本發(fā)明涉及一種抗腫瘤劑。更具體而言，本發(fā)明涉及以細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白(cytoskeleton－associatedprotein4，ckap4)、63－kda細(xì)胞骨架交聯(lián)膜蛋白(63－kdacytoskeleton－linkingmembraneprotein，climp－63)、p63、ergic－63))作為靶分子并通過抑制該靶分子的表達(dá)或功能來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖的抗腫瘤劑。進(jìn)而，本發(fā)明涉及癌癥患者的術(shù)后的預(yù)后的檢查方法及癌癥的檢查方法。
背景技術(shù)：
：在wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，若作為細(xì)胞外分泌糖蛋白的wnt與受體結(jié)合，則經(jīng)由ldl受體相關(guān)蛋白5或6(lrp5/6)、7次跨膜型受體frizzled傳導(dǎo)承擔(dān)細(xì)胞功能的信號。wnt信號承擔(dān)多種多樣的細(xì)胞功能控制。已知wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常會引起癌癥、骨疾病、炎癥、感染等。另外，dkk1(dickkopf1)已知是在wnt信號作用下進(jìn)行表達(dá)、并阻礙wnt配體與ldl受體相關(guān)蛋白6(lrp6)的結(jié)合來抑制wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的因子，形成抑制性反饋機(jī)制。由于wnt信號正向控制細(xì)胞增殖，因此一直以來考慮以dkk1負(fù)向控制細(xì)胞增殖。另一方面，近年來，有報(bào)道顯示dkk1會使腫瘤細(xì)胞的增殖亢進(jìn)。具體而言，在非專利文獻(xiàn)1中報(bào)道了以下內(nèi)容：dkk1在多發(fā)性骨髄瘤、肝胚細(xì)胞瘤、病毒腫瘤、前列腺癌、腎癌、乳癌、食道癌、肺癌等中過量表達(dá)，dkk1的表達(dá)抑制、抗dkk1抗體對于抑制腫瘤細(xì)胞的增殖有效。這樣一來，dkk1盡管在wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中負(fù)向控制細(xì)胞增殖，但是還具有使細(xì)胞的增殖亢進(jìn)的功能，因此類推dkk1通過與wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路獨(dú)立的信號通路使細(xì)胞增殖亢進(jìn)。然而，一直沒有明確dkk1導(dǎo)致細(xì)胞增殖亢進(jìn)的信號通路。另一方面，ckap4為跨膜型的受體，作為其配體，已知抗增殖因子(anti－proliferativefactor，apf)、表面活性蛋白a(surfactantproteina，spa)、組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tissueplasminogenactivator，tpa)等，任一配體均未報(bào)道過ckap4所介導(dǎo)的細(xì)胞增殖亢進(jìn)作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明要解決的課題本發(fā)明人等如后述的實(shí)施例所示那樣使用犬腎小管源mdck細(xì)胞構(gòu)建dkk1表達(dá)株(mdck/dkk1－flag細(xì)胞)，并且確認(rèn)到dkk1使mdck細(xì)胞的增殖能力亢進(jìn)。由此推斷dkk1通過與wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路獨(dú)立的信號通路使細(xì)胞增殖亢進(jìn)。為此，若能闡明dkk1使腫瘤細(xì)胞的增殖亢進(jìn)的信號通路、并鑒定與腫瘤細(xì)胞的增殖有關(guān)的靶分子，則可以開發(fā)出新的抗腫瘤劑。在此種背景下，本發(fā)明的目的在于，鑒定與dkk1所致的腫瘤細(xì)胞的增殖亢進(jìn)有關(guān)的靶分子，提供一種新的抗腫瘤劑。進(jìn)而，本發(fā)明的另一目的還在于，提供使用上述靶分子來篩選抗腫瘤劑的方法。進(jìn)而，本發(fā)明的另一目的在于，提供用于預(yù)測癌癥患者的術(shù)后的預(yù)后的檢查方法及用于預(yù)測有無罹患癌癥的檢查方法。用于解決課題的手段本發(fā)明人等為了闡明dkk1使腫瘤細(xì)胞的增殖亢進(jìn)的信號通路而進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ckap4在與wnt信號通路獨(dú)立的信號通路中作為dkk1的受體發(fā)揮功能。另外，本發(fā)明人等查明dkk1介導(dǎo)ckap4與pi3k的締合而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，還發(fā)現(xiàn)ckap4特異性地調(diào)節(jié)dkk1的細(xì)胞增殖亢進(jìn)效果、并承擔(dān)以往并未獲悉的細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)機(jī)制的部分功能。而且，本發(fā)明人等還發(fā)現(xiàn)：通過在腫瘤細(xì)胞中抑制ckap4的表達(dá)或功能，從而可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本發(fā)明是基于該見解而進(jìn)一步反復(fù)研究而完成的。即，本發(fā)明提供下述各項(xiàng)方案的發(fā)明。項(xiàng)1.一種抗腫瘤劑，其特征在于，以抑制ckap4的表達(dá)或功能的物質(zhì)作為有效成分。項(xiàng)2.根據(jù)項(xiàng)1所述的抗腫瘤劑，其中，上述物質(zhì)為選自針對ckap4的sirna、shrna、dsrna、mirna及反義核酸中的至少1種核酸藥物。項(xiàng)3.根據(jù)項(xiàng)1所述的抗腫瘤劑，其中，上述物質(zhì)為與ckap4特異性結(jié)合的抗體或其片段。項(xiàng)4.根據(jù)項(xiàng)1～3中任一項(xiàng)所述的抗腫瘤劑，其被用于癌癥的治療、預(yù)防或防止病情發(fā)展的用途。項(xiàng)5.根據(jù)項(xiàng)4所述的抗腫瘤劑，其中，癌癥是表達(dá)ckap4的癌癥。項(xiàng)6.根據(jù)項(xiàng)5所述的抗腫瘤劑，其中，癌癥是還表達(dá)dkk1的癌癥。項(xiàng)7.根據(jù)項(xiàng)4～6中任一項(xiàng)所述的抗腫瘤劑，其中，癌癥是肺癌或胰癌。項(xiàng)8.抑制ckap4的表達(dá)或功能的物質(zhì)在制造抗腫瘤劑中的應(yīng)用。項(xiàng)9.一種抑制ckap4的表達(dá)或功能的物質(zhì)，其被用于癌癥的處置。項(xiàng)10.一種癌癥的治療方法，其包括對癌癥患者給藥治療有效量的抑制ckap4的表達(dá)或功能的物質(zhì)的工序。項(xiàng)11.一種篩選方法，其是對抗腫瘤劑的有效成分進(jìn)行篩選的方法，該方法包括：第一工序，對被檢物質(zhì)測定ckap4的表達(dá)抑制能力或與細(xì)胞膜上的ckap4的結(jié)合能力；以及第二工序，選擇確認(rèn)到ckap4的表達(dá)抑制能力或與細(xì)胞膜上的ckap4的結(jié)合能力的被檢物質(zhì)作為抗腫瘤劑的有效成分的候補(bǔ)。項(xiàng)12.根據(jù)項(xiàng)11所述的篩選方法，其中，作為上述第一工序，包括：第1－a工序，使被檢物質(zhì)與表達(dá)ckap4的細(xì)胞接觸；以及第1－b工序，在第1－a工序后對上述細(xì)胞中的ckap4表達(dá)量進(jìn)行測定。項(xiàng)13.根據(jù)項(xiàng)11所述的篩選方法，其中，作為上述第一工序，包括：第1－i工序，使被檢物質(zhì)與表達(dá)ckap4的細(xì)胞接觸；以及第1－ii工序，在第1－i工序后對被檢物質(zhì)是否與細(xì)胞膜上的ckap4結(jié)合進(jìn)行確認(rèn)。項(xiàng)14.一種癌癥患者的術(shù)后的預(yù)后的檢查方法，其包括對從癌癥患者采集的癌組織中的ckap4的表達(dá)進(jìn)行測定的工序。項(xiàng)15.根據(jù)項(xiàng)14所述的檢查方法，其還對上述癌組織中的dkk1表達(dá)進(jìn)行測定。項(xiàng)16.根據(jù)項(xiàng)14或15所述的檢查方法，其中，上述癌癥患者為肺癌患者或胰癌患者。項(xiàng)17.一種癌癥患者的術(shù)后的預(yù)后的檢查藥，其包含用于檢測ckap4的試劑。項(xiàng)18.根據(jù)項(xiàng)17所述的檢查藥，其還包含用于檢測dkk1的試劑。項(xiàng)19.根據(jù)項(xiàng)17或18所述的檢查藥，其中，癌癥患者為肺癌患者或胰癌患者。項(xiàng)20.用于檢測ckap4的試劑在制造癌癥患者的術(shù)后的預(yù)后的檢查藥中的應(yīng)用。項(xiàng)21.一種用于檢測ckap4的試劑，其被用于癌癥患者的術(shù)后的預(yù)后的檢查。項(xiàng)22.一種癌癥的檢查方法，其包括對從被檢者采集的外來體中的ckap4進(jìn)行測定的工序。項(xiàng)23.一種癌癥的檢查藥，其包含檢測ckap4的試劑。項(xiàng)24.一種檢測ckap4的試劑在制造檢測ckap4的試劑中的應(yīng)用。項(xiàng)25.一種檢測ckap4的試劑，其被用于癌癥的檢查。發(fā)明效果本發(fā)明的抗腫瘤劑基于ckap4作為dkk1的受體發(fā)揮功能、并且dkk1經(jīng)由ckap4傳導(dǎo)使腫瘤細(xì)胞的增殖亢進(jìn)的信號的新見解，根據(jù)本發(fā)明，以ckap4作為靶分子并抑制該靶分子的表達(dá)或功能，由此可以有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。對各種癌細(xì)胞實(shí)際確認(rèn)了抗ckap4抗體所產(chǎn)生的體內(nèi)(invivo)腫瘤抑制效果。另外，dkk1及ckap4在正常上皮細(xì)胞中未確認(rèn)到表達(dá)，因此本發(fā)明的抗腫瘤劑的腫瘤特異性高、在安全性的方面也優(yōu)異。另外，根據(jù)本發(fā)明的篩選方法，通過以ckap4作為靶分子并篩選抑制該靶分子的表達(dá)或功能的物質(zhì)，從而可以加速開發(fā)優(yōu)異的抗惡性腫瘤藥，還可以給癌癥患者帶來福音。進(jìn)而，根據(jù)本發(fā)明的癌癥患者的術(shù)后的預(yù)后的檢查方法，能夠以高精度預(yù)測術(shù)后的預(yù)后，因此可以對確定癌癥患者的術(shù)后的最佳治療策略發(fā)揮作用。另外，根據(jù)本發(fā)明的癌癥的檢查方法，通過使用從被檢者的體液采集的外來體，從而可以預(yù)測有無罹患癌癥，因此可以低侵襲性或非侵襲性地進(jìn)行癌癥的診斷。附圖說明圖1：(a)的上圖中示出在表達(dá)dkk1－flag的mdck細(xì)胞中確認(rèn)到c末端側(cè)被flag標(biāo)簽化的dkk1表達(dá)的結(jié)果，(a)的下圖中示出對在transwell聚碳酸酯過濾器上培養(yǎng)出的mdck/dkk1－flag細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)并分級為頂端側(cè)(ap)和基底側(cè)(bl)后對dkk1的表達(dá)進(jìn)行分析的結(jié)果。(b)中示出對在transwell聚碳酸酯過濾器上培養(yǎng)出的mdck/dkk1－flag細(xì)胞進(jìn)行固定并將細(xì)胞用抗dkk1抗體(綠色)、抗e－鈣粘蛋白抗體(紅色)及draq5dnadye(藍(lán)色)染色后的結(jié)果。(c)中示出將胎生第13天(daye13)小鼠的腎臟的組織切片進(jìn)行石蠟包埋并用抗dkk1抗體(綠色)、抗apkc抗體(紅色)進(jìn)行免疫染色后的結(jié)果。(d)中示出將mdck/dkk1－flag細(xì)胞在基質(zhì)膠上三維培養(yǎng)5天并對所形成的囊腫及其外徑(表示細(xì)胞塊的大小)進(jìn)行測定的結(jié)果。(e)中示出對在基質(zhì)膠上三維培養(yǎng)出的mdck/dkk1－flag細(xì)胞用抗ki67抗體(綠色)、抗apkc抗體(紅色)及draq5dnadye(藍(lán)色)進(jìn)行染色的結(jié)果。(f)中示出對在transwell聚碳酸酯過濾器上培養(yǎng)出的mdck細(xì)胞在頂端側(cè)或基底側(cè)添加dkk1進(jìn)行24小時培養(yǎng)后用ki67抗體(紅色)及draq5dnadye(藍(lán)色)進(jìn)行染色的結(jié)果。nt：無處理。(g)中示出對mdck/dkk1－flag細(xì)胞二維培養(yǎng)3天并對細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)測的結(jié)果。圖2：(a)中示出對處于頂端側(cè)表面的dkk1結(jié)合蛋白進(jìn)行篩選的實(shí)驗(yàn)步驟的示意圖。(b)中示出對dkk1結(jié)合蛋白進(jìn)行純化并對其進(jìn)行銀染色的結(jié)果(左圖)及所鑒定的結(jié)合蛋白組(右圖)。(c)中示出對參照(mdck細(xì)胞)、mdck/dkk1－flag細(xì)胞或mdck/dkk1－flag－gpi細(xì)胞(dkk1－flag－gpi)的溶解液(input)及其抗flag抗體的免疫沉降物(ip)進(jìn)行ckap4、lrp6及dkk1的檢測的結(jié)果。(d)的上圖中示出試驗(yàn)中使用的dkk1的域結(jié)構(gòu)的示意圖，(d)的下圖中示出對參照(mdck細(xì)胞)及表達(dá)野生型(wildtype)dkk1－flag(wt)或缺失突變體dkk1－flag(δcrd－1、δcrd－2)的mdck細(xì)胞的溶解液(input)及其抗flag抗體的免疫沉降物(ip)進(jìn)行ckap4、lrp6及dkk1的檢測的結(jié)果。(e)的上圖中示出試驗(yàn)中使用的ckap4的域結(jié)構(gòu)的示意圖，(e)的左下圖中示出對瞬時表達(dá)野生型ckap4(wt)－h(huán)a或缺失突變體ckap4－h(huán)a(ecd、δc1、δc2、δc3)的x293t/dkk1－flag細(xì)胞的溶解液(input)及其抗flag抗體的免疫沉降物(ip)檢測ha及dkk1的結(jié)果。(e)的右下圖中示出對瞬時表達(dá)野生型ckap4－h(huán)a(wt)或缺失突變體ckap4－h(huán)a(δlz)的x293t/dkk1－flag細(xì)胞的溶解液(input)及其抗flag抗體的免疫沉降物(ip)檢測ha及dkk1的結(jié)果。圖3：(a)及(b)中示出將在ckap4的細(xì)胞外域(ckap4－ecd)的n末端連結(jié)有谷胱甘肽－s－轉(zhuǎn)移酶(gst)的多肽(gst－ckap4－ecd)或gst與dkk1一起培養(yǎng)并對與gst－ckap4－ecd或gst結(jié)合的dkk1進(jìn)行檢測、測定而得到的結(jié)果。圖4：(a)中示出對mdck細(xì)胞(control)、mdck/dkk1－flag細(xì)胞(dkk1－flag)或mdck/dkk1－flag－gpi細(xì)胞(dkk1－flag－gpi)的溶解液檢測各種蛋白的磷酸化狀態(tài)的結(jié)果。(b)中示出對用包含dkk1的調(diào)整液培養(yǎng)出的mdck細(xì)胞的溶解液檢測pakt、akt及網(wǎng)格蛋白的結(jié)果。(c)中示出對轉(zhuǎn)導(dǎo)參照sirna或ckap4sirna的mdck細(xì)胞(control)或mdck/dkk1－flag細(xì)胞的溶解液檢測各種蛋白的結(jié)果。(d)中示出對轉(zhuǎn)導(dǎo)參照sirna或ckap4sirna的mdck細(xì)胞(control)或mdck/dkk1－flag細(xì)胞(dkk1－flag)進(jìn)行細(xì)胞增殖試驗(yàn)的結(jié)果。圖5：(a)中示出關(guān)于利用抗ckap4抗體對參照(mdck細(xì)胞)及過量表達(dá)野生型dkk1－flag(wt)的mdck細(xì)胞(mdck/dkk1－flag)的溶解液(input)得到的免疫沉降物(ip)，進(jìn)行p85α、ckap4及dkk1的檢測的結(jié)果。(b)中示出關(guān)于利用抗ckap4抗體對參照(mdck細(xì)胞)及過量表達(dá)野生型dkk1－flag(wt)的mdck細(xì)胞(mdck/dkk1－flag)的溶解液(input)得到的免疫沉降物(ip)，進(jìn)行p110α、ckap4及dkk1的檢測的結(jié)果。(c)中示出對在表達(dá)p85α的同時還表達(dá)ckap4－h(huán)a或ckap4－ecd－h(huán)a的x293t/dkk1－flag細(xì)胞的溶解液(input)及其抗ha抗體的免疫沉降物(ip)檢測p85α及ha(ckap4)的結(jié)果。(d)中示出對在表達(dá)flag－p110β的同時還表達(dá)ckap4－h(huán)a或ckap4－ecd－h(huán)a的x293t/dkk1細(xì)胞的溶解液(input)及其抗ha抗體的免疫沉降物(ip)檢測flag(p110β)及ha(ckap4)的結(jié)果。(e)中示出對參照shrna(control)或表達(dá)dkk1shrna(dkk1)的s2－cp8細(xì)胞的溶解液(input)及其抗ckap4抗體的免疫沉降物(ip)進(jìn)行p85α、ckap4及dkk1的檢測的結(jié)果。(f)中示出對參照shrna(control)或表達(dá)dkk1shrna(dkk1)的s2－cp8細(xì)胞的溶解液(input)及其抗ckap4抗體的免疫沉降物(ip)進(jìn)行p110β、ckap4及dkk1的檢測的結(jié)果。(g)的上圖中示出ckap4的脯氨酸富集區(qū)域的氨基酸序列。(g)的下圖中示出對將編碼野生型ckap4－h(huán)a或由脯氨酸置換為丙氨酸的ckap4－h(huán)a(pamutantckap4－h(huán)a)的基因轉(zhuǎn)染后的x293t/dkk1－flag細(xì)胞的溶解液(input)及其抗ha抗體的免疫沉降物(ip)進(jìn)行p85α及ha(ckap4)的檢測的結(jié)果。(h)的上圖中示出p85α的域結(jié)構(gòu)的示意圖。(h)的下圖中示出對編碼野生型的p85α(wt)(gfp－wt)、sh3域發(fā)生缺失的δsh3(gfp－δsh3)、sh2及ish2域發(fā)生缺失的δsh2(gfp－δsh2)的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的x293t/dkk1－flag細(xì)胞的溶解液(input)及其抗ckap4抗體的免疫沉降物(ip)進(jìn)行g(shù)fp(p85α)及ckap4的檢測的結(jié)果。圖6：示出對肺癌細(xì)胞、胰癌細(xì)胞、子宮頸管癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、食道鱗狀上皮癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞及來自胎兒的腎臟細(xì)胞的溶解液進(jìn)行dkk1、ckap4及hsp90的檢測的結(jié)果。圖7：(a)的左圖中示出將從胰癌患者摘取的胰癌組織用抗dkk1抗體或抗ckap4抗體和蘇木精免疫染色后的結(jié)果。(a)的右圖中示出對從胰癌患者摘取的胰癌組織(n＝59)按照dkk1和ckap4的表達(dá)量分類的結(jié)果。(b)中示出將從胰癌患者摘取的胰癌組織(n＝59)按照有無表達(dá)dkk1和ckap4進(jìn)行分類并對術(shù)后天數(shù)與總生存率的關(guān)系進(jìn)行分析的結(jié)果。(c)中示出將從胰癌患者摘取的胰癌組織(n＝59)按照有無表達(dá)dkk1和ckap4進(jìn)行分類并對術(shù)后天數(shù)與無復(fù)發(fā)生存率的關(guān)系進(jìn)行分析的結(jié)果。圖8：(a)的左圖中示出將從肺腺癌患者摘取的肺腺癌組織用抗dkk1抗體或抗ckap4抗體和蘇木精免疫染色后的結(jié)果。(a)的右圖中示出對從肺腺癌患者摘取的肺腺癌組織(n＝67)按照dkk1和ckap4的表達(dá)量分類后的結(jié)果。(b)中示出將從肺腺癌患者摘取的肺腺癌組織(n＝67)按照有無表達(dá)dkk1和ckap4進(jìn)行分類并對術(shù)后天數(shù)和無復(fù)發(fā)生存率的關(guān)系進(jìn)行分析的結(jié)果。(c)的左圖中示出將從肺鱗狀上皮癌癥患者摘取的肺鱗狀上皮癌組織用抗dkk1抗體或抗ckap4抗體和蘇木精免疫染色后的結(jié)果。(c)的右圖中示出對從肺鱗狀上皮癌癥患者摘取的肺鱗狀上皮癌組織(n＝61)按照dkk1和ckap4的表達(dá)量分類后的結(jié)果。(d)中示出將從肺鱗狀上皮癌癥患者摘取的肺鱗狀上皮癌組織(n＝61)按照有無表達(dá)dkk1和ckap4進(jìn)行分類并對術(shù)后天數(shù)與無復(fù)發(fā)生存率的關(guān)系進(jìn)行分析的結(jié)果。(e)的左圖中示出對顯示肺部非典型腺瘤性增生的肺組織用抗dkk1抗體或抗ckap4抗體和蘇木精免疫染色后的結(jié)果。(e)的右圖中示出對從肺部非典型腺瘤性增生患者摘取的肺部非典型腺瘤性增生組織(n＝11)按照dkk1和ckap4的表達(dá)量進(jìn)行分類的結(jié)果。圖9：示出對人胰癌(a，b)、人肺腺癌(c)及人肺鱗狀上皮癌(d)的各癌組織用抗dkk1抗體、抗ckap4抗體或抗pakt抗體和蘇木精免疫染色后的結(jié)果。圖10：(a)的左上圖中示出對轉(zhuǎn)導(dǎo)參照shrna、dkk1shrna、或dkk1shrna及dkk1－flag的s2－cp8細(xì)胞的溶解液檢測各種蛋白的結(jié)果，(a)的右上圖中示出對轉(zhuǎn)導(dǎo)參照shrna、ckap4shrna、或ckap4shrna及ckap4－h(huán)a的s2－cp8細(xì)胞的溶解液檢測各種蛋白的結(jié)果。(a)的下圖中示出對上述各細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖試驗(yàn)的結(jié)果。(b)的左上圖中示出對轉(zhuǎn)導(dǎo)參照shrna、dkk1shrna、或dkk1shrna及dkk1－flag的a549細(xì)胞的溶解液檢測各種蛋白的結(jié)果，(b)的右上圖中示出對轉(zhuǎn)導(dǎo)參照shrna、ckap4shrna、或ckap4shrna及ckap4－h(huán)a的a549細(xì)胞的溶解液檢測各種蛋白的結(jié)果。(b)的下圖中示出對上述各細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖試驗(yàn)的結(jié)果。(c)中示出將表達(dá)參照shrna、dkk1shrna、ckap4shrna、dkk1shrna及dkk1－flag、或ckap4shrna及ckap4－h(huán)a的s2－cp8細(xì)胞在基質(zhì)膠上進(jìn)行三維培養(yǎng)并對每1個視野中的凝聚塊數(shù)進(jìn)行測定的結(jié)果。(d)中示出將表達(dá)參照shrna、dkk1shrna、ckap4shrna、dkk1shrna及dkk1－flag、或ckap4shrna及ckap4－h(huán)a的a549細(xì)胞在基質(zhì)膠上進(jìn)行三維培養(yǎng)并對每1個視野的凝聚塊數(shù)進(jìn)行測定的結(jié)果。圖11：(a)中示出在皮下注入表達(dá)參照shrna、ckap4shrna、或ckap4shrna及ckap4－h(huán)a的s2－cp8細(xì)胞的裸鼠中分析注入后21天內(nèi)的異種腫瘤組織片的腫瘤體積變化和最終重量的結(jié)果。(b)中示出在皮下注入表達(dá)參照shrna、ckap4shrna、或ckap4shrna及ckap4－h(huán)a的a549細(xì)胞的裸鼠中分析注入后28天內(nèi)的異種腫瘤組織片的腫瘤體積變化和最終重量的結(jié)果。(c)中示出在皮下注入表達(dá)參照shrna、或dkk1shrna的s2－cp8細(xì)胞的裸鼠中分析注入后21天內(nèi)的異種腫瘤組織片的腫瘤體積變化和最終重量的結(jié)果。(d)中示出在皮下注入表達(dá)參照shrna、或dkk1shrna的a549細(xì)胞的裸鼠中分析注入后28天內(nèi)的異種腫瘤組織片的腫瘤體積變化和最終重量的結(jié)果。圖12：(a)的左圖中示出多克隆抗ckap4抗體的表位的示意圖，(a)的右圖中示出對s2－cp8細(xì)胞(control)、或表達(dá)ckap4cdna或ckap4shrna的s2－cp8細(xì)胞的溶解液進(jìn)行ckap4的檢測的結(jié)果。(b)中示出將在涂布有膠原的載玻片上增殖出的s2－cp8細(xì)胞以未固定的狀態(tài)用抗ckap4抗體(綠色)、鬼筆環(huán)肽(phalloidin)(紅色)及draq5dnadye(藍(lán)色)染色后的結(jié)果。(c)中示出將gst－ckap4－ecd和抗ckap4抗體或抗gst抗體混合后添加dkk1進(jìn)行孵育并對與gst－ckap4－ecd結(jié)合的dkk1進(jìn)行測定的結(jié)果。(d)中示出對用諾考達(dá)唑(nocodazole)處理后在抗ckap4抗體或抗gst抗體的存在下添加dkk1或胰島素并孵育的mdck細(xì)胞的溶解液進(jìn)行各種蛋白的檢測的結(jié)果。(e)中示出對添加抗ckap4抗體或抗gst抗體并孵育的s2－cp8細(xì)胞及a549細(xì)胞的溶解液進(jìn)行各種蛋白的檢測的結(jié)果。(f)中示出在抗gst抗體或抗ckap4抗體的存在下將s2－cp8細(xì)胞及a549細(xì)胞在基質(zhì)膠中進(jìn)行三維培養(yǎng)并對1個視野中的細(xì)胞凝聚塊的數(shù)量進(jìn)行測量的結(jié)果。(g)中示出在抗gst抗體或抗ckap4抗體的存在下將s2－cp8細(xì)胞在基質(zhì)膠中進(jìn)行三維培養(yǎng)并對1個視野中的s2－cp8細(xì)胞的凝聚塊的數(shù)量進(jìn)行測量的結(jié)果。(h)中示出將被檢體lc189及l(fā)b95的源自癌組織的球形體(cancertissue－originatedspheroid，ctos)用抗dkk1抗體或抗ckap4抗體和蘇木精免疫染色后的結(jié)果。(i)中示出將被檢體lc189及l(fā)b95的ctos在抗ckap4抗體或抗gst抗體的存在下進(jìn)行增殖試驗(yàn)的結(jié)果。圖13：(a)的左圖中示出從上部觀察皮下注入s2－cp8細(xì)胞的裸鼠的結(jié)果及觀察從該裸鼠摘取的異種腫瘤組織片的結(jié)果。(a)的右圖中示出測定抗體注入后14天內(nèi)的異種腫瘤組織片的腫瘤體積變化和最終重量的結(jié)果。(b)的左圖中示出從上部觀察皮下注入a549細(xì)胞的裸鼠的結(jié)果及觀察從該裸鼠摘取的異種腫瘤組織片的結(jié)果。(b)的右圖中示出測定抗體注入后25天內(nèi)的異種腫瘤組織片的腫瘤體積變化和最終重量的結(jié)果。圖14：示出對從各種癌細(xì)胞及正常細(xì)胞株的細(xì)胞培養(yǎng)液回收的外來體中的ckap4、tsg101及細(xì)胞溶解液(input)中的ckap4、網(wǎng)格蛋白進(jìn)行檢測的結(jié)果。具體實(shí)施方式1.抗腫瘤劑本發(fā)明的抗腫瘤劑的特征在于以抑制ckap4的表達(dá)或功能的物質(zhì)作為有效成分。以下對本發(fā)明的抗腫瘤劑進(jìn)行詳細(xì)敘述。(有效成分)在本發(fā)明的抗腫瘤劑中使用抑制ckap4的表達(dá)或功能的物質(zhì)作為有效成分。ckap4作為dkk1的受體而與腫瘤細(xì)胞的增殖調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)，并且具有使腫瘤細(xì)胞的增殖亢進(jìn)的作用。在本發(fā)明的抗腫瘤劑中，通過抑制ckap4的表達(dá)或功能，從而可以有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。ckap4是公知的跨膜型蛋白，其氨基酸序列及堿基序列式也是公知的。例如已知人ckap4的氨基酸序列為序列號1、編碼人ckap4的基因的堿基序列為序列號2。在本發(fā)明中，作為“抑制ckap4表達(dá)的物質(zhì)”，只要在藥學(xué)上被允許、且可以抑制來自編碼ckap4的dna(ckap4基因)的ckap4表達(dá)，則并無特別限制。抑制ckap4表達(dá)的物質(zhì)可以是在ckap4基因的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)、翻譯、翻譯后修飾等任意階段發(fā)揮對ckap4表達(dá)的抑制作用的物質(zhì)。作為抑制ckap4表達(dá)的物質(zhì)，具體而言，可列舉decoy核酸等抑制ckap4基因轉(zhuǎn)錄的核酸分子；sirna、shrna、dsrna等對ckap4的mrna具有rna干擾作用的rna分子或其前體；mirna、反義核酸(反義dna、反義rna)、核糖酶等抑制ckap4的mrna翻譯的核酸分子等核酸藥物。這些核酸藥物可以單獨(dú)使用1種，也可以組合使用2種以上。另外，這些核酸藥物的堿基序列可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員基于ckap4基因的堿基序列的信息利用公知的手法進(jìn)行適當(dāng)設(shè)計(jì)。在這些核酸藥物中，從在臨床應(yīng)用上的容易性等觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選列舉sirna、shrna、dsrna、mirna、反義核酸，更優(yōu)選列舉sirna、shrna。另外，在上述核酸分子為rna分子的情況下，可以是按照能夠在生物內(nèi)生成的方式設(shè)計(jì)的核酸分子。具體而言，可以是將編碼該rna分子的dna插入哺乳動物細(xì)胞用的表達(dá)載體后的核酸分子。作為此種表達(dá)載體，可列舉例如：逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、仙臺病毒等病毒載體；動物細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒等。另外，作為“抑制ckap4的功能的物質(zhì)”，只要是在藥學(xué)上被允許、且可以抑制存在于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜的ckap4的功能的物質(zhì)，則并無特別限制。作為抑制ckap4的功能的物質(zhì)，可列舉例如與ckap4特異性結(jié)合的抗體或其片段、與ckap4特異性結(jié)合的適體、抑制ckap4的功能的低分子化合物等。這些物質(zhì)可以單獨(dú)使用一種或組合使用兩種以上。在這些物質(zhì)中，優(yōu)選列舉與ckap4特異性結(jié)合的抗體或其片段。作為與ckap4特異性結(jié)合的抗體，可以為單克隆抗體或多克隆抗體中的任一種，優(yōu)選列舉單克隆抗體。另外，對于這些抗體的同種型并無特別限制，可以是igg、igm、iga等中的任一種，但優(yōu)選列舉igg。另外，在對人施予本發(fā)明的抗腫瘤劑的情況下，上述抗體優(yōu)選降低在人體內(nèi)的抗原性的抗體、具體為完全人抗體、人源化抗體、小鼠－人嵌合抗體、雞－人嵌合抗體等。其中，更優(yōu)選完全人抗體、人源化抗體。另外，由于ckap4為跨膜蛋白，因此理想的是上述抗體與ckap4的結(jié)合部位為ckap4的露出至細(xì)胞外的部位(例如若為人ckap4的情況，則為序列號1的第128～602位的區(qū)域內(nèi)的部位、優(yōu)選序列號1的第128～503位的區(qū)域內(nèi)的部位)。尤其在ckap4與dkk1的結(jié)合中需要ckap4的亮氨酸拉鏈區(qū)域(序列號1的第468～503位)，因此只要以能夠抑制與該亮氨酸拉鏈區(qū)域的dkk1結(jié)合的方式設(shè)定上述抗體與ckap4的結(jié)合部位即可。另外，作為上述抗體的片段，只要是至少具有用于特異性識別并結(jié)合靶抗原的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)的片段即可，具體而言，可列舉fab、fab＇、f(ab＇)2、scfv、scfv－fc等。上述抗體及其片段可以按照遺傳工程學(xué)上的常規(guī)方法來制作。(對象疾病)ckap4在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)、并且使腫瘤細(xì)胞的增殖亢進(jìn)，因此本發(fā)明的抗腫瘤劑可以通過抑制ckap4的表達(dá)或功能從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。因此，本發(fā)明的抗腫瘤劑可以用于癌癥的治療用途中。作為成為本發(fā)明的抗腫瘤劑的應(yīng)用對象的癌癥，并無特別限制，具體而言，可列舉肺癌、胰癌、大腸癌、結(jié)腸癌、胃癌、直腸癌、肝癌、乳癌、膀胱癌、前列腺癌、宮頸癌、頭頸部癌、膽管癌、膽嚢癌、口腔癌、舌癌、咽癌、喉癌、腦腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)腫(glioma)、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、多型性成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤等實(shí)體癌；白血病、惡性淋巴瘤等血液癌。本發(fā)明的抗腫瘤劑對表達(dá)ckap4的腫瘤細(xì)胞、尤其是表達(dá)ckap4和dkk1兩者的腫瘤細(xì)胞有效地發(fā)揮腫瘤細(xì)胞的增殖抑制效果，因此表達(dá)ckap4的癌癥、尤其表達(dá)ckap4和dkk1兩者的癌癥可以說是適合的應(yīng)用對象。在癌癥中，肺癌及胰癌以高頻率高表達(dá)ckap4及dkk1，特別適合作為本發(fā)明的抗腫瘤劑的應(yīng)用對象。癌癥中的ckap4的表達(dá)可以通過對采集的癌組織進(jìn)行組織免疫來確認(rèn)。具體而言，對采集的癌組織使用抗ckap4抗體進(jìn)行免疫染色，當(dāng)在腫瘤區(qū)域存在5％以上的確認(rèn)到ckap4表達(dá)的區(qū)域的情況下，判斷為表達(dá)ckap4。作為成為本發(fā)明的抗腫瘤劑的應(yīng)用對象的癌癥的適合例，可列舉在腫瘤區(qū)域中存在5％以上ckap4的表達(dá)區(qū)域的癌癥，更優(yōu)選列舉在腫瘤區(qū)域中存在20％以上的ckap4的表達(dá)區(qū)域的癌癥，特別優(yōu)選列舉在腫瘤區(qū)域中存在50％以上的ckap4的表達(dá)區(qū)域的癌癥。另外，癌癥中的ckap4的表達(dá)也可以從采集的癌組織回收rna并利用定量性的pcr進(jìn)行測定。此時，有無ckap4表達(dá)的判定只要以同一病例的非癌組織為指標(biāo)進(jìn)行即可。具體而言，在癌組織的細(xì)胞溶解液中的ckap4量多于同一病例的非癌組織的細(xì)胞溶解液中的ckap4量的情況下，判斷為在該癌中表達(dá)ckap4。另外，癌癥中的dkk1的表達(dá)的確認(rèn)也可以與ckap4的情況同樣利用對采集的癌組織進(jìn)行組織免疫的方法、從采集的癌組織回收rna并利用定量性的pcr進(jìn)行測定的方法等來確認(rèn)。具體而言，在對采集的癌組織使用抗dkk1抗體進(jìn)行免疫染色的情況下，當(dāng)在腫瘤區(qū)域中存在5％以上的確認(rèn)到dkk1的表達(dá)的區(qū)域時判斷為表達(dá)dkk1。作為成為本發(fā)明的抗腫瘤劑的應(yīng)用對象的癌癥的適合例，可列舉在腫瘤區(qū)域中存在5％以上的dkk1的表達(dá)區(qū)域的癌癥，更優(yōu)選列舉在腫瘤區(qū)域中存在20％以上的dkk1的表達(dá)區(qū)域的癌癥，特別優(yōu)選列舉在腫瘤區(qū)域中存在50％以上的dkk1的表達(dá)區(qū)域的癌癥。另外，在從采集的癌組織回收rna來測定dkk1的情況下，當(dāng)在癌組織的細(xì)胞溶解液中的dkk1量多于同一病例的非癌組織的細(xì)胞溶解液中的dkk1量時判斷為在該癌中表達(dá)dkk1。另外，本發(fā)明的抗腫瘤劑不僅可以對人使用，而且還可以對牛、豬、犬、貓、山羊、大鼠、小鼠、兔等哺乳動物使用，但是優(yōu)選作為人用藥品來使用。(施予方式)關(guān)于本發(fā)明的抗腫瘤劑的施予方式，只要可以得到抗腫瘤效果，則可以為經(jīng)口施予或非經(jīng)口施予中的任一種，只要根據(jù)所使用的有效成分的種類進(jìn)行適當(dāng)設(shè)定即可。作為本發(fā)明的抗腫瘤劑的施予方式，具體而言，可列舉經(jīng)口施予；注射施予(靜脈注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、對患部的局部注射等)、栓劑施予等非經(jīng)口施予。本發(fā)明的抗腫瘤劑的施予量只要根據(jù)所使用的有效成分的種類、施予形態(tài)、成為應(yīng)用對象的癌癥的種類、患者的癥狀的程度等進(jìn)行適當(dāng)設(shè)定即可。例如若為使用核酸分子作為有效成分的情況，則作為核酸分子的1次用量，只要施予通常0.01μg～1000mg/kg體重左右、優(yōu)選0.1～100μg/kg體重左右即可。另外，例如若為使用抗體、其片段或低分子化合物作為有效成分的情況，則這些物質(zhì)的1次用量只要按照每1～3周1次左右的頻率施予通常0.1mg～20mg/kg體重左右即可。本發(fā)明的抗腫瘤劑可以單獨(dú)使用，也可以與1種或2種以上的具有抗腫瘤作用的其他藥劑和/或放射線療法并用。(制劑形態(tài))本發(fā)明的抗腫瘤劑被制備成與有效成分的種類、施予形態(tài)對應(yīng)的制劑形態(tài)。作為本發(fā)明的抗腫瘤劑的制劑形態(tài)，可列舉例如片劑、膠囊劑、丸劑、散劑、顆粒劑、栓劑等固體制劑；液劑、懸濁劑、乳劑、注射劑等液狀制劑等。另外，本發(fā)明的抗腫瘤劑可以根據(jù)其制劑形態(tài)而加入藥學(xué)上所允許的載體和添加劑進(jìn)行制劑化。例如若為固體制劑的情況，則可以使用賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑等進(jìn)行制劑化。另外，若為液狀制劑的情況，則可以使用生理鹽水、緩沖液等進(jìn)行制劑化。另外，在本發(fā)明的抗腫瘤劑中，若為使用核酸分子作為有效成分的情況，則理想的是為了容易將該核酸分子轉(zhuǎn)移至腫瘤細(xì)胞內(nèi)而與核酸導(dǎo)入輔助劑一起制劑化。作為核酸導(dǎo)入輔助劑，具體而言，可列舉lipofectamine、oligofectamine、rnaifect、脂質(zhì)體、多胺、deae葡聚糖、磷酸鈣、樹狀高分子聚合物等。2.篩選方法本發(fā)明的篩選方法是對抗腫瘤劑的有效成分進(jìn)行篩選的方法，其特征在于包括：第一工序，對被檢物質(zhì)檢測ckap4的表達(dá)抑制能力或與細(xì)胞膜上的ckap4的結(jié)合能力；以及第二工序，選擇確認(rèn)到ckap4的表達(dá)抑制能力或與細(xì)胞膜上的ckap4的結(jié)合能力的被檢物質(zhì)作為抗腫瘤劑的有效成分的候補(bǔ)。以下對本發(fā)明的篩選方法進(jìn)行詳細(xì)敘述。(被檢物質(zhì))在本發(fā)明的篩選方法中，被檢物質(zhì)只要是可以成為抗腫瘤劑的有效成分的候補(bǔ)物質(zhì)即可，對其種類并無特別限制，例如可以為來自生物的物質(zhì)等天然物質(zhì)，也可以為化學(xué)合成的合成物質(zhì)。具體而言，作為被檢物質(zhì)，可列舉：低分子化合物；抗體等蛋白；sirna、shrna、dsrna、mirna、反義dna、反義rna、適體等核酸分子等。(第一工序)在本發(fā)明的篩選方法中，首先，作為第一工序，檢測ckap4的表達(dá)抑制能力或與細(xì)胞膜上的ckap4的結(jié)合能力。對檢測被檢物質(zhì)的ckap4的表達(dá)抑制能力的具體方法并不特別限制，可列舉例如進(jìn)行下述第1－a工序及第1－b工序的方法。第1－a工序：使被檢物質(zhì)與表達(dá)ckap4的細(xì)胞接觸的工序。第1－b工序：在第1－a工序后測定上述細(xì)胞中的ckap4表達(dá)量的工序。在上述第1－a工序中使用的表達(dá)ckap4的細(xì)胞只要表達(dá)ckap4，則并無特別限制，例如可以使用腫瘤細(xì)胞等內(nèi)源性表達(dá)ckap4的細(xì)胞、通過對正常細(xì)胞轉(zhuǎn)染ckap4基因而獲得ckap4表達(dá)能力的細(xì)胞等。對正常細(xì)胞的ckap4基因的轉(zhuǎn)染可以使用公知的遺傳工程學(xué)的方法來進(jìn)行。另外，在上述第1－a工序中，為了使被檢物質(zhì)與表達(dá)ckap4的細(xì)胞接觸，只要在該細(xì)胞能夠生育的培養(yǎng)基中添加該細(xì)胞和被檢物質(zhì)并在該細(xì)胞能夠生育的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)即可。另外，若為使用sirna、shrna、dsrna、mirna、反義dna、反義rna等核酸分子作為被檢物質(zhì)的情況，則為了將這些核酸分子容易導(dǎo)入到上述細(xì)胞內(nèi)而優(yōu)選使其還與核酸導(dǎo)入輔助劑共存。此種核酸導(dǎo)入輔助劑的種類如上述“1.抗腫瘤劑”一欄的例示所示。在上述第1－b工序中，上述細(xì)胞中的ckap4表達(dá)量的測定可以通過利用公知的方法測定細(xì)胞內(nèi)的ckap4的mrna量和/或ckap4量(蛋白量)來進(jìn)行。另外，對于檢測被檢物質(zhì)與細(xì)胞膜上的ckap4的結(jié)合能力的具體方法并無特別限制，可列舉例如進(jìn)行下述第1－i工序及第1－ii工序的方法。第1－i工序：使被檢物質(zhì)與表達(dá)ckap4的細(xì)胞接觸的工序。第1－ii工序：在第1－i工序后確認(rèn)被檢物質(zhì)是否與細(xì)胞膜上的ckap4結(jié)合的工序。上述第1－i工序可以利用與上述第1－a工序同樣的方法進(jìn)行。另外，在上述第1－ii工序中，對確認(rèn)被檢物質(zhì)是否與細(xì)胞膜上的ckap4結(jié)合的具體方法并無特別限制，可以通過使用公知的免疫染色法測定被檢物質(zhì)量來求得。另外，也可以通過從上述第1－i工序后的細(xì)胞回收ckap4、并測定與該ckap4結(jié)合的被檢物質(zhì)量來求得。(第二工序)在第二工序中，選擇上述第一工序中確認(rèn)到ckap4的表達(dá)抑制能力或與細(xì)胞膜上的ckap4的結(jié)合能力的被檢物質(zhì)作為抗腫瘤劑的有效成分的候補(bǔ)。具體而言，若是以ckap4的表達(dá)抑制能力為判定基準(zhǔn)的情況，與不添加被檢物質(zhì)地進(jìn)行上述第一工序時的ckap4的表達(dá)量相比，ckap4的表達(dá)量少的被檢物質(zhì)被判定為具有ckap4的表達(dá)抑制能力。另外，若是以與細(xì)胞膜上的ckap4的結(jié)合能力為判定基準(zhǔn)的情況，則確認(rèn)到與細(xì)胞膜上的ckap4結(jié)合的被檢物質(zhì)被判定為具有與細(xì)胞膜上的ckap4的結(jié)合能力。在第二工序中，確認(rèn)到ckap4的表達(dá)抑制能力或者與ckap4結(jié)合的抑制能力、與dkk1結(jié)合的抑制能力的被檢物質(zhì)具有腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用，并且被選擇作為抗腫瘤劑的有效成分的候補(bǔ)。如此選擇的被檢物質(zhì)只要在實(shí)際中檢驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞的增殖抑制作用、并且評價是否能夠作為抗腫瘤劑進(jìn)行臨床應(yīng)用即可。癌癥患者的術(shù)后的預(yù)后的檢查方法本發(fā)明的癌癥患者的術(shù)后的預(yù)后的檢查方法的特征在于，包括對從癌癥患者采集的癌組織中的ckap4及dkk1的表達(dá)進(jìn)行測定的工序。根據(jù)本發(fā)明的檢查方法，通過將從癌癥患者采集的癌組織中的ckap4及dkk1兩者的表達(dá)作為指標(biāo)，從而可以推斷癌癥患者的術(shù)后的預(yù)后。在本發(fā)明的檢查方法中，對于成為預(yù)后的檢查方法的對象的患者的癌癥的種類并無特別限制，具體而言，可列舉肺癌、胰癌、大腸癌、結(jié)腸癌、胃癌、直腸癌、肝癌、乳癌、膀胱癌、前列腺癌、宮頸癌、頭頸部癌、膽管癌、膽嚢癌、口腔癌、舌癌、咽癌、喉癌、腦腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)腫(glioma)、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、多型性成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤等實(shí)體癌；白血病、惡性淋巴瘤等血液癌。其中，作為本發(fā)明的檢查方法的檢查對象的適合例，可列舉肺癌及胰癌。在本發(fā)明的檢查方法中，從癌癥患者采集的癌組織中的ckap4表達(dá)的測定可以使用能夠檢測ckap4的試劑來進(jìn)行。作為ckap4表達(dá)的測定方法，可列舉例如對采集的癌組織使用抗ckap4抗體進(jìn)行免疫染色的方法。具體而言，在對采集的癌組織使用抗ckap4抗體進(jìn)行免疫染色、并且在腫瘤區(qū)域中存在5％以上的確認(rèn)到ckap4表達(dá)的區(qū)域的情況下，判斷為表達(dá)ckap4。進(jìn)而，ckap4表達(dá)的測定例如可以從采集的癌組織回收rna并利用定量性的pcr來進(jìn)行。此時，有無ckap4表達(dá)的判定只要以同一病例的非癌組織作為指標(biāo)來進(jìn)行即可。具體而言，在癌組織的細(xì)胞溶解液中的ckap4量多于同一病例的非癌組織的細(xì)胞溶解液中的ckap4量的情況下，判斷為在該癌癥中表達(dá)ckap4。另外，在本發(fā)明的檢查方法中，從進(jìn)一步提高患者的術(shù)后的預(yù)后的預(yù)測精度的觀點(diǎn)出發(fā)，理想的是還預(yù)先進(jìn)行從癌癥患者采集的癌組織中的dkk1表達(dá)的測定。從癌癥患者采集的癌組織中的dkk1表達(dá)的測定可以使用能夠檢測dkk1的試劑來進(jìn)行。dkk1表達(dá)的測定方法可以與ckap4的情況同樣地利用對采集的癌組織進(jìn)行組織免疫的方法、從采集的癌組織回收rna并利用定量性的pcr進(jìn)行測定的方法等來確認(rèn)。具體而言，在對采集的癌組織使用抗dkk1抗體進(jìn)行免疫染色的情況下，當(dāng)在腫瘤區(qū)域中存在5％以上的確認(rèn)到dkk1表達(dá)的區(qū)域時判斷為在該癌癥中表達(dá)dkk1。另外，在從采集的癌組織回收rna來測定dkk1的情況下，當(dāng)癌組織的細(xì)胞溶解液中的dkk1量多于同一病例的非癌組織的細(xì)胞溶解液中的dkk1量時，判斷為在該癌癥中表達(dá)dkk1。在本發(fā)明的檢查方法中確認(rèn)到ckap4及dkk1兩者的表達(dá)的癌癥的患者被推斷為術(shù)后的預(yù)后差，如總生存期短、無復(fù)發(fā)生存期短等。進(jìn)而，本發(fā)明提供用于檢測癌組織中的ckap4的試劑作為用于進(jìn)行上述檢查方法的檢查試劑盒。作為用于檢測ckap4的試劑，并無特別限制，可列舉例如抗ckap4抗體及其片段等。另外，本發(fā)明的檢查試劑盒中可以包含用于檢測癌組織中的dkk1的試劑。這些抗體可以根據(jù)需要利用生物素、熒光標(biāo)記、磁珠等進(jìn)行標(biāo)記。癌癥的檢查方法本發(fā)明的癌癥的檢查方法的特征在于包括對從被檢者采集的外來體中的ckap4進(jìn)行測定的工序。根據(jù)本發(fā)明，通過以有無從被檢者采集的外來體中的ckap4作為指標(biāo)，從而可以診斷被檢者是否罹患癌癥。在本發(fā)明的檢查方法中，對成為檢查對象的癌癥的種類并無特別限制，具體而言，可列舉肺癌、胰癌、大腸癌、結(jié)腸癌、胃癌、直腸癌、肝癌、乳癌、膀胱癌、前列腺癌、宮頸癌、頭頸部癌、膽管癌、膽嚢癌、口腔癌、舌癌、咽癌、喉癌、腦腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)腫(glioma)、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、多型性神經(jīng)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤等實(shí)體癌；白血病、惡性淋巴瘤等血液癌。其中，作為本發(fā)明的檢查方法的檢查對象的適合例，可列舉肺癌及胰癌。在本發(fā)明的檢查方法中，對外來體的來源并無特別限制，可列舉例如血清、尿等體液。其中，優(yōu)選列舉血清。從被檢者采集外來體的方法只要可以得到作為ckap4檢測用試樣使用的物質(zhì)，則并無特別限定，可以從現(xiàn)有公知的方法進(jìn)行適當(dāng)選擇。外來體的分離可以通過超離心處理來進(jìn)行，但是，更簡便而言，可以使用在商業(yè)上能夠獲得的試劑盒進(jìn)行外來體的分離。作為在商業(yè)上能夠獲得的外來體分離試劑盒，具體而言，可列舉exoquicktmexosomeprecipitation溶液、exoquick－tc等(均為systembiosciences公司制)。外來體中的ckap4可以通過使蛋白從外來體溶出并使用抗ckap4抗體等用于檢測dkk1的試劑來檢測。在本發(fā)明的檢查方法中，當(dāng)在外來體中確認(rèn)到ckap4的情況下，推測該被檢者罹患癌癥的可能性高。進(jìn)而，本發(fā)明提供用于檢測外來體中的ckap4的試劑作為用于進(jìn)行上述檢查方法的檢查試劑盒。作為用于檢測ckap4的試劑，并無特別限制，可列舉例如抗ckap4抗體及其片段等。也可以根據(jù)需要利用生物素、熒光標(biāo)記、磁珠等對抗ckap4抗體進(jìn)行標(biāo)記。另外，本發(fā)明的檢查試劑盒中可以包含用于從體液分離外來體的試劑等。實(shí)施例以下，基于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但是本發(fā)明并不受它們的限定。予以說明，以下，經(jīng)過轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有時以“x/y細(xì)胞”(例如、mdck/dkk1－flag－gpi細(xì)胞等)的形式來表示，該細(xì)胞是指對x細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)編碼蛋白y的dna后的細(xì)胞。另外，蛋白有時以“a－b”(例如dkk1－flag等)的形式來表示，該蛋白是指在肽a中融合肽b(標(biāo)簽等)的蛋白。另外，對于經(jīng)過轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，除以下說明了制作方法的細(xì)胞以外，還基于以下的制作方法進(jìn)行制作或按照公知的遺傳工程學(xué)的方法進(jìn)行制作。1.試驗(yàn)方法1－1.與dkk1結(jié)合的蛋白的分離構(gòu)建具有flag表位及在c末端側(cè)串聯(lián)插入糖基磷脂酰肌醇(gpi)錨定信號序列的dkk1基因(dkk1－flag－gpi)的慢病毒載體。對作為犬腎小管源性正常細(xì)胞的mdck細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)上述載體，在包含10μg/ml的殺稻瘟素s的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco＇smodifiedeagle＇smedium，dmem)培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)人dkk1基因(dkk1－flag－gpi；人dkk1的堿基序列如序列號3所示，dkk1－flag－gpi的堿基序列如序列號4所示)的mdck細(xì)胞(mdck/dkk1－flag－gpi細(xì)胞)的篩選。在包含鋪滿(confluent)狀態(tài)的mdck/dkk1－flag－gpi細(xì)胞的3個10cm培養(yǎng)皿中添加0.5mg/ml的sulfo－nhs－lc－biotin，在4℃下孵育30分鐘后，用包含50mm的nh4cl的1×pbs(5ml)清洗3次。接著，回收細(xì)胞，使用包含蛋白酶抑制劑(10μg/ml的leupeptin(亮肽素)及aprotinin(抑肽酶)、1mm的pmsf)的np40緩沖液(20mm的tris－h(huán)clph8.0、10％的甘油，137mm的nacl及1％的np40)1ml進(jìn)行細(xì)胞的溶解。之后，進(jìn)行10分鐘的離心分離，在回收的上清液1ml中添加蛋白g瓊脂糖珠的50％漿料20μl，在4℃下振蕩30分鐘。接著，添加抗flag抗體(novus)在4℃下振蕩30分鐘，之后，再添加蛋白g瓊脂糖珠的50％漿料40μl，在4℃下振蕩1小時。之后，對珠粒用1ml的np40緩沖液清洗3次，再用tbs(25mm的tris－h(huán)clph7.4、150mm的nacl)清洗3次。將所回收的珠粒在包含0.2mg/ml的flag肽的tbs(50μl)中以4℃進(jìn)行3次30分鐘的孵育，由此使其溶出。在溶出樣品(～150μl)中添加中性鏈親和素珠(neutravidinbead)的50％漿料40μl，邊在4℃下振蕩2小時邊進(jìn)行孵育。接著，對珠粒用1ml的np40緩沖液清洗2次，再用1ml的10mmtris－h(huán)cl(ph7.5)清洗1次后，用20μl的laemmli樣品緩沖液使結(jié)合有dkk1的復(fù)合體溶出。之后，對與dkk1結(jié)合的蛋白利用蛋白銀染色進(jìn)行檢測。從凝膠中切出17個帶(圖2的(b)中的箭頭)，利用質(zhì)譜法進(jìn)行了分析。1－2.dkk1的極性分泌將表達(dá)dkk1的mdck細(xì)胞(2×105cells)播種于transwell聚碳酸酯過濾器(corningcostarqualitybiological，gaithersburg，md，usa)。在48小時后交換培養(yǎng)基，再進(jìn)行24小時培養(yǎng)。為了檢測分泌到培養(yǎng)液中的dkk1，在從頂端側(cè)和基底側(cè)得到的培養(yǎng)液中添加藍(lán)色瓊脂糖，在4℃下孵育2小時后，進(jìn)行離心分離。接著，回收沉淀物，使用抗dkk1抗體進(jìn)行dkk1的檢測。1－3.細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)腎小管細(xì)胞mdcktypei(mdcki)使用由dr.s.tsukita(大阪大學(xué))供給的細(xì)胞，人肺腺癌細(xì)胞a549及nci－h(huán)1579使用由dr.y.shintani(大阪大學(xué))供給的細(xì)胞，人宮頸癌細(xì)胞helas3使用由dr.k.matsumoto(名古屋大學(xué))供給的細(xì)胞，人胃癌細(xì)胞ags使用由dr.m.hatakeyama(東京大學(xué))供給的細(xì)胞，kkls使用由dr.w.yasui(廣島大學(xué))供給的細(xì)胞，人肝胚細(xì)胞瘤細(xì)胞hepg2使用由dr.y.matsuura(大阪大學(xué))供給的細(xì)胞，人肺腺癌細(xì)胞a549、calu－6和人食道鱗狀上皮癌kyse－70及te－11使用由鹽野義制藥株式會社供給的細(xì)胞。胰癌細(xì)胞s2－cp8及suit－2購自東北大學(xué)加齡醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)用細(xì)胞資源中心。x293t細(xì)胞購自takarabio株式會社。以上所有的細(xì)胞株在包含10％胎牛血清(fbs)的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(dmem)或rpmi－1640中進(jìn)行培養(yǎng)。將本試驗(yàn)中使用的表達(dá)cdna或shrna的細(xì)胞維持在包含10％fbs及10μg/ml殺稻瘟素、或800μg/mlg418(geneticin)的dmem中。1－4.抗體本試驗(yàn)中使用的抗體如以下的表1所示。[表1]ib：免疫印跡ip：免疫沉淀if：免疫熒光ihc：免疫組織化學(xué)1－5.細(xì)胞增殖試驗(yàn)將mdcki細(xì)胞、s2－cp8細(xì)胞及a549細(xì)胞按照1×105cell/ml播種到35mm培養(yǎng)皿中。對mdcki細(xì)胞用包含10％fbs的dmem進(jìn)行培養(yǎng)。對s2－cp8細(xì)胞及a549細(xì)胞用包含1％fbs的dmem進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)過規(guī)定天數(shù)后計(jì)測細(xì)胞數(shù)。1－6.mdcki細(xì)胞、s2－cp8細(xì)胞及a549細(xì)胞的三維培養(yǎng)三維培養(yǎng)試驗(yàn)按照以往報(bào)告的內(nèi)容((matsumotoetal.，emboj，2014)來實(shí)施。為了分析基質(zhì)膠上(bdbiosciences，sanjose，ca，usa)的mdcki細(xì)胞的囊腫形成、s2－cp8細(xì)胞及a549細(xì)胞的增殖，首先，將40μl的基質(zhì)膠放置在圓形的載玻片上，在37℃下孵育30分鐘，使凝膠固化。接著，將懸浮于包含10％fbs及2％基質(zhì)膠的dmem中的mdcki細(xì)胞(3×104cells)及懸浮于包含0.1％牛血清白蛋白及2％基質(zhì)膠的dmem中的s2－cp8細(xì)胞或a549細(xì)胞(2×104cells)添加到經(jīng)固化后的基質(zhì)膠上，進(jìn)行培養(yǎng)。1－7.腫瘤移植片分析腫瘤移植片分析使用改變了以往報(bào)告的內(nèi)容(fujiietal.，oncogene，2014)的方法來進(jìn)行。將6周齡的雄balb/canncrj－nu裸鼠(charlesriverlaboratoryjapaninc，osaka，japan)用美托咪啶(0.3mg/kg體重)及咪達(dá)唑侖(4mg/kg體重)進(jìn)行麻醉后，皮下注射100μl的懸濁于磷酸緩沖液(pbs)中的s2－cp8細(xì)胞(5×106cells)或a549細(xì)胞(5×106cells)。接著，將移植21天后(s2－cp8細(xì)胞)及移植28天后(a549細(xì)胞)的裸鼠供于分析。為了評價抗體的效果，在平均腫瘤尺寸達(dá)到50mm3的時刻將裸鼠分成兩組。將抗pckap4抗體(150μg/body)或抗谷胱甘肽－s－轉(zhuǎn)移酶(gst)抗體(150μg/body)以1周2次的頻率對腹腔內(nèi)注入2周(atdays0,4,8,12)(s2－cp8細(xì)胞)及3.5周(atdays0,4,9,12,16,18,22)(a549細(xì)胞)。在自抗體施予后的第14天(s2－cp8細(xì)胞)及第25天(a549細(xì)胞)將裸鼠供于分析。對形成于移植部位的異種腫瘤組織片測定大小和重量，再將其供于免疫組織化學(xué)的分析。腫瘤的大小根據(jù)式：長徑×短徑×短徑×0.5來計(jì)算。予以說明，在本試驗(yàn)中的所有動物實(shí)驗(yàn)均在大阪大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)委員會的批準(zhǔn)(no.21－048－1)下進(jìn)行。1－8.基于sirna的蛋白表達(dá)的敲除在本試驗(yàn)中，所敲除的作為靶的蛋白的種類及其靶序列如表2所示。使用rnaimax(invitrogen，carlsbad，ca，usa)將針對靶蛋白的sirna(各20nm)的混合物轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞中。使用自轉(zhuǎn)導(dǎo)起36～48小時后的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。[表2]sirna靶序列隨機(jī)化參照cagtcgcgtttgcgactgg(序列號5)犬ckap4gcagaaggtgcagtctctt(序列號6)1－9.質(zhì)粒的構(gòu)建pcdna3myctevflag中的flag－p110α、flag－p110β及pcaggs中的p85α使用由dr.t.asano(廣島大學(xué))供給的質(zhì)粒。從a549cdna文庫擴(kuò)增ckap4cdna，所有的突變體利用一般的方法來制成。通過在由dr.h.miyoshi(理化學(xué)研究所)供給的csii－cmv－mcs－ires2－bsd中插入cdna，從而構(gòu)建慢病毒載體。使用gatewaytechnology(invitrogen)，將包含h1啟動子和shrna的寡dna片段在cs－rfa－evbsd中克隆化，構(gòu)建包含shrna的慢病毒載體。本試驗(yàn)中使用的shrna的靶蛋白及其靶序列如表3所示。[表3][表3]shrna靶序列熒光素酶gtgcgttgctagtaccaac(序列號7)人dkk1gggtttcttggaatgacga(序列號8)人ckap4gcagattaacctcagaaat(序列號9)1－10.慢病毒的擴(kuò)增及穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的制備使用fugenehd轉(zhuǎn)染試劑(rocheappliedscience，basel，switzerland)，將包裝載體(pcag－h(huán)iv－gp及pcmv－vsv－g－rsv－rev)及慢病毒載體轉(zhuǎn)染到x293t細(xì)胞中，使慢病毒擴(kuò)增。另外，在條件培養(yǎng)基及10μg/ml的聚凝胺的存在下將各慢病毒導(dǎo)入母細(xì)胞(5×104cells/wellina12－wellplate)中。將細(xì)胞以1200×g離心分離1小時，進(jìn)行回收，再培養(yǎng)24小時，由此制作穩(wěn)定地表達(dá)dkk1－flag、ckap4－h(huán)a、dkk1shrna或ckap4shrna的mdcki細(xì)胞、s2－cp8細(xì)胞及a549細(xì)胞。1－11.免疫細(xì)胞化學(xué)的分析將細(xì)胞播種到載玻片上，使用4％低聚甲醛在室溫下固定20分鐘。接著，將細(xì)胞用pbs清洗3次后，用包含1％bsa及0.05％tween－20的pbs封閉20分鐘。接著，添加一抗并孵育一整夜。用pbs清洗3次細(xì)胞后，添加熒光標(biāo)記二抗，在室溫下孵育1小時。之后，用pbs充分清洗載玻片，用包含50％甘油的pbs封入。本試驗(yàn)的操作及測定使用lsm510system(carlzeissmicroscopyco.，ltd，jena，germany)來進(jìn)行。1－12.患者及癌組織使用由在大阪大學(xué)附屬醫(yī)院于2001年4月～2015年4月接受外科手術(shù)的胰癌患者(59名)、肺腺癌患者(67名)、肺鱗狀上皮癌癥患者(61名)及肺部非典型腺瘤性增生患者(11名)切除的腫瘤組織片(標(biāo)本)進(jìn)行。僅以對任意腫瘤病變在術(shù)前均未實(shí)施化學(xué)療法及放射線療法的患者作為對象。胰癌患者的年齡為47～83歲，平均年齡為70歲。肺腺癌患者的年齡為39～85歲，平均年齡為68歲。肺鱗狀上皮癌癥患者的年齡為38～82歲，平均年齡為71歲。肺部非典型腺瘤性增生患者的年齡為58～78歲，平均年齡為67歲。用顯微鏡對所切除的各標(biāo)本進(jìn)行觀察，測定腫瘤的定位和尺寸，將標(biāo)本用10體積％福爾馬林固定，制作石蠟包埋塊，進(jìn)行組織學(xué)分析。試驗(yàn)中使用的標(biāo)本被切片化為4μm的厚度，并且用蘇木精及曙紅(h&e)、或免疫過氧化物酶進(jìn)行染色，供于各分析。本試驗(yàn)在大阪大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理審查委員會的批準(zhǔn)(no.13455)下進(jìn)行。1－13.胰癌、肺腺癌、肺鱗狀上皮癌、肺部非典型腺瘤性增生組織中的dkk1、ckap4及pakt的免疫組織化學(xué)的分析免疫組織化學(xué)的分析使用改變了以往報(bào)告的內(nèi)容(fujiietal.，oncogene，2014)的方法來進(jìn)行。具體的方法的概要如以下所示。首先，使用dakorealtmenvisiontmdetectionsystem(dako，carpentaria，ca，usa)，按照該制造商推薦的方法，對所有的組織切片進(jìn)行染色。具體而言，首先，使用pascal壓力室(dako公司制)進(jìn)行抗原激活，使dakorealperoxidase－blockingsolution反應(yīng)5分鐘，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。接著，對組織切片使用抗dkk1抗體(1：100)、抗ckap4抗體(1：100)或pakt抗體(1：50)在4℃下處理16小時。之后，在組織切片上添加辣根過氧化物酶(hrp)標(biāo)記的山羊抗小鼠igg，孵育1小時后，添加二氨基聯(lián)苯胺(dab)(dako)。接著，對組織切片用0.1％(w/v)的蘇木精進(jìn)行對比染色。將染色超過5％的區(qū)域的腫瘤分類為dkk1陽性或ckap4陽性。1－14.統(tǒng)計(jì)分析統(tǒng)計(jì)分析使用jmpsoftware(sasinstitute.inc.，carync，usa)來進(jìn)行。關(guān)于結(jié)果的差異，術(shù)后無復(fù)發(fā)生存期及總生存期的研究依照kaplan－meier法并采用log－rank檢驗(yàn)。關(guān)于dkk1、ckap4及dkk1與ckap4的表達(dá)的相關(guān)關(guān)系，各檢驗(yàn)間的相關(guān)關(guān)系利用蒙特卡羅模擬(montecarlosimulation)來計(jì)算，并且將檢驗(yàn)間的相關(guān)關(guān)系納入考慮中來計(jì)算多重校正系數(shù)，以原始的p值乘以多重校正系數(shù)這樣的方法來對應(yīng)多重性。其他檢驗(yàn)中，使用studentt檢驗(yàn)或mann–whitneyu檢驗(yàn)來檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性。在p值不足0.05的情況下，視為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著性差異。2.試驗(yàn)結(jié)果2－1.dkk1給細(xì)胞的增殖能力帶來的影響在表達(dá)dkk1基因(dkk1－flag)的mdck細(xì)胞中確認(rèn)到表達(dá)c末端側(cè)被flag標(biāo)簽化的dkk1的結(jié)果如圖1的(a)的上圖所示。圖1的(a)所示的參照為使用作為母細(xì)胞的mdck細(xì)胞的結(jié)果。另外，hsp90作為內(nèi)部參照使用。圖1的(a)的下圖為對在transwell聚碳酸酯過濾器上培養(yǎng)出的mdck/dkk1－flag細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，確立頂?shù)讟O性后，分成頂端側(cè)和側(cè)底側(cè)來分析dkk1表達(dá)的結(jié)果。圖1的(a)的下圖中，ap是指頂端側(cè)，bl是指基底側(cè)。由該結(jié)果可以確認(rèn)：在轉(zhuǎn)導(dǎo)dkk1基因(dkk1－flag)的mdck細(xì)胞(mdck/dkk1－flag細(xì)胞)中穩(wěn)定地表達(dá)c末端側(cè)被flag標(biāo)簽化的dkk1，在極化的mdck細(xì)胞中頂上側(cè)顯著地分泌dkk1－flag。另外，將mdck/dkk1－flag細(xì)胞固定化在transwell聚碳酸酯過濾器上、并且將細(xì)胞用抗dkk1抗體(綠色)、抗e－鈣粘蛋白抗體(紅色)及draq5dnadye(藍(lán)色)染色的結(jié)果如圖1的(b)所示。e－鈣粘蛋白作為側(cè)底膜的標(biāo)記物使用。圖1的(b)中，ap是指頂端側(cè)，bl是指側(cè)底側(cè)，比例尺為20μm。由該結(jié)果可以確認(rèn)：在mdck/dkk1－flag細(xì)胞中dkk1－flag定位于頂端膜。將胎生第13天(daye13)小鼠的腎臟的組織切片進(jìn)行石蠟包理、并且用抗dkk1抗體免疫染色后的結(jié)果如圖1的(c)所示。圖1的(c)的右上圖為左上圖的框內(nèi)的放大圖。圖1的(c)的右上圖所示的比例尺為100μm。圖1的(c)的下圖中示出將該組織片用抗dkk1抗體(綠色)及抗apkc抗體(紅色)免疫染色后的結(jié)果。apkc為頂端側(cè)膜的標(biāo)記物。圖1的(c)的白箭頭表示定位于頂端側(cè)膜的dkk1。圖1的(c)的下圖所示比例尺為20μm。由該結(jié)果可知：dkk1在胎兒腎的輸尿管中表達(dá)于頂上側(cè)。將mdck/dkk1－flag細(xì)胞在基質(zhì)膠上三維培養(yǎng)5天。另外，作為參照，使用野生型mdck細(xì)胞。對所形成的囊腫的外徑進(jìn)行了測定(n＝50)。其結(jié)果如圖1的(d)所示。另外，將在基質(zhì)膠上三維培養(yǎng)出的囊腫固定化后，用抗ki67抗體(綠色)、抗apkc抗體(紅色)及draq5dnadye(藍(lán)色)進(jìn)行染色。其結(jié)果如圖1的(e)所示。ki67陽性率按照在各囊腫中被ki67染色的細(xì)胞數(shù)相對于被draq5染色的細(xì)胞數(shù)的比例來計(jì)算(n＝50)。圖1的(d)及(e)中，中央值為粗線，框體為25th～75th百分比的范圍，誤差條為5th～95th百分比的范圍，＊為p＜0.05，＊＊為p＜0.01，(d)的比例尺為100μm，(e)的比例尺為20μm。由這些結(jié)果可以確認(rèn)：mdck/dkk1－flag細(xì)胞與mdck細(xì)胞相比，增殖能力亢進(jìn)，dkk1使細(xì)胞的增殖能力亢進(jìn)。將mdck細(xì)胞在transwell聚碳酸酯過濾器上二維培養(yǎng)5天后，將250ng/ml的dkk1添加到頂端側(cè)或基底側(cè)，進(jìn)行24小時培養(yǎng)。接著，將細(xì)胞固定化后，用抗ki67抗體(紅色)及draq5dnadye(藍(lán)色)進(jìn)行染色。所得的結(jié)果如圖1的(f)所示。ki67陽性率按照被抗ki67抗體染色的細(xì)胞數(shù)相對于被核染色的細(xì)胞數(shù)的比例來計(jì)算(5個視野)。另外，結(jié)果以3次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值±s.d.來表示。圖1的(f)中，nt表示未添加dkk1的情況，ap表示在頂端側(cè)添加dkk1的情況，以及bl表示在基底側(cè)添加dkk1的情況，＊＊為p＜0.01，比例尺為20μm。由該結(jié)果可知：通過添加dkk1，從而作為細(xì)胞增殖標(biāo)記物的ki67的表達(dá)量增加，尤其在dkk1處于頂端側(cè)的情況下，ki67的表達(dá)量顯著變高。即，暗示著dkk1作用的受體存在于頂端側(cè)的可能性。將mdck/dkk1－flag細(xì)胞二維培養(yǎng)3天，對細(xì)胞數(shù)進(jìn)行了測量。所得的結(jié)果如圖1的(g)所示。予以說明，作為參照，使用mdck細(xì)胞。由該結(jié)果也可以確認(rèn)：mdck/dkk1－flag細(xì)胞與參照相比，增殖能力較高，dkk1使細(xì)胞增殖亢進(jìn)。2－2.與dkk1結(jié)合的蛋白的鑒定對處于頂端側(cè)表面的dkk1結(jié)合蛋白進(jìn)行篩選的實(shí)驗(yàn)步驟的示意圖如圖2的(a)所示。對dkk1結(jié)合蛋白進(jìn)行純化、并進(jìn)行銀染色的結(jié)果如圖2的(b)所示。對作為與dkk1－flag－gpi結(jié)合的蛋白而溶出的17個帶進(jìn)行了質(zhì)譜，結(jié)果檢測到圖2的(b)的右側(cè)的表中所示的蛋白，其中，ckap4被檢測為帶10。利用抗flag抗體使參照(野生型mdck細(xì)胞)、mdck/dkk1－flag細(xì)胞或mdck/dkk1－flag－gpi細(xì)胞的溶解液(input)免疫沉降。接著，對溶解液(input)及免疫沉降物(ip)使用抗ckap4抗體、抗lrp6抗體或抗dkk1抗體進(jìn)行ckap4、lrp6或dkk1的檢測。其結(jié)果如圖2的(c)所示。予以說明，lrp6為已知的dkk1結(jié)合蛋白，且為陽性參照。由該結(jié)果可知ckap4與lrp6同樣地同dkk1形成復(fù)合體，得出ckap4為dkk1結(jié)合蛋白這樣的以往所沒有的新見解。圖2的(d)的上圖示出本試驗(yàn)中使用的dkk1的域結(jié)構(gòu)的示意圖。圖2的(d)的上圖中，s表示信號肽區(qū)域。另外，利用抗flag抗體使參照(mdck細(xì)胞)及表達(dá)野生型dkk1－flag(wt)或缺失突變體dkk1－flag(δcrd－1、δcrd－2)的mdck細(xì)胞的溶解液(input)免疫沉降。接著，對細(xì)胞的溶解液(input)及免疫沉降物(ip)使用抗ckap4抗體、抗lrp6抗體或抗dkk1抗體進(jìn)行ckap4、lrp6或dkk1的檢測。其結(jié)果如圖2的(d)的下圖所示。由圖2的(d)的下圖可知：wt－flag和δcrd－2－flag與ckap4形成復(fù)合體，但是與δcrd－1－flag未形成復(fù)合體。與迄今的報(bào)告一致，wt－flag和δcrd－2－flag與lrp6形成了復(fù)合體，但是δcrd－2－flag和lrp6未形成復(fù)合體。因此可知dkk1經(jīng)由不同的區(qū)域與ckap4、lrp6形成復(fù)合體。圖2的(e)的上圖示出本試驗(yàn)中使用的ckap4的域結(jié)構(gòu)的示意圖。在圖2的(e)的上圖中，icd表示細(xì)胞內(nèi)域，ecd表示細(xì)胞外域，e表示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)錨定域，mb表示微管結(jié)合域，m表示跨膜域，t表示酪氨酸硫酸化區(qū)域，lz表示亮氨酸拉鏈區(qū)域，α表示α螺旋區(qū)域。利用抗flag抗體使瞬時表達(dá)野生型ckap4－h(huán)a(wt)或缺失突變體ckap4－h(huán)a(ecd、δc1、δc2、δc3)的x293t/dkk1－flag細(xì)胞的溶解液(input)免疫沉降。接著，用抗ha抗體或抗dkk1抗體對細(xì)胞的溶解液(input)及免疫沉降物(ip)進(jìn)行探測。其結(jié)果如圖2的(e)的左下圖所示。由該結(jié)果可知：在ckap4的細(xì)胞外區(qū)域中，dkk1與δc1形成復(fù)合體，但是不與δc2、δc3形成復(fù)合體。即，暗示著dkk1的n端側(cè)與ckap4的亮氨酸拉鏈區(qū)域結(jié)合的可能性。進(jìn)而，與上述同樣地利用抗flag抗體使瞬時表達(dá)野生型ckap4－h(huán)a(wt)或缺失突變體ckap4－h(huán)a(δlz)的x293t/dkk1－flag細(xì)胞的溶解液(input)免疫沉降后，使用抗ha抗體或抗dkk1抗體對細(xì)胞的溶解液(input)及免疫沉降物(ip)進(jìn)行ha及dkk1的檢測。其結(jié)果如圖2的(e)的右下圖所示。由該結(jié)果可知：dkk1不與δlz形成復(fù)合體。即，確認(rèn)到dkk1與ckap4的結(jié)合需要dkk1的n端側(cè)的crd－1區(qū)域和ckap4的亮氨酸拉鏈區(qū)域。準(zhǔn)備在ckap4的細(xì)胞外域(ecd)(序列號1所示的氨基酸序列的128～602位)的n末端連結(jié)有谷胱甘肽－s－轉(zhuǎn)移酶(gst)的多肽(gst－ckap4－ecd)(細(xì)胞內(nèi)域缺失的突變體)。在np40緩沖液500μl中使0.5nm的gst－ckap4－ecd或0.5nm的gst與0～16nm的dkk1(r&dsystems)在4℃下反應(yīng)2小時。接著，利用離心分離回收gst－ckap4－ecd及gst，用np40緩沖液清洗3次。使用抗dkk1抗體對所得的沉淀物進(jìn)行dkk1的檢測。其結(jié)果如圖3的(a)及(b)所示。由該結(jié)果可以確認(rèn)到dkk1與ckap4的細(xì)胞外域直接結(jié)合。2－3.dkk1給mdck細(xì)胞的akt磷酸化及增殖促進(jìn)帶來的影響的確認(rèn)使針對圖4的(a)所示的各種蛋白的抗體與mdck細(xì)胞(wt)、mdck/dkk1－flag細(xì)胞(dkk1－flag)或mdck/dkk1－gpi1－flag細(xì)胞(dkk1－flag－gpi)的溶解液反應(yīng)。其結(jié)果為：如圖4的(a)所示，在mdck細(xì)胞中，通過過量地表達(dá)dkk1，從而促進(jìn)akt的磷酸化，但是未確認(rèn)到erk1/2、jnk、src的磷酸化的亢進(jìn)。即，暗示著dkk1將akt活化。將mdck細(xì)胞用1nm的諾考達(dá)唑處理24小時后，用包含250ng/ml的dkk1的調(diào)整液或不包含dkk1的調(diào)整液對mdck細(xì)胞刺激60分鐘。在自刺激開始的0、10、30及60分鐘后回收細(xì)胞，制作細(xì)胞的溶解液。接著，使用抗pakt抗體、抗akt抗體及抗網(wǎng)格蛋白抗體對細(xì)胞的溶解液進(jìn)行pakt、akt及網(wǎng)格蛋白的檢測。網(wǎng)格蛋白作為內(nèi)部參照使用。所得的結(jié)果如圖4的(b)所示。由該結(jié)果顯示在dkk1的存在下會促進(jìn)mdck細(xì)胞的akt的磷酸化，暗示著dkk1時間依賴性地將akt活化。對mdck細(xì)胞(參照)或mdck/dkk1－flag細(xì)胞(dkk1－flag)轉(zhuǎn)導(dǎo)參照sirna或ckap4sirna。對所得的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖試驗(yàn)。所得的結(jié)果如圖4的(c)所示。由該結(jié)果可以確認(rèn)：在表達(dá)dkk1的細(xì)胞中抑制ckap4表達(dá)時確認(rèn)到細(xì)胞增殖能力的降低，dkk1經(jīng)由ckap4使細(xì)胞增殖亢進(jìn)。對mdck細(xì)胞(參照)或mdck/dkk1－flag細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)參照sirna或ckap4sirna。制作所得的細(xì)胞的溶解液，使針對圖4的(d)所示的各種蛋白的抗體與該溶解液反應(yīng)，進(jìn)行該各種蛋白的檢測。所得的結(jié)果如圖4的(d)所示。該結(jié)果為：在表達(dá)dkk1的情況下，通過抑制ckap4表達(dá)，從而顯著地減少akt的磷酸化。因此，暗示著mdck細(xì)胞的akt的活化需要dkk1及ckap4。為了明確ckap4將akt活化的機(jī)制，而利用抗ckap4抗體使參照(mdck細(xì)胞)及過量表達(dá)野生型(wildtype)dkk1－flag(wt)的mdck細(xì)胞(mdck/dkk1－flag)的溶解液(input)免疫沉降。接著，使用抗p85α抗體、抗p110α抗體、抗ckap4抗體及抗dkk1抗體對細(xì)胞的溶解液(input)及免疫沉降物(ip)進(jìn)行p85α、p110α、ckap4及dkk1的檢測。其結(jié)果如圖5的(a)及(b)所示。由該結(jié)果可知：在過量表達(dá)dkk1的細(xì)胞中，ckap4與構(gòu)成pi3k的p85α及p110α結(jié)合。即，由本結(jié)果暗示著ckap4在過量表達(dá)dkk1的細(xì)胞中與pi3k結(jié)合、并使akt活化。在x293t/dkk1－flag細(xì)胞中同時表達(dá)p85α和ckap4－h(huán)a或ckap4－ecd－h(huán)a。制作所得的細(xì)胞的溶解液(input)。另外，利用抗ha抗體使所得的溶解液免疫沉降。接著，使用抗p85α抗體或抗ha抗體對細(xì)胞的溶解液(input)及免疫沉降物(ip)進(jìn)行p85α及ckap4的檢測。所得的結(jié)果如圖5的(c)所示。由該結(jié)果可知dkk1依賴性的ckap4與p85α的結(jié)合需要ckap4的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域。在x293t/dkk1－flag細(xì)胞中同時表達(dá)flag－p110β和ckap4－h(huán)a或ckap4－h(huán)aecd。制作所得的細(xì)胞的溶解液(input)。另外，利用抗ha抗體使所得的溶解液免疫沉降。接著，使用抗p110β抗體或抗ha抗體對細(xì)胞的溶解液(input)及免疫沉降物(ip)進(jìn)行p110β及ckap4的檢測。所得的結(jié)果如圖5的(d)所示。由該結(jié)果可知dkk1依賴性的ckap4與p110β的結(jié)合需要ckap4的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域。制作穩(wěn)定地表達(dá)參照shrna或dkk1shrna(dkk1)的s2－cp8細(xì)胞的溶解液(input)。另外，利用抗ckap4抗體使所得的溶解液免疫沉降。接著，使用抗p85α抗體、抗p110β抗體、抗ckap4抗體及抗dkk1抗體對細(xì)胞的溶解液(input)及免疫沉降物(ip)進(jìn)行p85α、p110β、ckap4及dkk1的檢測。其結(jié)果如圖5的(e)及(f)所示。由該結(jié)果可知在s2－cp8細(xì)胞中也dkk1依賴性地使ckap4與p85α及p110β形成復(fù)合體。在圖5的(g)的上圖中示出ckap4的脯氨酸富集區(qū)域的氨基酸序列。如圖5的(g)的上圖所示，制作編碼將ckap4的脯氨酸富集區(qū)域的脯氨酸的一部分置換為丙氨酸的ckap4的突變體(pamutant－ckap4－h(huán)a)的基因。對于轉(zhuǎn)染編碼ckap4－h(huán)a或pamutant－ckap4－h(huán)a的基因的x293t/dkk1－flag細(xì)胞的溶解液，利用抗ha抗體或非免疫抗體使其免疫沉降。使用抗p85α抗體及抗ha抗對細(xì)胞的溶解液(input)及免疫沉降物(ip)進(jìn)行p85α及ha的檢測。其結(jié)果如圖5的(g)的下圖所示。由該結(jié)果可以確認(rèn)：若將ckap4的脯氨酸富集區(qū)域中的脯氨酸置換為丙氨酸，則阻礙ckap4與pi3k的結(jié)合。在圖5的(h)的上圖中示出p85α的域結(jié)構(gòu)的示意圖。如圖5的(h)的上圖所示，制作編碼野生型的p85α(wt)(gfp－wt)、sh3域缺失的δsh3(gfp－δsh3)、sh2及ish2域缺失的δsh2(gfp－δsh)的基因。對轉(zhuǎn)染編碼gfp－wt、gfp－δsh3或gfp－δsh的基因的x293t/dkk1－flag細(xì)胞的溶解液，利用抗ckap4抗體或非免疫抗體使其免疫沉降。使用抗gfp(p85α)抗體及抗ckap4抗體對細(xì)胞的溶解液(input)及免疫沉降物(ip)進(jìn)行g(shù)fp(p85α)及ckap4的檢測。其結(jié)果如圖5的(h)的下圖所示。由該結(jié)果可知：p85α(pi3k)的sh3域與同ckap4的結(jié)合有關(guān)。2－4.培養(yǎng)細(xì)胞株中的dkk1和ckap4的表達(dá)的確認(rèn)使抗dkk1抗體、抗ckap4抗體及抗hsp90抗體與肺癌細(xì)胞(a549、calu－6及ncl－h(huán)1579)、胰癌細(xì)胞(suit－2及s2－cp8)、宮頸管癌細(xì)胞(helas3)、胃癌細(xì)胞(ags及kkls)、食道鱗狀上皮癌細(xì)胞(kyse－70及te－11)、肝胚細(xì)胞瘤細(xì)胞(hepg2)及胎兒源性腎臟細(xì)胞(x239t)的溶解液反應(yīng)，測定dkk1、ckap4及hsp90(參照)量。所得的結(jié)果如圖6所示。由該結(jié)果可以確認(rèn)：dkk1并不在正常細(xì)胞中表達(dá)，而在癌細(xì)胞的一部分中表達(dá)，另一方面，ckap4在任意細(xì)胞中均表達(dá)。2－5.胰癌、肺腺癌及肺鱗狀上皮癌中的腫瘤組織特異性的dkk1及ckap4的表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)關(guān)系的確認(rèn)對從胰癌患者摘取的胰癌組織(n＝59)用抗dkk1抗體或抗ckap4抗體和蘇木精免疫染色的結(jié)果如圖7的(a)的左圖所示。圖7的(a)的左上圖中以框包圍的區(qū)域?yàn)槟[瘤區(qū)域的放大圖像，右上圖中以框包圍的區(qū)域?yàn)榉悄[瘤區(qū)域的放大圖像。圖7的(a)的左圖中的比例尺為50μm。另外，在圖7的(a)的右圖中，將腫瘤區(qū)域中表達(dá)dkk1或ckap4的區(qū)域?yàn)?％以上且不足20％的病例設(shè)為low，將20％以上且不足50％的病例設(shè)為medium，將50％以上的病例設(shè)為high。5％以下的表達(dá)設(shè)為negative。由該結(jié)果可以確認(rèn)：在胰癌病例中dkk1以76.3％的高頻率進(jìn)行表達(dá)，ckap4以66.1％的高頻率進(jìn)行表達(dá)。進(jìn)而，在圖7的(b)及(c)中示出基于有無dkk1和ckap4的表達(dá)對各被檢體進(jìn)行分類、并對術(shù)后天數(shù)與總生存率及無復(fù)發(fā)生存率的關(guān)系進(jìn)行分析的結(jié)果。由這些結(jié)果可知：在表達(dá)dkk1和ckap4兩者的胰癌患者中確認(rèn)到術(shù)后總生存期及無復(fù)發(fā)生存期的縮短。用抗dkk1抗體或抗ckap4抗體和蘇木精對肺腺癌組織(n＝67)進(jìn)行免疫染色的結(jié)果如圖8的(a)的左圖所示。圖8的(a)的左圖中以框包圍的區(qū)域?yàn)槟[瘤區(qū)域及非腫瘤區(qū)域的放大圖像。圖8的(a)的左圖中的比例尺為100μm。另外，在圖8的(a)的右圖中，將腫瘤區(qū)域中表達(dá)dkk1或ckap4的區(qū)域?yàn)?％以上且不足20％的病例設(shè)為low，將20％以上且不足50％的病例設(shè)為medium，將50％以上的病例設(shè)為high。5％以下的表達(dá)設(shè)為negative。由該結(jié)果可以確認(rèn)：在肺腺癌病例中也是dkk1以79.1％的高頻率進(jìn)行表達(dá)，ckap4以74.6％的高頻率進(jìn)行表達(dá)。進(jìn)而，在圖8的(b)中示出基于有無dkk1和ckap4的表達(dá)對各被檢體進(jìn)行分類、并對術(shù)后天數(shù)與無復(fù)發(fā)生存率的關(guān)系進(jìn)行分析的結(jié)果。由這些結(jié)果可知：在表達(dá)dkk1和ckap4兩者的肺腺癌患者中確認(rèn)到無復(fù)發(fā)生存期的縮短。進(jìn)而，將從肺鱗狀上皮癌癥患者摘取的肺鱗狀上皮癌組織(n＝61)用抗dkk1抗體或抗ckap4抗體和蘇木精免疫染色后的結(jié)果如圖8的(c)的左圖所示。圖8的(c)的左圖中以框包圍的區(qū)域?yàn)槟[瘤區(qū)域及非腫瘤區(qū)域的放大圖像。圖8的(c)的左圖中的比例尺為100μm。另外，在圖8的(c)的右圖中，將腫瘤區(qū)域中表達(dá)dkk1或ckap4的區(qū)域?yàn)?％以上且不足20％的病例設(shè)為low，將20％以上且不足50％的病例設(shè)為medium，將50％以上的病例設(shè)為high。5％以下的表達(dá)設(shè)為negative。由這些結(jié)果可以確認(rèn)：在肺鱗狀上皮癌中也是dkk1以73.8％的高頻率進(jìn)行表達(dá)，ckap4以768.9％的高頻率進(jìn)行表達(dá)。進(jìn)而，在圖8的(d)中示出基于有無dkk1和ckap4的表達(dá)對各被檢體進(jìn)行分類、并對術(shù)后天數(shù)與無復(fù)發(fā)生存率的關(guān)系進(jìn)行分析的結(jié)果。由這些結(jié)果可知：在表達(dá)dkk1和ckap4兩者的肺鱗狀上皮癌癥患者中確認(rèn)到無復(fù)發(fā)生存期的縮短。另外，利用抗dkk1抗體或抗ckap4抗體和蘇木精對顯示肺部非典型腺瘤性增生(aah)的肺組織(n＝11)進(jìn)行免疫染色的結(jié)果如圖8的(e)的左圖所示。在圖8的(e)的左圖中以框包圍的區(qū)域?yàn)槟[瘤區(qū)域及非腫瘤區(qū)域的放大圖像。圖8的(e)的左圖中的比例尺為100μm。另外，在圖8的(e)的右圖中，將aah中表達(dá)dkk1或ckap4的區(qū)域?yàn)?％以上且不足20％的病例設(shè)為low，將20％以上且不足50％的病例設(shè)為middle，將50％以上的病例設(shè)為high。5％以下的表達(dá)設(shè)為negative。基于該結(jié)果，在aah中，即使在dkk1陽性下，ckap4也為陰性，若認(rèn)為aah為癌前期病變，則暗示著ckap4的表達(dá)伴隨著從肺癌的癌前期病變向癌癥的轉(zhuǎn)移的可能性。2－6.人胰癌、人肺腺癌及人肺鱗狀上皮癌中的dkk1及ckap4的表達(dá)與akt活化的確認(rèn)利用抗dkk1抗體、抗ckap4抗體或抗pakt抗體和蘇木精對人胰癌、人肺腺癌及人肺鱗狀上皮癌的各癌組織進(jìn)行免疫染色。所得的結(jié)果如圖9所示。圖9中，黑色的框體表示放大圖像，比例尺為200μm。由該結(jié)果可以確認(rèn)：在供于試驗(yàn)的人胰癌、人肺腺癌及人肺鱗狀上皮癌中，表達(dá)dkk1及ckap4的腫瘤區(qū)域中akt被活化。2－7.dkk1－ckap4信號給癌細(xì)胞的增殖帶來的影響的確認(rèn)對s2－cp8細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)參照shrna、dkk1shrna、dkk1shrna及dkk1－flag、ckap4shrna、或者ckap4shrna及ckap4－h(huán)a。制作所得的細(xì)胞的溶解液，使用針對圖10的(a)的上圖所示的各種蛋白的抗體對該溶解液進(jìn)行該各蛋白的檢測。另外，對所得的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖試驗(yàn)。所得的結(jié)果如圖10的(a)的下圖所示。由該結(jié)果可以確認(rèn)：通過在s2－cp8細(xì)胞中抑制dkk1或ckap4的表達(dá)，從而阻礙akt的活性，使細(xì)胞增殖能力降低，通過使各細(xì)胞過量表達(dá)dkk1或ckap4，從而可以恢復(fù)akt的活性和細(xì)胞增殖。對a549細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)參照shrna、dkk1shrna、dkk1shrna及dkk1－flag、ckap4shrna、或者ckap4shrna及ckap4－h(huán)a。制作所得的細(xì)胞的溶解液，使用針對圖10的(b)的上圖所示的各種蛋白的抗體對該溶解液進(jìn)行該各蛋白的檢測。另外，對所得的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖試驗(yàn)。所得的結(jié)果如圖10的(b)的下圖所示。由該結(jié)果可以確認(rèn)：通過在a549細(xì)胞中抑制dkk1或ckap4的表達(dá)，從而阻礙akt的活性，使細(xì)胞增殖能力降低，通過使各細(xì)胞過量表達(dá)dkk1或ckap4，從而可以恢復(fù)akt的活性和細(xì)胞增殖。將表達(dá)參照shrna、dkk1shrna、dkk1shrna及dkk1－flag、ckap4shrna、或者ckap4shrna及ckap4－h(huán)a的s2－cp8細(xì)胞(2×104cells)或a549細(xì)胞(2×104cells)在基質(zhì)膠上三維培養(yǎng)5天。測定每1mm2的細(xì)胞凝聚塊數(shù)(5個視野)。所得的結(jié)果如圖10的(c)及(d)所示。由該結(jié)果可以確認(rèn)：抑制dkk1或ckap4的表達(dá)的s2－cp8細(xì)胞及a549細(xì)胞與參照相比，細(xì)胞凝聚塊數(shù)降低，通過抑制dkk1或ckap4的表達(dá)，從而抑制腫瘤形成，通過使各細(xì)胞過量表達(dá)dkk1或ckap4，從而可以恢復(fù)腫瘤形成。在裸鼠的背部皮下注入表達(dá)參照shrna、ckap4shrna、或者ckap4shrna及ckap4－h(huán)a的s2－cp8細(xì)胞(5×106cells)。21天后，對裸鼠的移植部位的異種腫瘤組織片進(jìn)行分析。所得的結(jié)果如圖11的(a)所示。圖11的(a)的左圖中示出從上部觀察21天后的裸鼠的結(jié)果及觀察所摘取的異種腫瘤組織片的結(jié)果。在圖11的(a)中，虛線表示異種腫瘤組織片的輪廓，比例尺為10mm。另外，圖11的(a)的中圖中示出測定腫瘤組織片的大小的結(jié)果，右圖中示出測定異種腫瘤組織片的重量的結(jié)果。在圖11的(a)的右圖中，中央值為粗線，框體為25th～75th百分比的范圍，誤差條為5th～95th百分比的范圍，＊為p＜0.05，＊＊為p＜0.01。由該結(jié)果可以確認(rèn)：通過抑制ckap4的表達(dá)，從而可以降低s2－cp8細(xì)胞的腫瘤形成能力，并且通過過量表達(dá)ckap4而得到恢復(fù)。對裸鼠的背部皮下注入表達(dá)參照shrna、ckap4shrna、或者ckap4shrna及ckap4－h(huán)a的a549細(xì)胞(5×106cells)。28天后對裸鼠的移植部位的異種腫瘤組織片進(jìn)行了分析。所得的結(jié)果如圖11的(b)所示。圖11的(b)的左圖中示出從上部觀察28天后的裸鼠的結(jié)果及觀察所摘取的異種腫瘤組織片的結(jié)果。在圖11的(b)中，虛線表示異種腫瘤組織片的輪廓，比例尺為10mm。另外，圖11的(b)的中圖中示出測定腫瘤組織片的大小的結(jié)果，右圖中示出測定異種腫瘤組織片的重量的結(jié)果。在圖11的(b)的右圖中，中央值為粗線，框體為25th～75th百分比的范圍，誤差條為5th～95th百分比的范圍，＊為p＜0.05，＊＊為p＜0.01。由該結(jié)果可以確認(rèn)：通過抑制ckap4的表達(dá)，從而可以降低a549細(xì)胞的腫瘤形成能力，并且通過過量表達(dá)ckap4而得到恢復(fù)。對裸鼠的背部皮下注入表達(dá)參照shrna或dkk1shrna的s2－cp8細(xì)胞(5×106cells)。21天后對裸鼠的移植部位的異種腫瘤組織片進(jìn)行分析。所得的結(jié)果如圖11的(c)所示。圖11的(c)的左圖中示出從上部觀察21天后的裸鼠的結(jié)果及觀察所摘取的異種腫瘤組織片的結(jié)果。在圖11的(c)中，虛線表示異種腫瘤組織片的輪廓，比例尺為10mm。另外，圖11的(a)的中圖中示出測定腫瘤組織片的大小的結(jié)果，右圖中示出測定異種腫瘤組織片的重量的結(jié)果。在圖11的(a)的右圖中，中央值為粗線，框體為25th～75th百分比的范圍，誤差條為5th～95th百分比的范圍，＊為p＜0.05，＊＊為p＜0.01。由該結(jié)果可以確認(rèn)：通過抑制dkk1的表達(dá)，從而可以降低s2－cp8細(xì)胞的腫瘤形成能力。對裸鼠的背部皮下注入表達(dá)參照shrna或dkk1shrna的a549細(xì)胞(5×106cells)。28天后對裸鼠的移植部位的異種腫瘤組織片進(jìn)行了分析。所得的結(jié)果如圖11的(d)所示。圖11的(d)的左圖中示出從上部觀察28天后的裸鼠的結(jié)果及觀察所摘取的異種腫瘤組織片的結(jié)果。在圖11的(d)中，虛線表示異種腫瘤組織片的輪廓，比例尺為10mm。另外，圖11的(d)的中圖中示出測定腫瘤組織片的大小的結(jié)果，右圖中示出測定異種腫瘤組織片的重量的結(jié)果。在圖11的(d)的右圖中，中央值為粗線，框體為25th～75th百分比的范圍，誤差條為5th～95th百分比的范圍，＊為p＜0.05，＊＊為p＜0.01。由該結(jié)果可以確認(rèn)：通過抑制dkk1的表達(dá)，從而可以降低a549細(xì)胞的腫瘤形成能力。2－8.利用抗ckap4抗體的dkk1與ckap4的結(jié)合阻礙效果的確認(rèn)和表達(dá)dkk1及ckap4的癌細(xì)胞的增殖抑制效果的確認(rèn)圖12的(a)的左圖中示出多克隆抗ckap4抗體(ckap4pab)的抗原部位。制作s2－cp8細(xì)胞(參照)、或表達(dá)ckap4cdna或ckap4shrna的s2－cp8細(xì)胞的溶解液，使用抗ckap4抗體對該溶解液進(jìn)行ckap4的檢測。所得的結(jié)果如圖12的(a)的右圖所示。由該結(jié)果可以確認(rèn)：在表達(dá)ckap4cdna的s2－cp8細(xì)胞中，ckap4的表達(dá)量與參照相比有所增加，在表達(dá)ckap4shrna的s2－cp8細(xì)胞中，與參照相比，可以抑制ckap4的表達(dá)量。因此，暗示著所制作的ckap4抗體起到正向作用。將編碼膠原的在載玻片上增殖的s2－cp8細(xì)胞在未固定狀態(tài)下用抗ckap4抗體(綠色)染色。另外，將肌動蛋白細(xì)胞骨架及核用鬼筆環(huán)肽(phalloidin)(紅色)及draq5dnadye(藍(lán)色)進(jìn)行染色。所得的結(jié)果如圖12的(b)所示。由該結(jié)果可以確認(rèn)在s2－cp8細(xì)胞的細(xì)胞膜中強(qiáng)烈表達(dá)ckap4。另外，在np40緩沖液500μl中，將2nm的gst－ckap4－ecd與20nm的抗ckap4抗體(圖12的(a)所示的以ckap4的細(xì)胞外域?yàn)榭乖课坏耐每筩kap4多克隆抗體)或抗gst抗體混合后，添加2.5nm的dkk1，孵育2小時。使用抗dkk1抗體對所得的沉淀物進(jìn)行dkk1的檢測。所得的結(jié)果如圖12的(c)所示。由該結(jié)果可以確認(rèn)到通過抗ckap4抗體，dkk1與ckap4的結(jié)合被阻礙。將mdck細(xì)胞用1nm的諾考達(dá)唑處理24小時后，與25μg/ml的抗ckap4抗體或抗gst抗體一起孵育4小時。接著，將細(xì)胞在抗ckap4抗體或抗gst抗體的存在下用250ng/mldkk1或1nm胰島素刺激30分鐘。之后，回收細(xì)胞，制作細(xì)胞的溶解液，使用抗pakt抗體、抗akt抗體及抗網(wǎng)格蛋白抗體對該溶解液進(jìn)行pakt、akt及網(wǎng)格蛋白的檢測?？筭st抗體作為參照使用，網(wǎng)格蛋白作為內(nèi)部參照使用。所得的結(jié)果如圖12的(d)所示。由該結(jié)果可以確認(rèn)：抗ckap4抗體抑制dkk1依賴性的akt的活化，但是不影響胰島素依賴性的akt的活性。將s2－cp8細(xì)胞或a549細(xì)胞與5μg/ml的抗ckap4抗體或抗gst抗體一起孵育4小時。之后，回收細(xì)胞，制作細(xì)胞的溶解液，使用抗pakt抗體、抗akt抗體及抗網(wǎng)格蛋白抗體對該溶解液進(jìn)行pakt、akt及網(wǎng)格蛋白的檢測?？筭st抗體作為參照使用，網(wǎng)格蛋白作為內(nèi)部參照使用。所得的結(jié)果如圖12的(e)所示。由該結(jié)果可以確認(rèn)到抗ckap4抗體抑制癌細(xì)胞的akt的活化。在抗gst抗體5μg/ml或抗ckap4抗體5μg/ml的存在下，將s2－cp8細(xì)胞(2×104cells)或a549細(xì)胞(2×104cells)在基質(zhì)膠上三維培養(yǎng)5天，測定每1個視野中的細(xì)胞凝聚塊數(shù)(5個視野)。抗gst抗體作為參照使用。所得的結(jié)果如圖12的(f)所示。＊＊為p＜0.01。由該結(jié)果可以確認(rèn)：抗ckap4抗體使s2－cp8細(xì)胞及a549細(xì)胞中細(xì)胞凝聚塊數(shù)降低，抗ckap4抗體可以抑制s2－cp8細(xì)胞及a549細(xì)胞的invitro(體外)腫瘤形成能力。進(jìn)而，在抗gst抗體25μg/ml、抗ckap4抗體12.5μg/ml或抗ckap4抗體25μg/ml的存在下，將s2－cp8細(xì)胞(2×104cells)在基質(zhì)膠上三維培養(yǎng)7天，測量每1mm2中的細(xì)胞凝聚塊數(shù)。所得的結(jié)果如圖12的(g)所示。圖12的(g)的上圖的比例尺為200μm。另外，在圖12的(g)的下圖中，平均值為粗線，框體為25th～75th百分比的范圍，誤差條為5th～95th百分比的范圍，＊＊為p＜0.01。由該結(jié)果還可以確認(rèn)：抗ckap4抗體可以抑制s2－cp8細(xì)胞的invitro(體外)腫瘤形成能力。由大阪府立成人病中心提供來自2名經(jīng)得同意的癌癥患者的外科檢體或胸水。使2個被檢體(lc189及l(fā)b95)進(jìn)行機(jī)械性地酶分散，回收40～250μm的組織片，用stemprohesc(invitrogen，carlsbad，ca)進(jìn)行浮游培養(yǎng)，得到源自癌組織的球形體(cancertissue－originatedspheroid，ctos)。將所得的ctos移植于nod/scid小鼠，對其進(jìn)行飼養(yǎng)，形成小鼠的移植部位的移植腫瘤。之后，對由移植腫瘤制作的切片用抗dkk1抗體或抗ckap4抗體和蘇木精進(jìn)行免疫染色。所得的結(jié)果如圖12的(h)所示。其結(jié)果可以確認(rèn)：被檢體lc189的移植腫瘤中dkk1及ckap4的表達(dá)量均高，在被檢體lb95的移植腫瘤中未確認(rèn)到dkk1及ckap4的表達(dá)。接著，從上述所得的移植腫瘤再度地分離并凍結(jié)保存ctos后，將其融解，之后供于以下的增殖試驗(yàn)。增殖試驗(yàn)具體如下：將ctos埋入低生長因子基質(zhì)膠(matrigelgrowthfactorreduced，gfr)(bdbiosciences，bedford，ma)，在包含各濃度的抗ckap4抗體或抗gst抗體的stemprohesc培養(yǎng)基中在37℃下培養(yǎng)7天。在培養(yǎng)期間，用imagej.(nationalinstitutesofhealth，bethesda，md)測量ctos的面積，求出相對于培養(yǎng)開始時的ctos的面積而言的培養(yǎng)7天后的ctos的面積(未添加抗體的條件為n＝6、添加抗體的條件為n＝12)。所得的結(jié)果如圖12的(i)所示。圖12的(i)中，＊＊為p＜0.01，＊＊＊為p＜0.001?；谠摻Y(jié)果，在dkk1及ckap4的表達(dá)量低的被檢體lb95的ctos中，即使在抗ckap4抗體的存在下也未確認(rèn)到增殖抑制效果，但是在dkk1及ckap4的表達(dá)量高的被檢體lc189的ctos中，在抗ckap4抗體的存在下顯著地獲得增殖抑制效果。對裸鼠的背部皮下注入人胰癌細(xì)胞(s2－cp8)(5×106cells)或人肺癌細(xì)胞(a549)(5×106cells)。在平均腫瘤尺寸達(dá)到50mm3的時刻將裸鼠隨機(jī)分為兩組。將抗pckap4抗體(150μg/body)(n＝6)或抗谷胱甘肽－s－轉(zhuǎn)移酶(gst)抗體(150μg/body)(n＝6)按照1周2次的頻率，針對s2－cp8細(xì)胞時，腹腔內(nèi)注入2周(atdays0,4,8,12)，針對a549細(xì)胞時，腹腔內(nèi)注入3.5周(atdays0,4,9,12,16,18,22)。就s2－cp8細(xì)胞而言，在14天后分析裸鼠的移植部位的異種腫瘤組織片，就a549細(xì)胞而言，在25天后分析裸鼠的移植部位的異種腫瘤組織片。在人胰癌細(xì)胞(s2－cp8)的情況下的結(jié)果如圖13的(a)所示，在人肺癌細(xì)胞(a549)(5×106cells)的情況下的結(jié)果如圖13的(b)所示。圖13的(a)及(b)的左圖中示出從上部觀察14天后的裸鼠的結(jié)果，(a)及(b)的左下圖中示出觀察所摘取的異種腫瘤組織片的結(jié)果。在圖13的(a)及(b)的左上圖中，虛線表示異種腫瘤組織片的輪廓，圖13的(a)及(b)的左上圖和左下圖的比例尺為10mm。另外，圖13的(a)及(b)的中圖中示出對異種腫瘤組織片的體積測定得到的結(jié)果，圖13(a)及(b)的右圖中示出對重量測定得到的結(jié)果。圖13的(a)及(b)的左圖中，結(jié)果以平均值±s.d.來表示。＊為p＜0.05，＊＊為p＜0.01。由該結(jié)果可以確認(rèn)：通過施予抗ckap4抗體，可以降低胰癌細(xì)胞(s2－cp8)及肺癌細(xì)胞(a549)的腫瘤形成能力。2－9.外來體中的ckap4表達(dá)與癌癥的關(guān)聯(lián)性的確認(rèn)將胰癌細(xì)胞(suit－2及s2－cp8)、肺癌細(xì)胞(a549及calu－6)、胎兒源性正常腎臟細(xì)胞(x293t)及犬腎小管源性正常細(xì)胞(mdck)在10cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至鋪滿80～90％的狀態(tài)后，回收培養(yǎng)上清液。將培養(yǎng)上清以2,000×g、10分鐘的條件進(jìn)行離心分離后，再以10,000×g、10分鐘的條件進(jìn)行離心分離，分離出細(xì)胞破碎物。將所回收的上清液以4℃、100,000×g、3小時的條件進(jìn)行超離心分離，得到外來體顆粒。將外來體顆粒用1.2ml的pbs清洗后，再度供于以4℃、100,000×g、2小時的條件進(jìn)行的超離心分離。之后，將上清液廢棄，回收外來體，使外來體溶解于laemmli樣品緩沖液中。使用抗ckap4抗體、抗tsg101抗體及抗網(wǎng)格蛋白抗體對外來體和各細(xì)胞的溶解液進(jìn)行ckap4、tsg101及網(wǎng)格蛋白的檢測。所得的結(jié)果如圖14所示?；谠摻Y(jié)果可以確認(rèn)：在胰癌細(xì)胞及肺癌細(xì)胞的培養(yǎng)上清液所含的外來體中檢測到ckap4，與此相對，在正常細(xì)胞的培養(yǎng)上清液所含的外來體中未檢測到ckap4，即，通過以外來體中的ckap4為指標(biāo)，從而可以診斷有無罹患癌癥。序列表<110>國立大學(xué)法人大阪大學(xué)<120>以ckap4作為靶分子的抗腫瘤劑<130>fp172289jp<141>2016-01-28<150>jp2015-38343<151>2015-02-27<160>9<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>602<212>prt<213>智人(homosapiens)<400>1metproseralalysglnargglyserlysglyglyhisglyalaala151015serproserglulysglyalahisproserglyglyalaaspaspval202530alalyslysproproproalaproglnglnproproproproproala354045prohisproglnglnhisproglnglnhisproglnasnglnalahis505560glylysglyglyhisargglyglyglyglyglyglyglylysserser65707580serserserseralaseralaalaalaalaalaalaalaalaserser859095seralasercysserargargleuglyargalaleuasnpheleuphe100105110tyrleualaleuvalalaalaalaalapheserglytrpcysvalhis115120125hisvalleuglugluvalglnglnvalargargserhisglnaspphe130135140serargglnargglugluleuglyglnglyleuglnglyvalglugln145150155160lysvalglnserleuglnalathrpheglythrphegluserileleu165170175argserserglnhislysglnaspleuthrglulysalavallysgln180185190glyglusergluvalserargilesergluvalleuglnlysleugln195200205asngluileleulysaspleuseraspglyilehisvalvallysasp210215220alaarggluargaspphethrserleugluasnthrvalglugluarg225230235240leuthrgluleuthrlysserileasnaspasnilealailephethr245250255gluvalglnlysargserglnlysgluileasnaspmetlysalalys260265270valalaserleugluglusergluglyasnlysglnaspleulysala275280285leulysglualavallysgluileglnthrseralalysserargglu290295300trpaspmetglualaleuargserthrleuglnthrmetgluserasp305310315320iletyrthrgluvalarggluleuvalserleulysglngluglngln325330335alaphelysglualaalaaspthrgluargleualaleuglnalaleu340345350thrglulysleuleuargserglugluservalserargleuproglu355360365gluileargargleugluglugluleuargglnleulysseraspser370375380hisglyprolysgluaspglyglyphearghisserglualapheglu385390395400alaleuglnglnlysserglnglyleuaspserargleuglnhisval405410415gluaspglyvalleusermetglnvalalaseralaargglnthrglu420425430serleugluserleuleuserlysserglngluhisgluglnargleu435440445alaalaleuglnglyargleugluglyleuglyserserglualaasp450455460glnaspglyleualaserthrvalargserleuglygluthrglnleu465470475480valleutyrglyaspvalglugluleulysargservalglygluleu485490495proserthrvalgluserleuglnlysvalglngluglnvalhisthr500505510leuleuserglnaspglnalaglnalaalaargleuproproglnasp515520525pheleuaspargleuserserleuaspasnleulysalaservalser530535540glnvalglualaaspleulysmetleuargthralavalaspserleu545550555560valalatyrservallysilegluthrasngluasnasnleugluser565570575alalysglyleuleuaspaspleuargasnaspleuaspargleuphe580585590vallysvalglulysilehisglulysval595600<210>2<211>1809<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>2atgccctcggccaaacaaaggggctccaagggcggccacggcgccgcgagcccctcggag60aagggtgcccacccgtcgggcggcgcggatgacgtggcgaagaagccgccgccggcgccg120cagcagccgccgccgccgcccgcgccgcacccgcagcagcacccgcagcagcacccgcag180aaccaggcgcacggcaagggcggccaccgcggcggcggcggcggcggcggcaagtcctcc240tcctcctcctccgcctccgccgccgctgccgccgccgccgcctcgtcctcggcgtcctgc300tcgcgcaggctcggcagggcgctcaactttctcttctacctcgccctggtggcggcggcc360gctttctcgggctggtgcgtccaccacgtcctggaggaggtccagcaggtccggcgcagc420caccaggacttctcccggcagagggaggagctgggccagggcttgcagggcgtcgagcag480aaggtgcagtctttgcaagccacatttggaacttttgagtccatcttgagaagctcccaa540cataaacaagacctcacagagaaagctgtgaagcaaggggagagtgaggtcagccggatc600agcgaagtgctgcagaaactccagaatgagattctcaaagacctctcggatgggatccat660gtggtgaaggacgcccgggagcgggacttcacgtccctggagaacacggtggaggagcgg720ctgacggagctcaccaaatccatcaacgacaacatcgccatcttcacagaagtccagaag780aggagccagaaggagatcaatgacatgaaggcaaaggttgcctccctggaagaatctgag840gggaacaagcaggatttgaaagccttaaaggaagctgtgaaggagatacagacctcagcc900aagtccagagagtgggacatggaggccctgagaagtacccttcagactatggagtctgac960atctacaccgaggtccgcgagctggtgagcctcaagcaggagcagcaggctttcaaggag1020gcggccgacacggagcggctcgccctgcaggccctcacggagaagcttctcaggtctgag1080gagtccgtctcccgcctcccggaggagatccggagactggaggaagagctccgccagctg1140aagtccgattcccacgggccgaaggaggacggaggcttcagacactcggaagcctttgag1200gcactccagcaaaagagtcagggactggactccaggctccagcacgtggaggatggggtg1260ctctccatgcaggtggcttctgcgcgccagaccgagagcctggagtccctcctgtccaag1320agccaggagcacgagcagcgcctggccgccctgcaggggcgcctggaaggcctcgggtcc1380tcagaggcagaccaggatggcctggccagcacggtgaggagcctgggcgagacccagctg1440gtgctctacggtgacgtggaggagctgaagaggagtgtgggcgagctccccagcaccgtg1500gaatcactccagaaggtgcaggagcaggtgcacacgctgctcagtcaggaccaagcccag1560gccgcccgtctgcctcctcaggacttcctggacagactttcttctctagacaacctgaaa1620gcctcagtcagccaagtggaggcggacttgaaaatgctcaggactgctgtggacagtttg1680gttgcatactcggtcaaaatagaaaccaacgagaacaatctggaatcagccaagggttta1740ctagatgacctgaggaatgatctggataggttgtttgtgaaagtggagaagattcacgaa1800aaggtctaa1809<210>3<211>801<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>3atgatggctctgggcgcagcgggagctacccgggtctttgtcgcgatggtagcggcggct60ctcggcggccaccctctgctgggagtgagcgccaccttgaactcggttctcaattccaac120gctatcaagaacctgcccccaccgctgggcggcgctgcggggcacccaggctctgcagtc180agcgccgcgccgggaatcctgtacccgggcgggaataagtaccagaccattgacaactac240cagccgtacccgtgcgcagaggacgaggagtgcggcactgatgagtactgcgctagtccc300acccgcggaggggacgcaggcgtgcaaatctgtctcgcctgcaggaagcgccgaaaacgc360tgcatgcgtcacgctatgtgctgccccgggaattactgcaaaaatggaatatgtgtgtct420tctgatcaaaatcatttccgaggagaaattgaggaaaccatcactgaaagctttggtaat480gatcatagcaccttggatgggtattccagaagaaccaccttgtcttcaaaaatgtatcac540accaaaggacaagaaggttctgtttgtctccggtcatcagactgtgcctcaggattgtgt600tgtgctagacacttctggtccaagatctgtaaacctgtcctgaaagaaggtcaagtgtgt660accaagcataggagaaaaggctctcatggactagaaatattccagcgttgttactgtgga720gaaggtctgtcttgccggatacagaaagatcaccatcaagccagtaattcttctaggctt780cacacttgtcagagacactaa801<210>4<211>909<212>dna<213>人工序列()<220><223>人dkk1-flag-gpi的堿基序列<400>4atgatggctctgggcgcagcgggagctacccgggtctttgtcgcgatggtagcggcggct60ctcggcggccaccctctgctgggagtgagcgccaccttgaactcggttctcaattccaac120gctatcaagaacctgcccccaccgctgggcggcgctgcggggcacccaggctctgcagtc180agcgccgcgccgggaatcctgtacccgggcgggaataagtaccagaccattgacaactac240cagccgtacccgtgcgcagaggacgaggagtgcggcactgatgagtactgcgctagtccc300acccgcggaggggacgcaggcgtgcaaatctgtctcgcctgcaggaagcgccgaaaacgc360tgcatgcgtcacgctatgtgctgccccgggaattactgcaaaaatggaatatgtgtgtct420tctgatcaaaatcatttccgaggagaaattgaggaaaccatcactgaaagctttggtaat480gatcatagcaccttggatgggtattccagaagaaccaccttgtcttcaaaaatgtatcac540accaaaggacaagaaggttctgtttgtctccggtcatcagactgtgcctcaggattgtgt600tgtgctagacacttctggtccaagatctgtaaacctgtcctgaaagaaggtcaagtgtgt660accaagcataggagaaaaggctctcatggactagaaatattccagcgttgttactgtgga720gaaggtctgtcttgccggatacagaaagatcaccatcaagccagtaattcttctaggctt780cacacttgtcagagacacgactacaaggacgacgatgacaagagtgctggtgtccgtcct840ggggcacaggcctacctcctcactgtcttctgcatcttgttcctggttatgcagagagag900tggagataa909<210>5<211>19<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>5cagtcgcgtttgcgactgg19<210>6<211>19<212>dna<213>家犬(canisfamiliaris)<400>6gcagaaggtgcagtctctt19<210>7<211>19<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>7gtgcgttgctagtaccaac19<210>8<211>19<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>8gggtttcttggaatgacga19<210>9<211>19<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>9gcagattaacctcagaaat19當(dāng)前第1頁12