dc的強(qiáng)烈興趣。然而，使用dc的臨床試驗(yàn)所表現(xiàn)的總體臨床反應(yīng)率非常低，從而強(qiáng)調(diào)了需要改進(jìn)基于dc的疫苗。這些細(xì)胞療法成功的具體限制是可以從單核細(xì)胞產(chǎn)生的dc數(shù)目有限，因?yàn)閐c不能離體擴(kuò)增，從而使得其難以產(chǎn)生大量的這些細(xì)胞來(lái)用于長(zhǎng)期、多重施用方案。此外，dc在冷凍保存后引發(fā)免疫應(yīng)答的能力具有顯著程度的變化性。這些限制變得尤其重要，因?yàn)楦蟮膁c數(shù)量和治療已經(jīng)表現(xiàn)為引發(fā)更強(qiáng)健的抗腫瘤免疫并且改善臨床反應(yīng)。

b細(xì)胞代表大量有效的apc，并且可能是替代dc、可以離體產(chǎn)生用于免疫治療目的的唯一自體同源apc。雖然b細(xì)胞已經(jīng)被描述為誘導(dǎo)t細(xì)胞耐受或甚至阻斷體內(nèi)抗腫瘤免疫應(yīng)答，但是這些報(bào)道僅限于缺乏重要輔助和共刺激分子表達(dá)的靜息b細(xì)胞。另一方面，b細(xì)胞可以由表達(dá)cd40l的細(xì)胞以及細(xì)胞因子或toll樣受體(tlr)配體的組合激活成為有效的apc，然而這些方法并未誘導(dǎo)最佳的b細(xì)胞激活(tlr配體)或需要使用細(xì)胞系(cd40l)，并且這些限制使它們不適用于臨床應(yīng)用。

激活的b細(xì)胞具有增強(qiáng)的mhc和共刺激分子表達(dá)，并且表現(xiàn)出極大改善的抗原呈遞能力以完全激活初始和記憶t細(xì)胞。同樣重要的是，激活的b細(xì)胞可以通過(guò)分泌趨化因子來(lái)募集t細(xì)胞并且遷移到次級(jí)淋巴器官；這是體內(nèi)誘導(dǎo)有效抗腫瘤免疫應(yīng)答的關(guān)鍵要求。因?yàn)閎細(xì)胞可以容易地離體獲得，所以它們代表了用于免疫治療應(yīng)用的自體同源apc的有吸引力的來(lái)源。此外，激活的b細(xì)胞表達(dá)i類(lèi)和ii類(lèi)mhc，因此與廣泛的抗原一起使用。因此，在本領(lǐng)域中需要誘導(dǎo)b細(xì)胞的激活和增殖的實(shí)用方法來(lái)提供靶向多種類(lèi)型的腫瘤和感染性疾病的細(xì)胞疫苗。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本文公開(kāi)了一種用于產(chǎn)生激活的抗原呈遞細(xì)胞(apc)的平臺(tái)，其中該平臺(tái)包括：a)衣原體(chlamydia)屬(包括沙眼衣原體(c.trachomatis)、鸚鵡熱衣原體(c.psittaci)和鼠型衣原體(c.muridarum))，或激活蛋白、肽或其片段；b)b細(xì)胞群；以及c)抗原，其中該抗原不是來(lái)源于衣原體屬(包括沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體和鼠型衣原體)或者不是來(lái)源于蛋白、肽或其片段。

還公開(kāi)了一種用于在受試者中產(chǎn)生激活的、抗原呈遞衣原體激活的b細(xì)胞的方法，該方法包括：a)從受試者獲得b細(xì)胞；b)將來(lái)自步驟a)的b細(xì)胞暴露于衣原體屬(包括沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體和鼠型衣原體)或蛋白、肽或其片段；c)將步驟b)的b細(xì)胞暴露于所需的抗原，其中該抗原不是來(lái)源于衣原體屬(包括沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體和鼠型衣原體)或者不是來(lái)源于激活蛋白、肽或其片段，從而獲得激活的、抗原呈遞衣原體激活的b細(xì)胞(cab)。

還公開(kāi)了一種治療有需要的受試者的方法，該方法包括：a)從受試者獲得b細(xì)胞；b)將來(lái)自步驟a)的b細(xì)胞暴露于衣原體屬(包括沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體和鼠型衣原體)或激活蛋白、肽或其片段；c)將步驟b)的b細(xì)胞暴露于抗原，其中該抗原不是來(lái)源于衣原體屬(包括沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體和鼠型衣原體)或者不是來(lái)源于蛋白、肽或其片段，從而獲得激活的、抗原呈遞衣原體激活的b細(xì)胞(cab)；以及d)用步驟c)的激活的、抗原呈遞衣原體激活的b細(xì)胞治療受試者。

在附圖和下面的描述中闡述了本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的細(xì)節(jié)。本發(fā)明的其他特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將根據(jù)說(shuō)明書(shū)和附圖以及權(quán)利要求書(shū)而變得顯而易見(jiàn)。

附圖說(shuō)明

圖1示出了沙眼衣原體激活小鼠、恒河猴和人b細(xì)胞的示意圖。cab還已經(jīng)在狗和貓中產(chǎn)生。

圖2示出了描繪用于證明cab能夠交叉致敏(cross-prime)可溶性抗原并激活抗原特異性cd8+t細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的示意圖。轉(zhuǎn)基因ot-i小鼠的t細(xì)胞受體(tcr)特異于卵清蛋白(ova)，并且這些細(xì)胞是從脾臟獲取的，標(biāo)記有用于確定細(xì)胞增殖的熒光標(biāo)記物，然后在用負(fù)載有ova的cab治療野生型小鼠的前1天轉(zhuǎn)移到野生型小鼠中。三天后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定ot-i細(xì)胞的增殖。

圖3示出cab能夠以劑量依賴(lài)性方式在體內(nèi)交叉致敏抗原特異性cd8+t細(xì)胞。

圖4示出，在共培養(yǎng)7天后，人cab促進(jìn)人初始cd4+和cd8+t細(xì)胞兩者的穩(wěn)健異源初始t細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞術(shù)用于評(píng)估cab誘導(dǎo)t細(xì)胞增殖的能力。

圖5示出了在指定的時(shí)間點(diǎn)用負(fù)載特異性抗原的cab體內(nèi)治療的恒河猴。然后使用來(lái)自這些動(dòng)物的pbmc來(lái)評(píng)估抗原特異性t細(xì)胞應(yīng)答。cab治療大大增加了t細(xì)胞的干擾素-γ分泌。此外，這些治療沒(méi)有可識(shí)別的不良反應(yīng)。

圖6示出c57bl/6j小鼠用無(wú)負(fù)載的cab(cab)或負(fù)載有b16黑素瘤特異性肽(trp-2和gp100)的cab(即cab-b16)接種。然后用20萬(wàn)個(gè)b16-f10細(xì)胞靜脈內(nèi)刺激小鼠。18天后，計(jì)算肺腫瘤結(jié)節(jié)。左圖示出了可用無(wú)負(fù)載cab或用cab-b16治療的小鼠中肺腫瘤結(jié)節(jié)的數(shù)目；右圖示出了來(lái)自?xún)山M受治療小鼠的代表性結(jié)果。

圖7示出cab引發(fā)具有強(qiáng)健抗腫瘤活性的內(nèi)源性ctl反應(yīng)。在皮下注射e.g7-ova腫瘤之前的ova特異性cab治療可以預(yù)防腫瘤發(fā)展。

圖8示出cab引發(fā)具有強(qiáng)健抗病毒活性的內(nèi)源性ctl反應(yīng)。在致死性眼部hsv-2刺激之前使用負(fù)載有hsv-1的免疫顯性表位(gb498-505)的cab拯救動(dòng)物免受致死性感染。

圖9示出負(fù)載有ova的cab通過(guò)促進(jìn)ctl免疫來(lái)控制早期形成的腫瘤。直到腫瘤注射開(kāi)始5天后，才施用cab治療。如顯示的那樣，抗原特異性cab治療顯著限制了腫瘤發(fā)展，并且當(dāng)用耗減內(nèi)源性cd8t細(xì)胞的抗體處理小鼠時(shí)，這種效應(yīng)被消除。藍(lán)色箭頭指示cab治療。

圖10示出負(fù)載有ova的cab控制早期形成的腫瘤。這伴隨有隨時(shí)間推移的腫瘤生長(zhǎng)結(jié)果，如圖9所示。

圖11示出αgc增強(qiáng)cab的治療效果。cab在注射前負(fù)載αgc以試圖優(yōu)化cab功效。因?yàn)橛胏ab而不是αgc來(lái)治療小鼠，這避免了與體內(nèi)αgc施用相關(guān)的毒性。藍(lán)色箭頭指示cab治療。

圖12示出ova的免疫顯性肽(siinfekl)與cab的交聯(lián)增加了其治療功效的一致性。使用水溶性1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺進(jìn)行零長(zhǎng)交聯(lián)。藍(lán)色箭頭指示cab治療。

圖13示出了將抗原(ova)交聯(lián)至cab的示例。左側(cè)的峰指示經(jīng)歷模擬交聯(lián)的cab，而右側(cè)的峰指示與ova交聯(lián)的cab。用抗ova單克隆抗體進(jìn)行對(duì)cab細(xì)胞表面上的交聯(lián)ova的檢測(cè)。

具體實(shí)施方式

定義

本文中使用的冠詞“一”和“一個(gè)”是指該冠詞的一個(gè)或多于一個(gè)(即，至少一個(gè))語(yǔ)法賓語(yǔ)。例如，“一個(gè)要素”是指一個(gè)要素或多于一個(gè)要素。

當(dāng)關(guān)于可測(cè)量的值(諸如量、持續(xù)時(shí)間等)時(shí)，如本文所用的“約”旨在涵蓋相對(duì)于指定值變化±20％或±10％、更優(yōu)選±0.5％、甚至更優(yōu)選±1％、并且還更優(yōu)選±0.1％，因?yàn)檫@些變化適用于執(zhí)行所公開(kāi)的方法。

術(shù)語(yǔ)“抗原組合物”是指包含刺激免疫系統(tǒng)并引發(fā)宿主或受試者免疫應(yīng)答的材料的組合物。

術(shù)語(yǔ)“引發(fā)免疫應(yīng)答”是指響應(yīng)于刺激物如抗原而在體內(nèi)刺激免疫細(xì)胞。免疫應(yīng)答由細(xì)胞免疫應(yīng)答(例如t細(xì)胞和巨噬細(xì)胞刺激)和體液免疫應(yīng)答(例如b細(xì)胞和補(bǔ)體刺激以及抗體產(chǎn)生)兩者組成?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中公知的技術(shù)來(lái)測(cè)量免疫應(yīng)答，該等技術(shù)包括但不限于抗體免疫測(cè)定、增殖測(cè)定等等。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“疫苗”是指包含如本文所述的重組病毒的組合物，其可用于在受試者中建立對(duì)病毒的免疫。設(shè)想疫苗包含藥學(xué)上可接受的載體和/或佐劑。設(shè)想疫苗是預(yù)防性或治療性的。

“預(yù)防性”治療是對(duì)沒(méi)有表現(xiàn)出疾病病征或僅表現(xiàn)出早期病征的受試者施用的治療，目的是為了降低發(fā)展病變的風(fēng)險(xiǎn)。本文公開(kāi)的疫苗可以作為預(yù)防性治療施用來(lái)降低發(fā)展病變的可能性，或者如果發(fā)展出病變的話(huà)，則使發(fā)展的嚴(yán)重性最小化。

“治療性”治療是對(duì)表現(xiàn)出病變的病征或癥狀的受試者施用的治療，目的是為了減少或消除這些病征或癥狀。病征或癥狀可以是生化、細(xì)胞、組織學(xué)、功能性、主觀或客觀的。

術(shù)語(yǔ)“滅活的”在本文中用于描述微生物，諸如衣原體屬(包括沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體和鼠型衣原體)，其在本領(lǐng)域也被稱(chēng)為“殺死的”或“死亡的”微生物。滅活的細(xì)菌是沒(méi)有感染性的完整細(xì)菌，并且是從“活”細(xì)菌產(chǎn)生的，而不管該細(xì)菌是否已經(jīng)被以任何方式預(yù)先減毒。

多肽的“片段”是指小于全長(zhǎng)多肽或蛋白表達(dá)產(chǎn)物的多肽的任何部分。在一個(gè)方面，片段是全長(zhǎng)多肽的缺失類(lèi)似物，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已經(jīng)被從全長(zhǎng)多肽的氨基末端和/或羧基末端去除。因此，“片段”是下面描述的缺失類(lèi)似物的子集。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”是指能夠特異性結(jié)合抗原上的特異性表位的免疫球蛋白分子?？贵w可以是來(lái)自天然來(lái)源或重組來(lái)源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反應(yīng)性部分。抗體可以由本文所述的疫苗制得，并且可以多種形式存在，包括例如多克隆抗體、單克隆抗體、胞內(nèi)抗體(“細(xì)胞內(nèi)抗體”)、fv、fab和f(ab)2，以及單鏈抗體(scfv)、重鏈抗體(如駱駝抗體、合成抗體、嵌合抗體和人源化抗體)(harlowetal.,1999,usingantibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,ny(harlow等人，1999年，《使用抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約)；harlowetal.,1989,antibodies:alaboratorymanual,coldspringharbor,n.y.(harlow等人，1989年，《抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，冷泉港，紐約)；houstonetal.,1988,proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883(houston等人，1988年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第85卷，第5879-5883頁(yè))；birdetal.,1988,science242:423-426(bird等人，1988年，《科學(xué)》，第242卷，第423-426頁(yè)))。

當(dāng)在生物體、組織、細(xì)胞或其組分的語(yǔ)境中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“異?！笔侵改切┥矬w、組織、細(xì)胞或其組分在至少一種可觀察或可檢測(cè)的特征(例如，年齡、治療、一天中的時(shí)間等)方面與表現(xiàn)出“正?！?預(yù)期)相應(yīng)特征的那些生物體、組織、細(xì)胞或其組分不同。對(duì)于一種細(xì)胞或組織類(lèi)型為正?；蝾A(yù)期的特征對(duì)于不同的細(xì)胞或組織類(lèi)型可能是異常的。

如本文所用，“緩解”疾病是指降低疾病或病癥的至少一種病征或癥狀的頻率或嚴(yán)重程度。

如本文所用的“有效量”是指提供治療或預(yù)防益處的量。

如本文所用，“免疫測(cè)定”是指使用能夠特異性結(jié)合靶分子的抗體來(lái)檢測(cè)和定量靶分子的任何結(jié)合測(cè)定法。

如本文所用，“說(shuō)明性材料”包括可用于傳達(dá)本發(fā)明的化合物、組合物、方法、平臺(tái)或體系在試劑盒中用于實(shí)踐本文所述方法的有效性的出版物、記錄、圖表或任何其他表達(dá)媒介。本發(fā)明的試劑盒的說(shuō)明性材料可以例如被固定在含有本發(fā)明的經(jīng)鑒定的化合物、組合物、平臺(tái)或遞送體系的容器上，或者與含有本發(fā)明的經(jīng)鑒定的化合物、組合物、方法組分、平臺(tái)或體系的容器一起裝運(yùn)。另選地，說(shuō)明性材料可以與容器分開(kāi)裝運(yùn)，意圖是使說(shuō)明性材料和化合物由接收人協(xié)同使用。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“肽”、“多肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用，并且是指由肽鍵共價(jià)連接的氨基酸殘基構(gòu)成的化合物。蛋白質(zhì)或肽必須含有至少兩個(gè)氨基酸，并且對(duì)可以構(gòu)成蛋白質(zhì)或肽序列的氨基酸的最大數(shù)目沒(méi)有限制。多肽包括包含通過(guò)肽鍵彼此接合的兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸的任何肽或蛋白質(zhì)。如本文所用，該術(shù)語(yǔ)是指例如在本領(lǐng)域中通常也被稱(chēng)為肽、低聚肽和低聚體的兩個(gè)短鏈，并且是指在本領(lǐng)域中通常被稱(chēng)為蛋白質(zhì)的兩個(gè)長(zhǎng)鏈，存在許多蛋白質(zhì)類(lèi)型?！岸嚯摹卑ɡ缟锘钚云巍⒒旧贤吹亩嚯?、低聚肽、同源二聚體、異源二聚體、多肽的變體、經(jīng)修飾的多肽、衍生物、類(lèi)似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重組肽、合成肽，或它們的組合。

“疾病”是動(dòng)物的一種健康狀態(tài)，其中動(dòng)物不能維持體內(nèi)平衡，并且其中如果疾病沒(méi)有得到改善，則動(dòng)物的健康繼續(xù)惡化。相比之下，動(dòng)物的“病癥”是一種健康狀態(tài)，其中動(dòng)物能夠維持體內(nèi)平衡，但是其中動(dòng)物的健康狀態(tài)比不存在該病癥時(shí)更不利。如果保持不治療的話(huà)，病癥不一定會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物健康狀態(tài)的進(jìn)一步下降。

術(shù)語(yǔ)“受試者”是指作為給藥或治療的靶的任何個(gè)體。受試者可以是脊椎動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物。因此，受試者可以是人或獸醫(yī)的患者。術(shù)語(yǔ)“患者”是指處于臨床醫(yī)生(例如醫(yī)師)治療下的受試者。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“治療”或“治療方案”是指被用于緩解或改變病癥或疾病狀態(tài)的那些活動(dòng)，例如旨在使用藥理、外科手術(shù)、飲食和/或其他技術(shù)來(lái)減少或消除疾病或病癥的至少一種病征或癥狀的療程。治療方案可以包括規(guī)定劑量的一種或多種藥物或外科手術(shù)。治療通常將是有益的，并且減少或消除病癥或疾病狀態(tài)的至少一種病征或癥狀，但在某些情況下，治療療效將具有不期望的效應(yīng)或副作用。治療療效還將受到受試者的生理狀態(tài)的影響，例如年齡、性別、遺傳、體重、其他病癥等。

術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指由研究人員、獸醫(yī)、醫(yī)師或其他臨床醫(yī)生所尋求的將引起組織、系統(tǒng)或受試者的生物或醫(yī)學(xué)反應(yīng)的主題化合物的量。術(shù)語(yǔ)“治療有效量”包括當(dāng)施用時(shí)足以防止所治療的病癥或疾病的一種或多種病征或癥狀的發(fā)展或緩解該等病征或癥狀至某種程度的化合物的量。治療有效量將根據(jù)化合物、待治療的受試者的疾病及其嚴(yán)重程度以及年齡、體重等而變化。

“治療”作為本文所用的術(shù)語(yǔ)的疾病是指減少受試者所經(jīng)歷的疾病或病癥的至少一種病征或癥狀的頻率或嚴(yán)重性。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”還指代單獨(dú)的細(xì)胞、細(xì)胞系、原代培養(yǎng)物，或來(lái)源于此類(lèi)細(xì)胞的培養(yǎng)物，除非特別指出?！芭囵B(yǎng)物”是指包含相同或不同類(lèi)型的分離細(xì)胞的組合物。細(xì)胞系是特定類(lèi)型的細(xì)胞的培養(yǎng)物，其可以無(wú)限增殖，從而使細(xì)胞系“永生”。細(xì)胞培養(yǎng)物可以是在培養(yǎng)基如瓊脂上生長(zhǎng)的細(xì)胞群。原代細(xì)胞培養(yǎng)物是來(lái)自細(xì)胞或直接從活生物體中取得的培養(yǎng)物，其不是永生化的。

術(shù)語(yǔ)“生物樣品”是指來(lái)自受試者的組織(例如組織活檢)、器官、細(xì)胞(包括培養(yǎng)物中所維持的細(xì)胞)、細(xì)胞裂解液(或裂解液級(jí)分)、來(lái)源于細(xì)胞或細(xì)胞物質(zhì)的生物分子(例如多肽或核酸)，或體液。體液的非限制性示例包括血液、尿液、血漿、血清、眼淚、淋巴液、膽汁、腦脊液、間質(zhì)液、眼房水或玻璃體液、初乳、痰、羊水、唾液、肛門(mén)和陰道分泌物、汗水、精液、滲出液、分泌液和滑液。

以單數(shù)或復(fù)數(shù)形式使用的術(shù)語(yǔ)“腫瘤細(xì)胞”或“癌細(xì)胞”是指經(jīng)歷惡性轉(zhuǎn)化而使其對(duì)宿主生物體具有病理作用的細(xì)胞。原代癌細(xì)胞(即，從惡性轉(zhuǎn)化部位附近獲得的細(xì)胞)可以通過(guò)完善的技術(shù)，特別是組織學(xué)檢查，而容易地與非癌細(xì)胞區(qū)分。如本文所用的癌細(xì)胞的定義不僅包括原代癌細(xì)胞，而且還包括來(lái)源于癌細(xì)胞的祖細(xì)胞的任何細(xì)胞。這種細(xì)胞包括轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞，以及來(lái)源于癌細(xì)胞的體外培養(yǎng)物和細(xì)胞系。術(shù)語(yǔ)“腫瘤相關(guān)抗原”或“taa”在本文中用于指代由腫瘤細(xì)胞以較高頻率或密度表達(dá)，而不是由相同組織類(lèi)型的非腫瘤細(xì)胞表達(dá)的分子或絡(luò)合物。腫瘤相關(guān)抗原可以是宿主不正常表達(dá)的抗原；它們可以是宿主正常表達(dá)的分子的突變、截短、錯(cuò)誤折疊或以其他方式異常的表現(xiàn)形式；它們可以與正常表達(dá)的分子相同但以異常高的水平表達(dá)；或者它們可以在異常的背景或周?chē)h(huán)境中表達(dá)。腫瘤相關(guān)抗原可以是例如蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段、絡(luò)合碳水化合物、神經(jīng)節(jié)苷脂、半抗原、核酸，或這些或其他生物分子的任何組合。了解特定腫瘤相關(guān)抗原的存在或特征對(duì)于實(shí)踐本發(fā)明是不必要的。

術(shù)語(yǔ)“b細(xì)胞”是指b淋巴細(xì)胞。b細(xì)胞前體駐留于產(chǎn)生未成熟b細(xì)胞的骨髓中。b細(xì)胞發(fā)育的發(fā)生經(jīng)歷若干階段，每個(gè)階段代表抗體基因座處的基因組內(nèi)容物的變化。在基因組重鏈可變區(qū)中，存在三個(gè)片段v、d和j，其在被稱(chēng)為vdj重排的過(guò)程中隨機(jī)重組，以在每個(gè)b細(xì)胞的免疫球蛋白中產(chǎn)生獨(dú)特的可變區(qū)。輕鏈可變區(qū)域存在類(lèi)似的重排，不同的是僅涉及兩個(gè)片段v和j。完全重排后，b細(xì)胞達(dá)到骨髓中的igm+未成熟階段。這些未成熟b細(xì)胞在其表面上呈遞膜結(jié)合的igm，即bcr，并遷移到脾臟，在脾臟中它們被稱(chēng)為移行性b細(xì)胞。這些細(xì)胞中的一些分化成成熟的b淋巴細(xì)胞。在其表面上表達(dá)bcr的成熟b細(xì)胞使血液和淋巴系統(tǒng)循環(huán)，從而起到免疫監(jiān)視的作用。它們?cè)谕耆患せ钪安划a(chǎn)生可溶性抗體。每個(gè)b細(xì)胞具有將與一種特定抗原結(jié)合的獨(dú)特受體蛋白。一旦b細(xì)胞遇到其抗原并從輔助型t細(xì)胞接收附加信號(hào)，其可以進(jìn)一步分化成表達(dá)和分泌可溶性抗體的漿b細(xì)胞，或記憶b細(xì)胞。

術(shù)語(yǔ)“b細(xì)胞”還可以指在其表面上呈遞完全重排的，即成熟的b細(xì)胞受體(bcr)的任何b淋巴細(xì)胞。例如，b細(xì)胞可以是未成熟的或成熟的b細(xì)胞，并且優(yōu)選是初始b細(xì)胞，即尚未暴露于由所述b細(xì)胞表面上的bcr特異性識(shí)別的抗原的b細(xì)胞。b細(xì)胞可以是記憶b細(xì)胞，優(yōu)選為igg+記憶b細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“b細(xì)胞”也可以是指b細(xì)胞的混合物。b細(xì)胞的混合物可以指混合物中的b細(xì)胞具有不同的抗原特異性，即產(chǎn)生識(shí)別多種抗原的抗體或完全重排的bcr。單個(gè)b細(xì)胞的抗體或bcr通常是相同的，抗原特異性也是相同的。

術(shù)語(yǔ)“分泌抗體的b細(xì)胞”優(yōu)選是指漿b細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“在其表面上攜帶bcr的b細(xì)胞”優(yōu)選是指在其質(zhì)膜上表達(dá)bcr，優(yōu)選完全重排的bcr的b細(xì)胞。在本文中，“bcr”優(yōu)選不指代單個(gè)bcr，而是優(yōu)選指代具有相同抗原決定簇的多個(gè)bcr。

術(shù)語(yǔ)“部分”是指片段。部分優(yōu)選是指整個(gè)實(shí)體的至少20％、至少30％、優(yōu)選至少40％、優(yōu)選至少50％、更優(yōu)選至少60％、更優(yōu)選至少70％，甚至更優(yōu)選至少80％，并且最優(yōu)選至少90％。術(shù)語(yǔ)“主要部分”優(yōu)選是指整個(gè)實(shí)體的至少50％、更優(yōu)選至少60％、更優(yōu)選至少70％、甚至更優(yōu)選至少80％、甚至更優(yōu)選至少90％、甚至更優(yōu)選至少95％，并且最優(yōu)選至少99％。

術(shù)語(yǔ)“克隆擴(kuò)增”是指其中將特定實(shí)體倍增的過(guò)程。在本發(fā)明的上下文中，該術(shù)語(yǔ)優(yōu)選用于免疫學(xué)應(yīng)答的情境中，其中淋巴細(xì)胞，優(yōu)選b淋巴細(xì)胞被抗原刺激、增殖，并且識(shí)別所述抗原的特異性淋巴細(xì)胞被擴(kuò)增。優(yōu)選地，克隆擴(kuò)增導(dǎo)致淋巴細(xì)胞的分化，優(yōu)選地分化成產(chǎn)生和分泌抗體的淋巴細(xì)胞。分泌抗體的b淋巴細(xì)胞是例如漿b細(xì)胞。

術(shù)語(yǔ)“抗原”涉及包含免疫應(yīng)答產(chǎn)生所針對(duì)的表位的試劑。術(shù)語(yǔ)“抗原”具體包括蛋白質(zhì)、肽、多糖、脂質(zhì)、核酸，特別是rna和dna以及核苷酸。術(shù)語(yǔ)“抗原”還包括衍生抗原和綴合抗原，該衍生抗原作為次生物質(zhì)，其僅通過(guò)轉(zhuǎn)化變得具有抗原性和敏化(例如，分子中間體，通過(guò)使用體蛋白完成)，該綴合抗原通過(guò)人工摻入原子團(tuán)(例如，異氰酸鹽、重氮鹽)而顯示出新的組成特異性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗原是腫瘤抗原，即可以來(lái)源于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞表面和細(xì)胞核的癌細(xì)胞組分，特別是優(yōu)選大量產(chǎn)生、在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生或作為腫瘤細(xì)胞上的表面抗原的那些抗原。示例是癌胚抗原、1-胎蛋白、異鐵蛋白和胚胎硫糖蛋白、a2-h-鐵蛋白和γ-胎蛋白以及各種病毒腫瘤抗原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原是病毒抗原，諸如病毒核糖核蛋白或包膜蛋白。具體地，抗原或其肽應(yīng)當(dāng)是可由b細(xì)胞受體或免疫球蛋白分子如抗體識(shí)別的。優(yōu)選地，如果抗原由b細(xì)胞受體識(shí)別，則該抗原能夠在適當(dāng)?shù)墓泊碳ば盘?hào)存在下誘導(dǎo)，攜帶特異性識(shí)別該抗原的bcr的b細(xì)胞的克隆擴(kuò)增和這種b細(xì)胞分化成分泌抗體的b細(xì)胞?？乖梢源嬖谟谥貜?fù)組織中，即抗原包含多于一個(gè)，優(yōu)選至少2個(gè)、至少3個(gè)、至少4個(gè)、至多6個(gè)、10個(gè)、12個(gè)或更多個(gè)免疫應(yīng)答產(chǎn)生所針對(duì)或抗體制備所針對(duì)的物質(zhì)或表位。這種重復(fù)抗原優(yōu)選能夠結(jié)合多于一種具有相同特異性的抗體。換句話(huà)說(shuō)，這種重復(fù)抗原包含多于一個(gè)表位，優(yōu)選為相同的表位，因此能夠“交聯(lián)”針對(duì)所述表位的抗體。多于一個(gè)的物質(zhì)或表位可以共價(jià)或非共價(jià)連接，其中共價(jià)連接可為通過(guò)任何化學(xué)團(tuán)化(chemicalgrouping)的，諸如通過(guò)肽鍵?？乖梢允前乖闹貜?fù)或包含具有共同表位的不同抗原肽的融合分子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原肽通過(guò)肽接頭連接。

范圍：在整個(gè)本公開(kāi)中，本發(fā)明的各個(gè)方面可以范圍格式呈現(xiàn)。應(yīng)當(dāng)理解，以范圍格式描述僅僅是為了方便和簡(jiǎn)潔，并且不應(yīng)被解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的僵化限制。因此，對(duì)范圍的描述應(yīng)視為已經(jīng)具體公開(kāi)了所有可能的子范圍以及該范圍內(nèi)的各個(gè)單獨(dú)數(shù)值。例如，對(duì)從1至6的范圍的描述應(yīng)被認(rèn)為已經(jīng)具體公開(kāi)了子范圍如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及該范圍內(nèi)的單獨(dú)數(shù)目，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。無(wú)論范圍的寬度如何，這都適用。

根據(jù)本文教導(dǎo)的方法，向受試者施用有效量的藥劑。術(shù)語(yǔ)有效量和有效劑量可互換使用。術(shù)語(yǔ)有效量被定義為產(chǎn)生所期望的生理反應(yīng)所需的任何量。施用藥劑的有效量和計(jì)劃可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定，并且進(jìn)行這種確定在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。施用的劑量范圍是大到足以產(chǎn)生其中疾病或病癥的一種或多種癥狀受影響(例如減少或延緩)的期望效果的那些劑量范圍。劑量不應(yīng)大到引起相當(dāng)不利的副作用，例如不希望的交叉反應(yīng)、過(guò)敏反應(yīng)等。通常，劑量將隨著年齡、狀況、性別、疾病類(lèi)型、疾病或病癥的程度、給藥途徑，或其他藥物是否包括在該方案中而變化，并且可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員確定。在任何禁忌癥情況下，劑量可以由個(gè)別醫(yī)生調(diào)整。劑量可以變化，并且可以每日一個(gè)或多個(gè)劑量給藥，達(dá)一天或若干天。在文獻(xiàn)中可以找到關(guān)于給定類(lèi)別的藥學(xué)產(chǎn)品的適當(dāng)劑量的指導(dǎo)。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)治療是指減少疾病或病癥或該疾病或病癥的癥狀的影響的方法。因此，在所公開(kāi)的方法中，治療可以指使所確定的疾病或病癥的嚴(yán)重程度或該疾病或病癥的癥狀減少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。例如，如果與對(duì)照相比，受試者的疾病的一種或多種癥狀減少10％，則治療疾病的方法被視為治療。因此減少可以是與天然或?qū)φ账较啾龋?0％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的減少，或者在10％與100％之間的任何減少百分比。應(yīng)當(dāng)理解，治療并不一定指治愈或完全消除疾病、病癥或該疾病或病癥的癥狀。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)預(yù)防疾病或病癥是指在受試者開(kāi)始表現(xiàn)出疾病或病癥的一或多種癥狀之前或大致同時(shí)發(fā)生的例如施用治療劑的動(dòng)作，該動(dòng)作抑制或延緩該疾病或病癥的一或多種癥狀的發(fā)作或加重。如本文所用，提及降低、減少或抑制包括與對(duì)照水平相比，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的變化。此類(lèi)術(shù)語(yǔ)可以包括但不一定包括完全消除。

綜述

本文公開(kāi)了一種新穎的平臺(tái)，該平臺(tái)用于快速且容易地產(chǎn)生大量激活的抗原呈遞細(xì)胞(apc)，諸如激活的b細(xì)胞，以用作誘導(dǎo)和增強(qiáng)對(duì)腫瘤和病原體的免疫應(yīng)答的細(xì)胞疫苗。重要的是，這些細(xì)胞的功能不受長(zhǎng)期冷藏的影響。使用此平臺(tái)，從外周血或次級(jí)淋巴器官獲得的動(dòng)物(例如，小鼠、貓、狗和恒河猴)和人b細(xì)胞可以被在體外激活和擴(kuò)增，以供使用各種給藥方案輸注到原始供體內(nèi)。b細(xì)胞可以獲自并用于相同的個(gè)體(自體)，或者b細(xì)胞可以獲自一個(gè)個(gè)體而用于另一個(gè)體(異源)。這些細(xì)胞可以通過(guò)在滅活的沙眼衣原體原體(elementarybody)或溶胞產(chǎn)物的存在下培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞或全淋巴器官細(xì)胞制備物而被體外激活，從而誘導(dǎo)其激活和增殖，該激活和增殖通過(guò)附加因子如細(xì)胞因子進(jìn)一步增強(qiáng)。激活的b細(xì)胞的數(shù)目可以相較于b細(xì)胞的初始數(shù)目擴(kuò)增許多倍。例如，激活的b細(xì)胞的數(shù)目可以擴(kuò)增為與對(duì)照相比時(shí)2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20倍或更多倍。本文中顯示，這些細(xì)胞是能夠處理外來(lái)蛋白質(zhì)抗原、呈遞免疫原性肽且刺激異源、初始的cd4+和cd8+t細(xì)胞以及初始和記憶性抗原特異性cd8+t細(xì)胞的有效apc。另外，抗原可以通過(guò)交聯(lián)到cab來(lái)負(fù)載，以增強(qiáng)其治療能力。

擴(kuò)增可用于負(fù)載已識(shí)別抗原的有效apc的數(shù)目使得產(chǎn)生自體細(xì)胞疫苗的過(guò)程更有效，因?yàn)檫@些激活的b細(xì)胞的體內(nèi)施用引發(fā)了強(qiáng)健的cd8+t細(xì)胞應(yīng)答，能夠抵抗腫瘤并控制病毒感染。因此，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了用于免疫治療腫瘤和感染性疾病的細(xì)胞疫苗平臺(tái)。相較于其他目前可用的細(xì)胞疫苗選項(xiàng)，該平臺(tái)和相關(guān)方法侵入性更小、成本更低且勞動(dòng)密集性更小。

沙眼衣原體具有誘導(dǎo)選擇性多克隆激活靜息b細(xì)胞的獨(dú)特能力，易于從外周血或次級(jí)淋巴器官(例如淋巴結(jié))以及各種哺乳動(dòng)物(小鼠、貓、狗、恒河猴和人)獲得。滅活的沙眼衣原體原體(eb)或其溶胞產(chǎn)物能夠激活從外周血或次級(jí)淋巴器官獲得的靜息b細(xì)胞并誘導(dǎo)其增殖。這允許它們的數(shù)目被擴(kuò)增顯著的量，該擴(kuò)增通過(guò)附加因子如細(xì)胞因子而進(jìn)一步增強(qiáng)。這使得它們的后續(xù)免疫磁性選擇相當(dāng)有效。這些沙眼衣原體激活的b細(xì)胞(cab)表達(dá)高水平的共刺激分子，并且能夠獲得可溶性蛋白質(zhì)且比靜息b細(xì)胞更有效地處理可溶性蛋白質(zhì)。這些必需條件允許生成的cab能夠?qū)⒖乖蔬f至t細(xì)胞。所產(chǎn)生的cab可以用于使用各種施用方案進(jìn)行自體或異源輸注，這是由于平臺(tái)具有產(chǎn)生大量apc的能力以及cab具有能經(jīng)受冷凍保存且仍然保持其作為apc的全部功能的適應(yīng)性。

還公開(kāi)了使用cab誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤和細(xì)胞內(nèi)病原體的抗原特異性t細(xì)胞以供用于主動(dòng)或被動(dòng)免疫治療、免疫監(jiān)視和研究目的。更具體地，本文公開(kāi)了具有執(zhí)行作為有效apc的功能的能力，能夠處理外來(lái)蛋白質(zhì)抗原、呈遞免疫原性肽并刺激異源、初始的cd4+和cd8+t細(xì)胞以及初始和記憶性抗原特異性cd8+t細(xì)胞的人、鼠和恒河猴cab。這些性質(zhì)允許cab引發(fā)體內(nèi)t細(xì)胞應(yīng)答，包括治療癌癥所需的那些體內(nèi)t細(xì)胞應(yīng)答。

在本文公開(kāi)的條件下產(chǎn)生的cab(諸如在實(shí)施例1中描述的那些)可以通過(guò)本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的各種技術(shù)與任何所需抗原或抗原組合、以及免疫原性肽進(jìn)行組合。cab可以例如靜脈內(nèi)地施用于受試者。t細(xì)胞增殖和激活的量級(jí)取決于待施用的apc的數(shù)目。由于通過(guò)本文所公開(kāi)的方法可獲得大量細(xì)胞，通過(guò)重復(fù)施用大量cab而誘導(dǎo)的t細(xì)胞應(yīng)答大于目前可用的dc制備物誘導(dǎo)的t細(xì)胞應(yīng)答，這是由于目前可用的dc制備物數(shù)量有限。例如，本文所公開(kāi)的cab可以用同源腫瘤抗原或腫瘤特異性肽進(jìn)行致敏，并誘導(dǎo)腫瘤特異性cd8+t細(xì)胞應(yīng)答，能夠在鼠模型中抵抗相應(yīng)的腫瘤攻擊。

作為所公開(kāi)的激活b細(xì)胞的方法的結(jié)果，cab可以廣泛的方法用于向t細(xì)胞呈遞期望的抗原，諸如腫瘤相關(guān)抗原。人cab是非常有效的apc，并且刺激人異源的初始cd4+和cd8+t細(xì)胞。它們還可以在動(dòng)物和人中引發(fā)特異于病毒和腫瘤抗原的自體初始和記憶t細(xì)胞。此外，在小鼠中，這些t細(xì)胞應(yīng)答能夠拯救免受致死性病毒感染并消退形成的腫瘤。

沙眼衣原體激活的b細(xì)胞平臺(tái)

本文公開(kāi)了一種用于產(chǎn)生激活的apc的平臺(tái)，其中該平臺(tái)包含：沙眼衣原體，或激活蛋白、肽或其片段；b細(xì)胞群；以及抗原。在一個(gè)示例中，抗原呈遞細(xì)胞的抗原不是來(lái)源于衣原體屬(包括沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體和鼠型衣原體)或蛋白、肽或其片段。還公開(kāi)了通過(guò)本文所公開(kāi)的方法制備的衣原體激活的b細(xì)胞(cab)。

本文使用的原始b細(xì)胞可以從許多來(lái)源獲得，包括外周血單核細(xì)胞、骨髓、淋巴結(jié)組織、臍帶血、來(lái)自感染部位的組織、脾組織以及腫瘤。本領(lǐng)域中可獲得的任何數(shù)量的b細(xì)胞系可以與本文所公開(kāi)的平臺(tái)和方法一起使用。在本文描述的方法的某些實(shí)施方案中，可以使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何數(shù)量的技術(shù)由從受試者收集的單位血液獲得b細(xì)胞，所述技術(shù)為諸如ficoll^tm(蔗糖和表氯醇的共聚物，可用于制備高密度溶液)分離。

在本文所公開(kāi)的平臺(tái)和方法中使用的衣原體屬(包括沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體和鼠型衣原體)可以是活的、滅活的，或者可以是來(lái)自衣原體屬(包括沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體和鼠型衣原體)的蛋白質(zhì)或片段。

衣原體屬可以是已知物種的變體，并且仍然保持賦予本文公開(kāi)的效應(yīng)的功能。例如，可以使用整個(gè)細(xì)菌。活細(xì)菌不會(huì)感染白細(xì)胞，并且不能在含抗生素的培養(yǎng)基中存活。另選地，可以使用滅活的完整細(xì)菌(經(jīng)x射線(xiàn)或γ射線(xiàn)照射)，或從完整細(xì)菌產(chǎn)生的溶胞產(chǎn)物。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用已被鑒定為能夠激活cab的特異性蛋白或其片段。所謂“激活”蛋白、肽或其片段是指蛋白、肽或其片段能夠產(chǎn)生激活的抗原呈遞細(xì)胞(apc)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地鑒定衣原體的哪些蛋白、肽或片段能夠產(chǎn)生期望的結(jié)果。

可以介導(dǎo)對(duì)b細(xì)胞的效應(yīng)的此類(lèi)組分的示例包括但不限于主要外膜蛋白(momp)；沙眼衣原體多形膜蛋白(例如，pmpa、pmpb、pmpc、pmpd、pmpe、pmpf、pmpg、pmph、pmpi)；與死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)的衣原體蛋白(cadd)；衣原體蛋白酶樣活性因子(cpaf)；主要外膜蛋白和富含半胱氨酸的蛋白(例如，omca和omcb)；沙眼衣原體70-kda熱休克蛋白；puld/yscc；porb；ctl0887；ctl0541；oprb；omp85；ctl0645；pal；ef-tu/tufa；groel；copd；dnak/hsp70；ctl0255；hc1；ctl0850；以及rpob。還公開(kāi)了如可見(jiàn)于heinzetal.(comprehensiveinsilicopredictionandanalysisofchlamydialoutermembraneproteinsreflectsevolutionandlifestyleofthechlamydiae.bmcgenomics.2009dec29；10:634)(heinz等人，(“對(duì)衣原體主外膜蛋白進(jìn)行的計(jì)算機(jī)模擬綜合預(yù)測(cè)和分析反映了衣原體的進(jìn)化和生活方式”，《bmc基因組學(xué)》，2009年12月29日；第10卷，第634頁(yè)))的衣原體組分，該文獻(xiàn)由于其對(duì)衣原體蛋白的論述而全文以引用方式并入本文。

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，可以使用沙眼衣原體主要外膜蛋白(momp)或其片段。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地確定衣原體的哪個(gè)片段、蛋白或變體可以用來(lái)賦予期望的效應(yīng)。

可以使用來(lái)自任何疾病、病癥或病況的任何抗原。示例性抗原包括但不限于細(xì)菌、病毒、寄生生物、過(guò)敏原、自身抗原以及腫瘤相關(guān)抗原。如果使用基于dna的疫苗，抗原通常將由所施用的dna構(gòu)建體的序列進(jìn)行編碼。另選地，如果抗原作為綴合物施用，則抗原通常將是包含在施用的綴合物中的蛋白質(zhì)。具體地，抗原可以包括蛋白質(zhì)抗原、肽、完全滅活的生物體等。

可以使用的抗原的具體示例包括但不限于來(lái)自以下的抗原：甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎或丁型肝炎、流感病毒、李斯特菌(listeria)、肉毒桿菌(clostridiumbotulinum)、肺結(jié)核、兔熱病、重型天花(variolamajor)(痘瘡)、病毒性出血熱、鼠疫耶爾森菌(yersiniapestis)(瘟疫)、hiv、皰疹、乳頭瘤病毒，以及與傳染劑相關(guān)的其他抗原。其他抗原包括與自身免疫病癥、炎性病癥、過(guò)敏反應(yīng)、哮喘和移植排斥有關(guān)的抗原。負(fù)載抗原的cab可單獨(dú)或與其他治療劑如cd40激動(dòng)劑或特別是tlr、cd40抗體一起施用，以用作治療或預(yù)防性疫苗來(lái)治療病癥或抑制免疫。在另一個(gè)示例中，本文所公開(kāi)的cab平臺(tái)可以與檢查點(diǎn)抑制劑結(jié)合使用。檢查點(diǎn)抑制劑技術(shù)的示例可見(jiàn)于wo1999015157a2、wo2015016718a1和wo2010149394a1中，該等專(zhuān)利因它們中涉及檢查點(diǎn)抑制劑的公開(kāi)內(nèi)容而全文以引用方式并入本文。本文還討論了其他組合治療。

在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原可以包括腫瘤相關(guān)抗原。能夠治療的腫瘤的示例包括以下項(xiàng)：胰腺腫瘤，諸如胰腺導(dǎo)管腺癌；肺腫瘤，諸如小細(xì)胞和大細(xì)胞腺癌、鱗狀細(xì)胞癌以及支氣管肺泡癌；結(jié)腸腫瘤，諸如上皮腺癌及其轉(zhuǎn)移瘤；以及肝腫瘤，諸如肝癌和膽管癌。還包括乳腺腫瘤，諸如導(dǎo)管和小葉腺癌；婦科腫瘤，諸如宮頸鱗腺癌和宮頸腺癌，以及子宮和卵巢上皮腺癌；前列腺腫瘤，諸如前列腺腺癌；膀胱腫瘤，諸如過(guò)渡性鱗狀細(xì)胞癌；res系統(tǒng)腫瘤，諸如結(jié)節(jié)性或彌漫性b或t細(xì)胞淋巴瘤、漿細(xì)胞瘤、以及急性或慢性白血病；皮膚腫瘤，諸如惡性黑色素瘤；以及軟組織腫瘤，諸如軟組織肉瘤和平滑肌肉瘤。尤其受關(guān)注的是腦腫瘤，諸如星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、室管膜瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤，以及原始神經(jīng)外胚層腫瘤。此類(lèi)別中包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和膠質(zhì)肉瘤(gliosarcomas)。

具體地，以下抗原與以下類(lèi)型的癌癥有關(guān)，并且可用于表1中所公開(kāi)的平臺(tái)和方法：

表1：癌癥和相關(guān)抗原

個(gè)體的免疫狀態(tài)可以是以下項(xiàng)中的任何一種：個(gè)體可以是對(duì)該組合物中存在的某些腫瘤相關(guān)抗原首次進(jìn)行免疫的(immunologically)，在這種情況下可以施用組合物以引發(fā)或促進(jìn)抗腫瘤應(yīng)答的成熟。個(gè)體可以目前未表現(xiàn)出抗腫瘤免疫，但可以具有免疫記憶，特別是與疫苗中包含的腫瘤相關(guān)抗原有關(guān)的t細(xì)胞記憶，在這種情況下可以施用組合物以刺激記憶反應(yīng)。個(gè)體也可以對(duì)疫苗中包含的腫瘤相關(guān)抗原具有主動(dòng)免疫(體液或細(xì)胞免疫，或兩者)，在這種情況下，可以施用組合物以維持反應(yīng)、促進(jìn)反應(yīng)或使反應(yīng)成熟，或募集免疫系統(tǒng)的其他武器。受試者應(yīng)當(dāng)是至少部分免疫活性的，以便疫苗可以誘導(dǎo)內(nèi)源性t細(xì)胞應(yīng)答。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原可以包括傳染劑?？梢允褂帽疚乃_(kāi)的平臺(tái)和方法治療的傳染劑的示例包括但不限于流感病毒、呼吸道合胞體病毒(rsv)、人乳頭瘤病毒(hpv)、乙型肝炎病毒(hbv)、丙型肝炎病毒(hcv)、人t淋巴細(xì)胞病毒1型、人免疫缺陷病毒1型(hiv)、人類(lèi)皰疹病毒4型(ebv)、巨細(xì)胞病毒以及其他皰疹病毒。其他示例包括單核細(xì)胞增多性李斯特菌(listeriamonocytogenes)、沙門(mén)氏菌屬(salmonella)、肺結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)、瘧原蟲(chóng)屬(plasmodiumsp.)(瘧疾)、剛地弓形蟲(chóng)(toxoplasmagondii)，以及克氏錐蟲(chóng)(trypanosomacruzi)。具體地，已經(jīng)表明，cab可用于賦予小鼠免疫性并保護(hù)它們免受hsv-2(皰疹病毒)的眼部感染，該感染在小鼠中是致死感染。

本文所公開(kāi)的各cab可以同時(shí)或順序地暴露或交聯(lián)至多于一種抗原。例如，本文公開(kāi)的cab可以同時(shí)或順序地暴露于2種、3種、4種、5種、6種或更多種抗原，或者負(fù)載有不同單一抗原的各cab可以一起組合以進(jìn)行施用。

與未暴露于衣原體屬(包括沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體和鼠型衣原體)或蛋白或其片段的b細(xì)胞群相比，本文所公開(kāi)的cab可以顯著擴(kuò)增。如本文所用，b細(xì)胞的擴(kuò)增包括刺激細(xì)胞增殖以及預(yù)防細(xì)胞的凋亡或其他死亡。如本文所用，“培養(yǎng)”和“溫育”用于表明使用合適的添加劑(飼養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞因子、激動(dòng)劑、其他刺激分子或媒介(其可以包括緩沖液、鹽、糖、血清或各種其他組分))將細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中維持一段時(shí)間。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，培養(yǎng)或溫育時(shí)間可以變化，以允許適當(dāng)擴(kuò)增，從而調(diào)整個(gè)體子集的不同細(xì)胞密度或頻率，并允許研究者在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間使用細(xì)胞。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以憑經(jīng)驗(yàn)確定精確的培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)。

與無(wú)活性或靜息b細(xì)胞相比，cab可以具有更高的主要組織相容性復(fù)合物(mhc)和/或共刺激分子表達(dá)水平。例如，相較于無(wú)活性b細(xì)胞或未暴露于衣原體屬(包括沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體和鼠型衣原體)或蛋白或其片段的b細(xì)胞，cab可以具有高1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、50％、60％、70％、90％、100％的mhc和/或共刺激分子表達(dá)水平。相較于無(wú)活性b細(xì)胞或未暴露于衣原體屬(包括沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體和鼠型衣原體)或蛋白或其片段的b細(xì)胞，cab可以具有2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍或更多倍的mhc和共刺激分子表達(dá)水平。

與無(wú)活性b細(xì)胞相比，cab可以具有提高的呈遞抗原和激活t細(xì)胞的能力。所謂“提高的能力”是指相較于未暴露于衣原體屬(包括沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體和鼠型衣原體)或蛋白或其片段的細(xì)胞群，cab具有高1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、50％、60％、70％、90％或100％的呈遞抗原和激活t細(xì)胞的能力。相較于未暴露于衣原體屬(包括沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體和鼠型衣原體)或蛋白或其片段的細(xì)胞群，cab可以具有2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍或更多倍的呈遞抗原和激活t細(xì)胞的能力。

與無(wú)活性b細(xì)胞或未暴露于衣原體屬(包括沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體和鼠型衣原體)或蛋白或其片段的b細(xì)胞相比，cab可以以更高的速率遷移到次級(jí)淋巴器官。例如，當(dāng)相較于未暴露于衣原體屬(包括沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體和鼠型衣原體)或蛋白或其片段的細(xì)胞群時(shí)，cab能夠以快1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、50％、60％、70％、90％或100％的速率遷移。相較于未暴露于衣原體屬(包括沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體和鼠型衣原體)或蛋白或其片段的細(xì)胞群，cab能夠以2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍或更多倍的速率遷移。

相較于無(wú)活性b細(xì)胞，cab能夠以更大的速率分泌細(xì)胞因子來(lái)增強(qiáng)t細(xì)胞募集。例如，當(dāng)相較于未暴露于衣原體屬(包括沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體和鼠型衣原體)或蛋白或其片段的細(xì)胞群時(shí)，cab能夠以高1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、50％、60％、70％、90％或100％的速率來(lái)募集t細(xì)胞增強(qiáng)。相較于未暴露于衣原體屬(包括沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體和鼠型衣原體)或蛋白或其片段的細(xì)胞群，cab以2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍或更多倍的速率來(lái)增強(qiáng)t細(xì)胞募集。

本文所公開(kāi)的cab可以通過(guò)使它們與b細(xì)胞激活因子(例如已知激活和/或分化b細(xì)胞的多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子或細(xì)胞系中的任何一種)接觸來(lái)進(jìn)一步增強(qiáng)其活性(參見(jiàn)例如fluckiger,etal.blood199892:4509-4520(fluckiger等人，《血液》，1998年，第92卷，第4509-4520頁(yè))；luo,etal.,blood2009113:1422-1431(luo等人，《血液》，2009年，第113卷，第1422-1431頁(yè)))。此類(lèi)因子可以選自但不限于由以下項(xiàng)組成的組：il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18、il-19、il-20、il-21、il-22、il-23、il-24、il-25、il-26、il-27、il-28、il-29、il-30、il-31、il-32、il-33、il-34、以及il-35、ifn-γ、ifn-α、ifn-β、ifn-δ、c型趨化因子xcl1和xcl2、c-c型趨化因子和cxc型趨化因子、以及tnf超家族的成員{例如，tnf-a、4-1bb配體、b細(xì)胞激活因子(blys)、fas配體、scd40l(包括scd40l的多聚體版本；例如，組氨酸標(biāo)記的可溶性重組體cd40l與抗多聚組氨酸mab組合以將多個(gè)scd40l分子組合在一起)、淋巴毒素、ox40l、rankl、trail)、cpg、以及其他toll樣受體激動(dòng)劑(例如，cpg)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，具體地，cab可以在飼養(yǎng)細(xì)胞上接觸或培養(yǎng)。在其他實(shí)施方案中，本文所描述的培養(yǎng)系統(tǒng)在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下實(shí)施，以提供優(yōu)于本領(lǐng)域已知的需要飼養(yǎng)細(xì)胞的其他系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)。在可以使用飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下，飼養(yǎng)細(xì)胞是基質(zhì)細(xì)胞系，例如鼠基質(zhì)細(xì)胞系s17或ms5。在另一個(gè)實(shí)施方案中，純化的cd19+細(xì)胞可以在b細(xì)胞激活因子細(xì)胞因子如il-10和il-4的存在下表達(dá)cd40-配體的成纖維細(xì)胞的存在下培養(yǎng)。cd40l還可以被提供為與表面如組織培養(yǎng)板或珠粒結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，純化的b細(xì)胞可以在存在或不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下，在存在選自il-10、il-4、il-7、p-odn、cpgdna、il-2、il-15、il6、ifn-α和ifn-δ的一種或多種細(xì)胞因子或因子的情況下用cd40l培養(yǎng)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，b細(xì)胞激活因子可以通過(guò)轉(zhuǎn)染到b細(xì)胞或其他飼養(yǎng)細(xì)胞中來(lái)提供，諸如在pct/us2000/030426中所公開(kāi)的，該專(zhuān)利由于其關(guān)于cd40l和b細(xì)胞的教導(dǎo)而全文以引用方式并入本文。在此情況下，可以使用促進(jìn)b細(xì)胞分化成分泌抗體的細(xì)胞的一種或多種因子和/或提升產(chǎn)生抗體的細(xì)胞壽命的一種或多種因子。此類(lèi)因子包括例如blimp-1、trf4、抗凋亡因子如bcl-xl或bcl5，或cd40受體的組成型活性突變體。此外，促進(jìn)下游信號(hào)傳導(dǎo)分子如tnf受體相關(guān)因子(traf)表達(dá)的因子也可用于激活/分化b細(xì)胞。就此而言，tnf受體超家族的細(xì)胞激活、細(xì)胞存活和抗細(xì)胞凋亡功能主要由traf1-6介導(dǎo)(參見(jiàn)例如r.h.arch,etal.,genesdev.12(1998),pp.2821-2830(arch等人，《基因與發(fā)育》第12期，1998年，第2821-2830頁(yè)))。traf信號(hào)傳導(dǎo)的下游效應(yīng)物包括nf-κb和ap-1家族中的轉(zhuǎn)錄因子，其可以啟動(dòng)細(xì)胞和免疫功能的各個(gè)方面中所涉及的基因。此外，nf-κb和ap-1的激活已經(jīng)顯示通過(guò)抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)提供免受凋亡的細(xì)胞保護(hù)。

該平臺(tái)可以整體或部分地離體或在體內(nèi)進(jìn)行?！半x體”是指在最小改變自然條件的情況下，在生物體外的人造環(huán)境中在細(xì)胞或組織內(nèi)或細(xì)胞或組織上進(jìn)行的方法。相比之下，術(shù)語(yǔ)“體內(nèi)”是指在處于其正常、完整的狀態(tài)下的活生物體內(nèi)進(jìn)行的方法，而“體外”方法是使用已經(jīng)從其常規(guī)生物背景分離的生物體的組分進(jìn)行的。例如，細(xì)胞可以體內(nèi)暴露于滅活的衣原體屬(包括沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體和鼠型衣原體)或其肽或片段，或離體暴露于活的或滅活的衣原體屬(包括沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體和鼠型衣原體)或其肽，該方法在本文中更詳細(xì)地描述。然后將擴(kuò)增的b細(xì)胞暴露或交聯(lián)至抗原，使得它們可以相應(yīng)地分化。同樣，這可以在體內(nèi)或離體發(fā)生。例如，可以將抗原直接注射到受試者體內(nèi)，或者受試者的b細(xì)胞可以在體外(離體)暴露或交聯(lián)至經(jīng)修飾的抗原，其中擴(kuò)增、分化的b細(xì)胞隨后返回到受試者體內(nèi)。cab可用于例如直接體內(nèi)施用、離體體細(xì)胞治療、體內(nèi)可植入裝置和離體體外裝置。

疫苗和治療方法

本文還公開(kāi)了一種治療有需要的受試者的方法，該方法包括：a)從受試者獲得b細(xì)胞；b)將來(lái)自步驟a)的b細(xì)胞暴露于沙眼衣原體或激活蛋白、肽或其片段；c)將步驟b)的b細(xì)胞暴露于抗原，其中該抗原不是來(lái)源于衣原體屬(包括沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體和鼠型衣原體)或者不是來(lái)源于蛋白、肽或其片段，從而獲得激活的、抗原呈遞、衣原體激活的b細(xì)胞(cab)；以及d))用步驟c)的激活的、抗原呈遞衣原體激活的b細(xì)胞治療受試者。

所治療的受試者可以患有多種疾病或病癥。能夠使用激活的b細(xì)胞治療的任何疾病或病癥可以使用本文所公開(kāi)的方法進(jìn)行治療。例如，可以使用這些方法來(lái)治療感染性疾病和癌癥。

還公開(kāi)了包含本文所公開(kāi)的衣原體激活的b細(xì)胞的疫苗。本文公開(kāi)了用于離體免疫的基于細(xì)胞的疫苗，以及用于體內(nèi)免疫以引發(fā)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的組合物和方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，公開(kāi)了患有表達(dá)腫瘤特異性抗原的癌癥類(lèi)型的受試者。這可以導(dǎo)致患者的經(jīng)改善的治療結(jié)果，該治療結(jié)果由例如表達(dá)腫瘤特異性抗原的癌細(xì)胞或?qū)嶓w瘤的生長(zhǎng)減緩或減少，或癌細(xì)胞總數(shù)或總腫瘤負(fù)荷的減少而被證實(shí)。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，患者已經(jīng)被診斷為具有與特定抗原(例如病毒抗原)的表達(dá)相關(guān)的病毒、細(xì)菌、真菌或其他類(lèi)型的感染。這種疫苗可以導(dǎo)致患者的經(jīng)改善的治療結(jié)果，該治療結(jié)果如由患者體內(nèi)致傳染劑的生長(zhǎng)減緩和/或通常與特定感染性疾病相關(guān)的可檢測(cè)癥狀的減少或消除所證明的。

當(dāng)疫苗被制備用于施用時(shí)，其可以與藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑組合以形成藥物制劑或單位劑型。這種制劑中的總活性成分包含制劑的0.1至99.9重量％。“藥學(xué)上可接受的”物質(zhì)是與制劑的其他成分相容的載體、稀釋劑、賦形劑和/或鹽，并且對(duì)其接受者無(wú)害。用于施用的活性成分可以作為粉末或作為顆粒；作為溶液、懸浮液或乳液存在。

可以配制和施用表達(dá)載體、轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞、多核苷酸和多肽(活性成分)，來(lái)通過(guò)產(chǎn)生活性成分與生物體體內(nèi)的藥劑作用位點(diǎn)的接觸的任何手段來(lái)治療各種疾病狀態(tài)。它們可以通過(guò)可與藥物結(jié)合使用的任何常規(guī)手段，作為單獨(dú)的治療活性成分或多種治療活性成分的組合來(lái)施用。它們可以單獨(dú)施用，但通常與基于所選擇的給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)實(shí)踐而選擇的藥用載體一起施用。

通常，水、合適的油、鹽水、右旋糖水溶液和相關(guān)的糖溶液以及二醇類(lèi)(諸如丙二醇或聚乙二醇)是用于腸胃外給藥溶液的合適載體。用于腸胃外給藥的溶液含有活性成分、合適的穩(wěn)定劑以及(如果需要的話(huà))緩沖物質(zhì)?？寡趸瘎?，如硫酸氫鈉、亞硫酸鈉或抗壞血酸，無(wú)論是單獨(dú)或組合的，都是合適的穩(wěn)定劑。還使用檸檬酸及其鹽以及乙二胺四乙酸鈉(edta)。此外，腸胃外溶液可以含有防腐劑，諸如苯扎氯銨、對(duì)羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯以及氯丁醇。適用的藥用載體描述于remington'spharmaceuticalsciences(《雷明頓藥物科學(xué)》)中，該文獻(xiàn)是本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)。

另外，可以采用標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)方法來(lái)控制作用的持續(xù)時(shí)間。這些是本領(lǐng)域中眾所周知的并且包括控釋制劑，并且可以包含合適的大分子，例如聚合物、聚酯、聚氨基酸、聚乙烯、吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纖維素、羧甲基纖維素或硫酸魚(yú)精蛋白?？梢哉{(diào)節(jié)大分子的濃度以及摻入方法，以便控制釋放。另外，該藥劑可以摻入到聚合物材料(諸如，聚酯、聚氨基酸，水凝膠、聚(乳酸)或乙烯乙酸乙烯酯共聚物)的顆粒中。除了被摻入外，這些藥劑也可用于將化合物捕獲在微膠囊中。

含有本文所公開(kāi)的治療劑的藥物制劑可以使用熟知且易得的成分，通過(guò)本領(lǐng)域中已知的方法來(lái)制備。治療劑也可以配制成適用于腸胃外給藥的溶液，例如通過(guò)肌內(nèi)、皮下或靜脈內(nèi)途徑。治療劑的藥物制劑還可以采取含水或無(wú)水溶液或分散體的形式，或者替代地為乳液或懸浮液的形式。

給出的劑量是實(shí)現(xiàn)所需治療反應(yīng)的“有效”量，所需治療反應(yīng)是對(duì)免疫應(yīng)答的刺激或如在本公開(kāi)中其他地方處所定義的癌癥治療。對(duì)于本發(fā)明的藥物組合物，有效劑量通常在約10⁵至10¹¹個(gè)細(xì)胞的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，使用在約10⁶至10¹⁰個(gè)之間的細(xì)胞；更優(yōu)選地使用在約1×10⁷和2×10⁹個(gè)之間的細(xì)胞。多個(gè)劑量當(dāng)組合用于實(shí)現(xiàn)期望效果時(shí)，每一劑量均落入有效量的定義內(nèi)?？梢砸惶於啻巍⒒蛎刻?、或每隔一天、或每隔兩天等施用各劑量。附加劑量可以諸如每月或每周施用，直到實(shí)現(xiàn)期望的效果。此后，特別是當(dāng)免疫學(xué)或臨床益處看似消退時(shí)，可以根據(jù)需要施用附加的加強(qiáng)劑量或維持劑量。

細(xì)胞疫苗的各種組分以“有效組合”存在，這意味著使疫苗有效的每種組分足量。可以使用任何數(shù)量的組成細(xì)胞或其它成分，只要疫苗作為整體是有效的即可。這還將取決于用于制備疫苗的方法。

藥物組合物可以在與產(chǎn)生免疫應(yīng)答或治療受試者的癌癥有關(guān)的其他療法之后、之前、代替其、或與其聯(lián)合施用。例如，受試者可以預(yù)先或同時(shí)通過(guò)手術(shù)減瘤、化療、放射治療、檢查點(diǎn)抑制劑以及其他形式的免疫療法和過(guò)繼轉(zhuǎn)移來(lái)治療。在使用這種方式的情況下，它們優(yōu)選以不妨礙本文所公開(kāi)的組合物的免疫原性的方式或時(shí)間使用。受試者也可能已經(jīng)施用了另一種疫苗或其他組合物，以便刺激免疫應(yīng)答。此類(lèi)替代組合物可以包括腫瘤抗原疫苗、編碼腫瘤抗原的核酸疫苗、抗獨(dú)特型疫苗以及其他類(lèi)型的細(xì)胞疫苗，包括表達(dá)細(xì)胞因子的腫瘤細(xì)胞系。

本文公開(kāi)了聯(lián)合療法，包括施用本文所述的細(xì)胞疫苗組合結(jié)合旨在提供抗腫瘤免疫應(yīng)答的另一種策略。在一種聯(lián)合療法中，在使用包含本文所公開(kāi)的負(fù)載有抗原的cab的組合物在遠(yuǎn)離腫瘤的部位治療之前、期間或之后，向受試者瘤內(nèi)植入經(jīng)刺激的異源淋巴細(xì)胞。在另一種聯(lián)合療法中，在用本文所公開(kāi)的負(fù)載有抗原的cab治療之前、期間或之后，用替代的細(xì)胞疫苗組合物在遠(yuǎn)離腫瘤的部位治療受試者。在另一種聯(lián)合治療中，向受試者施用檢查點(diǎn)抑制劑。在整個(gè)治療過(guò)程中采用多種不同的組合物或施用模式的情況下，選擇每種治療要素的順序和時(shí)序以?xún)?yōu)化免疫刺激或抗腫瘤效應(yīng)。

制備方法

本文公開(kāi)了一種用于在受試者中產(chǎn)生激活的、抗原呈遞、衣原體激活的b細(xì)胞的方法，該方法包括：a)從受試者獲得b細(xì)胞；b)將來(lái)自步驟a)的b細(xì)胞暴露于衣原體屬，或激活蛋白、肽或其片段；以及c)將步驟b)的b細(xì)胞暴露于所需的抗原，其中該抗原不是來(lái)源于衣原體屬(包括沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體和鼠型衣原體)或者不是來(lái)源于激活蛋白、肽或其片段，從而獲得激活的、抗原呈遞衣原體激活的b細(xì)胞(cab)。

在本發(fā)明的方法中可以使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的各種培養(yǎng)基中的任何一種(參見(jiàn)例如currentprotocolsincellculture,2000-2009byjohnwiley&sons,inc.(《細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)指南》，2000-2009，約翰威立出版社出版))。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本文所述方法中的培養(yǎng)基包括但不限于改良的伊格爾培養(yǎng)基(含有或不含胎?；蚱渌线m的血清)。例示性培養(yǎng)基還包括但不限于imdm、rpmi1640、aim-v、dmem、mem、a-mem、f-12、x-vivo15和x-vivo20。在其他實(shí)施方案中，培養(yǎng)基可以包含表面活性劑、抗體、人血漿蛋白制品或還原劑(例如，n-乙酰半胱氨酸、2-巰基乙醇)，或一種或多種抗生素。在一些實(shí)施方案中，也可以使用il-2、il-6、il-10、可溶性cd40l和交聯(lián)增強(qiáng)劑。b細(xì)胞可以在條件下培養(yǎng)足夠長(zhǎng)的時(shí)間段以實(shí)現(xiàn)所需的激活。在某些實(shí)施方案中，b細(xì)胞在條件下培養(yǎng)足夠長(zhǎng)的時(shí)間段，以使得10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或者甚至100％的b細(xì)胞根據(jù)需要被激活。

在一個(gè)示例中，可以通過(guò)使用負(fù)免疫磁性選擇系統(tǒng)或rosettesep^tm系統(tǒng)來(lái)產(chǎn)生cab，以消除除了來(lái)自pbmc或全血的cd4⁺t細(xì)胞和b細(xì)胞以外的所有細(xì)胞類(lèi)型。將所選擇的細(xì)胞在衣原體屬和il-2的存在下培養(yǎng)(每1至5天(優(yōu)選每2至3天)進(jìn)行細(xì)胞傳代，補(bǔ)充含有衣原體屬和il-2的培養(yǎng)基)，直到產(chǎn)生足夠數(shù)量的cab用于本文的方法。在收獲使用時(shí)，可以使用對(duì)cd4⁺t細(xì)胞頻率的流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估來(lái)確定是否需要進(jìn)一步的免疫磁性選擇來(lái)進(jìn)一步耗減cd4⁺t細(xì)胞。

b細(xì)胞激活的誘導(dǎo)可以通過(guò)測(cè)量與細(xì)胞增殖相關(guān)的dna合成的技術(shù)如³h-胸腺嘧啶核苷結(jié)合來(lái)測(cè)量，或通過(guò)使用熒光標(biāo)記物如羧基熒光素琥珀酰亞胺酯的流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定法來(lái)測(cè)量。為了最佳地測(cè)量b細(xì)胞增殖，可以將il-2或il-4以合適的濃度加入到培養(yǎng)基中。另選地，可以測(cè)量隨著免疫球蛋白分泌變化的b細(xì)胞激活。

在培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間段，諸如2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或更多天，通常約3天后，可添加附加體積的培養(yǎng)基。來(lái)自個(gè)別培養(yǎng)物的上清液可以在培養(yǎng)期間的不同時(shí)間收獲，并針對(duì)igm和igg1定量，如在noelleetal.,(1991)j.immunol.146:1118-1124(noelle等人，1991年，《免疫學(xué)期刊》，第146卷，第1118-1124頁(yè))中所描述的。在另外的實(shí)施方案中，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)可用于測(cè)量igm或其他抗體同種型。在某些實(shí)施方案中，可以使用可商購(gòu)獲得的抗體如山羊抗人igg作為捕獲抗體進(jìn)行igg測(cè)定，然后使用多種合適的檢測(cè)試劑中的任一種如生物素化的山羊抗人ig、鏈霉親和素-堿性磷酸酶和底物進(jìn)行檢測(cè)。

已經(jīng)描述了本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案。然而，應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍的情況下，可以進(jìn)行各種修改。因此，其他實(shí)施方案在所附權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。

實(shí)施例

實(shí)施例1：制備和使用衣原體激活的b細(xì)胞的方法

與本文所公開(kāi)的方法和平臺(tái)一起使用的b細(xì)胞可以從多種來(lái)源獲得，包括來(lái)自外周血以及初級(jí)和次級(jí)淋巴器官(諸如分別為骨髓和淋巴結(jié))的單核細(xì)胞。例如，在人體中，b細(xì)胞占總外周血白細(xì)胞的約1％至15％，淋巴結(jié)細(xì)胞的20％至25％，以及脾細(xì)胞的高達(dá)50％。如果需要，可以通過(guò)在獲取外周血之前向患者施用適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子和募集生長(zhǎng)因子(例如il-4、gm-csf和il-3)來(lái)在體內(nèi)擴(kuò)增b細(xì)胞的頻率。從這些組織獲得單核細(xì)胞，例如通過(guò)使用密度梯度離心法從外周血中獲得，同時(shí)可以例如通過(guò)切碎組織來(lái)從完整的扁桃體中分離淋巴結(jié)細(xì)胞，然后通過(guò)篩濾(straining)獲得單細(xì)胞懸液。優(yōu)選地，從外周血獲得單核細(xì)胞。該量可以變化，但是最初可以從患者取約500ml的血液(這可以例如每八周重復(fù)一次)。將來(lái)自外周血或淋巴器官的未分離單核細(xì)胞以單細(xì)胞懸液在含有附加的丙酮酸鹽、l-谷氨酰胺、非必需氨基酸和抗生素的補(bǔ)充有fbs的rpmi1640培養(yǎng)基中或在補(bǔ)充有抗生素的無(wú)血清培養(yǎng)基(例如x-vivo^tm20)中培養(yǎng)。為了產(chǎn)生cab，可以使用如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解地純化的滅活沙眼衣原體eb或從沙眼衣原體eb使用可商購(gòu)獲得的蛋白提取試劑產(chǎn)生的溶解物來(lái)培養(yǎng)大量單核細(xì)胞。所有測(cè)試的衣原體屬(包括沙眼衣原體[眼殖菌株(oculogenitalstrains)如d和e，以及性病淋巴肉芽腫菌株如l2]、鸚鵡熱衣原體和鼠型衣原體)在激活靜息的哺乳動(dòng)物b細(xì)胞方面表現(xiàn)出相同的效力。將細(xì)胞與沙眼衣原體一起在沒(méi)有附加操縱或細(xì)胞因子補(bǔ)充的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在培養(yǎng)3天后，總細(xì)胞可以?xún)龃嬉怨┖罄m(xù)使用，或者在初次添加沙眼衣原體后，如果在第3天提供新鮮的溫?zé)崤囵B(yǎng)基(在此時(shí)間點(diǎn)不需要提供附加的沙眼衣原體eb)，則可以將總細(xì)胞培養(yǎng)4至6天以供立即使用。這些條件的使用導(dǎo)致b細(xì)胞的增殖和激活，而沒(méi)有t細(xì)胞的增殖。有趣的是，當(dāng)全部經(jīng)沙眼衣原體刺激的細(xì)胞在3天后凍存并隨后解凍，然后再次用新鮮的溫?zé)崤囵B(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，cab再次開(kāi)始增殖過(guò)夜。

通過(guò)適當(dāng)選擇抗原和apc，可以促進(jìn)所需的免疫應(yīng)答。如果要使用整個(gè)蛋白質(zhì)抗原(包括細(xì)胞裂解物)則在使用前一天或者如果要使用肽則在使用前幾小時(shí)，用所需抗原刺激新鮮或凍存的cab。另選地，可以通過(guò)用病毒載體(例如腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)轉(zhuǎn)染rna或感染cab來(lái)進(jìn)行所需抗原的轉(zhuǎn)染。另一方面，cab可以通過(guò)單獨(dú)或同時(shí)添加遞送的各種因子來(lái)進(jìn)一步增加其apc活性，例如使cab負(fù)載或交聯(lián)i型nkt細(xì)胞激活糖鞘脂(例如α-半乳糖基神經(jīng)酰胺)、ii型nkt細(xì)胞激活磷脂或溶血磷脂(例如溶血磷脂酰乙醇胺)和/或γδt細(xì)胞激活雙磷酸鹽(例如唑來(lái)膦酸)以及所關(guān)注的抗原。使用載體的轉(zhuǎn)染和感染也可用于誘導(dǎo)cab表達(dá)各種細(xì)胞因子、共刺激因子或其他蛋白質(zhì)(包括抗癌劑)，以便增加它們的體內(nèi)活性。

在抗原負(fù)載和任何其他所需的操縱之后，可以制備cab以供使用。如果使用外周血單核細(xì)胞(pbmc)作為單核細(xì)胞的來(lái)源，則在使用前需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫磁性分離，因?yàn)樵?至6天的培養(yǎng)后，cab僅占所獲得的細(xì)胞群的至多50％。不含cd2和cd43缺失的定制easysep^tm人類(lèi)b細(xì)胞富集試劑盒可以用于此目的，其中獲得>95％的cab，沒(méi)有可檢測(cè)到的t細(xì)胞、單核細(xì)胞或dc。然而，任何類(lèi)似的可商購(gòu)獲得的免疫磁性選擇系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)是合適的。如果使用淋巴器官作為單核細(xì)胞的來(lái)源，b細(xì)胞的初始高頻率(總細(xì)胞的25％至50％)和它們從沙眼衣原體接受的強(qiáng)烈刺激使培養(yǎng)物在4至6天后達(dá)到>95％的cab，因此在使用前不需要進(jìn)一步純化cab。此后，可以使用多次施用方案將所產(chǎn)生的自體cab施用于所選擇的患者?？梢酝ㄟ^(guò)任何合適的方式將cab施用于患者，包括例如靜脈內(nèi)輸注、彈丸式注射，以及通過(guò)導(dǎo)管或其他手段進(jìn)行定點(diǎn)遞送。由于其對(duì)凍存的適應(yīng)性，cab可以在生產(chǎn)后立即施用，或者如果需要的話(huà)可以幾年后再施用。

實(shí)施例2：將抗原綴合至衣原體激活的b細(xì)胞的方法

如實(shí)施例1所示制備cab。新鮮或凍存的cab可以就在施用于受試者之前與期望的抗原(蛋白質(zhì)或肽)綴合或交聯(lián)。綴合或交聯(lián)可以例如使用零長(zhǎng)交聯(lián)劑1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(edac)進(jìn)行。將cab用pbs(ph6.0)洗滌并以2×10⁸/ml重懸，然后將edac加入到細(xì)胞懸浮液中，接著加入足夠濃度的抗原(蛋白質(zhì)或肽)，充分混合并在4℃溫育1小時(shí)。在溫育后，將與抗原交聯(lián)的細(xì)胞用pbs(ph7.4)洗滌，并可進(jìn)行進(jìn)一步處理或可制備以用于施用。無(wú)論cab的來(lái)源如何(自體或異源)，都可以進(jìn)行此過(guò)程?？梢允褂闷渌?lèi)型的交聯(lián)劑，具體取決于抗原的性質(zhì)(蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)或碳水化合物)以及交聯(lián)劑與活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的相容性。圖12示出了交聯(lián)劑的使用。

cab可以通過(guò)單獨(dú)地或與抗原交聯(lián)同時(shí)地添加遞送的各種因子來(lái)進(jìn)一步增加其apc活性，例如使cab負(fù)載或交聯(lián)i型nkt細(xì)胞激活糖鞘脂(例如α-半乳糖基神經(jīng)酰胺)、ii型nkt細(xì)胞激活磷脂或溶血磷脂(例如溶血磷脂酰乙醇胺)和/或γδt細(xì)胞激活雙磷酸鹽(例如唑來(lái)膦酸)以及所關(guān)注的抗原。使用載體的轉(zhuǎn)染和感染也可用于誘導(dǎo)cab表達(dá)各種細(xì)胞因子、共刺激因子或其他蛋白質(zhì)(包括抗癌劑)，以便增加它們的體內(nèi)活性。

除非另有定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)的含義與所公開(kāi)的發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中引述的出版物及其中引述的材料明確地以引用方式并入。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到或能夠使用不超過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)探知本發(fā)明的具體實(shí)施方案的許多等同物。此類(lèi)等同物旨在由以下權(quán)利要求書(shū)涵蓋。