本發(fā)明涉及一種納米藥物載體及其應(yīng)用，具體涉及一種能同時(shí)進(jìn)行熒光成像和包載抗腫瘤藥物的稀土上轉(zhuǎn)換納米藥物載體和應(yīng)用，屬于納米生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤是影響人類(lèi)健康的主要疾病之一，目前，化療、手術(shù)、放療是治療癌癥的三大手段?；熅唧w指用化學(xué)藥物治療惡性腫瘤，進(jìn)入人體后迅速分布到全身，是一種全身治療。由于傳統(tǒng)的化療藥物不具有明顯的靶向性，因此殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)損傷人體正常細(xì)胞、組織、器官，產(chǎn)生明顯的毒副作用，使人體免疫力下降。同時(shí)，傳統(tǒng)的化療藥物還存在代謝快、易產(chǎn)生耐藥性等問(wèn)題。

隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，納米藥物載體由于尺寸小、毒性低、比表面積大、物理化學(xué)穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)在腫瘤診斷和治療方面逐漸受到關(guān)注。納米藥物載體可以延長(zhǎng)藥物半衰期、增加血液循環(huán)時(shí)間、提高吸收率、增加特異性和靶向性，利用實(shí)體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)(EPR效應(yīng))使藥物富集在腫瘤部位并實(shí)現(xiàn)藥物可控釋放，有助于提高藥效，降低毒副作用。目前被用作納米藥物載體的材料主要有脂質(zhì)體、樹(shù)枝狀納米材料、聚合物納米材料、高分子膠束、碳納米管、介孔二氧化硅等，但這些藥物載體只能用于腫瘤治療，而不具有診斷功能，只有利用共價(jià)結(jié)合或物理吸附等方式將熒光標(biāo)記物或造影劑修飾到其表面形成復(fù)合型納米材料，才能實(shí)現(xiàn)成像介導(dǎo)的診斷與治療一體化，精確定位腫瘤、及早實(shí)施高效治療。

近年來(lái)發(fā)展的稀土上轉(zhuǎn)換納米材料(UCNPs)由于具有生物毒性低、穿透深度大、光損傷小、熒光背景低、信噪比高等優(yōu)點(diǎn)，是具有良好應(yīng)用前景的生物標(biāo)記材料，即一種新型的熒光探針，可以克服傳統(tǒng)熒光染料易光漂白、不穩(wěn)定、背景熒光干擾大等固有缺點(diǎn)，和細(xì)胞毒性較大的量子點(diǎn)相比，上轉(zhuǎn)換納米粒子生物毒性更低。同時(shí)，上轉(zhuǎn)換納米材料還可以包載抗腫瘤藥物用于藥物載體，包載方式主要有形成疏水口袋結(jié)構(gòu)包載藥物、表面修飾介孔二氧化硅包載藥物、形成中空孔道結(jié)構(gòu)包載藥物等。文獻(xiàn)(Kang,X.；Cheng,Z.；Li,C.；Yang,D.；Shang,M.；Ma,P.；Li,G.；Liu,N.；Lin,J.Core–shell structured up-conversion luminescent and mesoporous NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺@nSiO₂@mSiO₂nanospheres as carriers for drug delivery.J.Phys.Chem.C 2011,115,15801-15811.)通過(guò)兩步溶膠-凝膠法制備出介孔二氧化硅包覆的UCNPs，將消炎藥布洛芬包載在介孔結(jié)構(gòu)中，進(jìn)行藥物包載和釋放。文獻(xiàn)(Zhang,F.；Braun,G.B.；Pallaoro,A.；Zhang,Y.；Shi,Y.；Cui,D.；Moskovits,M.；Zhao,D.；Stucky,G.D.Mesoporous multifunctional upconversion luminescent and magnetic"nanorattle"materials for targeted chemotherapy.Nano Lett.2012,12,61-67.)通過(guò)表面保護(hù)的刻蝕和離子交換過(guò)程制備了一種納米環(huán)狀的核殼結(jié)構(gòu)，外面是介孔結(jié)構(gòu)，中間為中空結(jié)構(gòu)，內(nèi)部是實(shí)心核層，藥物可以被包限在中空結(jié)構(gòu)中。通常表面介孔結(jié)構(gòu)對(duì)藥物的固定性較差，藥物容易從孔中泄露，需要在表面再修飾一層聚合物保護(hù)層(Lai,J.P.；Shah,B.P.；Zhang,Y.X.；Yang,L.T.；Lee,K.B.Real-time monitoring of ATP-responsive drug release using mesoporous-silica-coated multicolor upconversion nanoparticles.ACS Nano 2015,9,5234-5245.)。

但上述載藥方法都需要多步反應(yīng)和嚴(yán)格的條件控制，操作過(guò)程相對(duì)繁瑣且耗時(shí)。此外，上轉(zhuǎn)換納米粒子經(jīng)過(guò)多次處理增加了猝滅的幾率，導(dǎo)致上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率降低。為了實(shí)現(xiàn)納米載體在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域更廣泛的應(yīng)用，希望通過(guò)簡(jiǎn)單的合成方法制備基于上轉(zhuǎn)換納米材料的納米藥物載體，并應(yīng)用于腫瘤診斷與治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，一種集熒光成像與載藥的稀土上轉(zhuǎn)換納米藥物載體，主要包括：具有熒光成像功能的稀土上轉(zhuǎn)換納米粒子(UCNPs)，負(fù)載在上轉(zhuǎn)換納米粒子表面的抗腫瘤藥物以及包覆在納米粒子表面的兩親性聚合物分子二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇(DSPE-PEG)。

作為優(yōu)選，所述稀土上轉(zhuǎn)換納米粒子的化學(xué)組成為NaYF₄:Yb,Ln，Ln是Er或Tm，更優(yōu)選為結(jié)晶度高、形貌均勻的六方相納米晶。

作為優(yōu)選，所述抗腫瘤藥物為修飾了長(zhǎng)鏈基團(tuán)的藥物前體，其中藥物前體選自7-乙基-10-羥基-喜樹(shù)堿(SN38)和卡巴他賽藥物(CTX)。單純的藥物前體不能和UCNPs的疏水層進(jìn)行組裝，可能和其自身的剛性平面結(jié)構(gòu)有關(guān)，而修飾了長(zhǎng)鏈后，具有高彈性可自由旋轉(zhuǎn)，增強(qiáng)和油酸分子之間的疏水作用實(shí)現(xiàn)組裝。另一方面，這些藥物前體能溶解于水中。

其中，所述長(zhǎng)鏈基團(tuán)優(yōu)選為長(zhǎng)鏈烷基脂肪酸，所述脂肪酸可選擇飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸，優(yōu)選為不飽和脂肪酸，更優(yōu)選為油酸、亞油酸或亞麻酸，最優(yōu)選為亞油酸或亞麻酸。

所述前體藥物結(jié)構(gòu)式為(I-1)至(I-2)所述化合物之一：

所述兩親性聚合物分子二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇(DSPE-PEG)的分子量有750、2000、5000、10000等，優(yōu)選為分子量2000，即DSPE-PEG₂₀₀₀。

選擇兩親性分子DSPE-PEG來(lái)進(jìn)行包覆，主要有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)DSPE-PEG是PEG化的磷脂分子，具有良好的水溶性和生物相容性，已被FDA批準(zhǔn)用于人體；(2)DSPE-PEG的脂肪鏈和UCNPs表面的油酸分子、抗腫瘤藥物的不飽和脂肪酸結(jié)構(gòu)極為相似，易于通過(guò)疏水作用發(fā)生超分子組裝，進(jìn)行吸附；(3)納米粒子表面修飾DSPE-PEG后形成一層親水層，避免疏水納米粒子表面和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)細(xì)胞通過(guò)非特異性疏水作用而被RES細(xì)胞攝取、清除，進(jìn)而延長(zhǎng)了在血液循環(huán)中的半衰期和提高穩(wěn)定性，有利于通過(guò)EPR效應(yīng)實(shí)現(xiàn)藥物被動(dòng)靶向。

另一方面，本發(fā)明提供了一種集熒光成像與載藥一體化的稀土上轉(zhuǎn)換納米藥物載體的簡(jiǎn)易制備方法，該制備方法操作工藝簡(jiǎn)單易行，成本低。

所述方法包括：

(1)利用稀土氯化物為原料，油酸為配體，油酸/1-十八烯為混合溶劑，采用高溫溶劑熱法合成油酸包裹的稀土上轉(zhuǎn)換納米粒子(OA-UCNPs)；

稀土氯化物優(yōu)選為YCl₃、YbCl₃和ErCl₃/TmCl₃或其水合物。

(2)將所述上轉(zhuǎn)換納米粒子、DSPE-PEG₂₀₀₀、抗腫瘤前體藥物分散在同一介質(zhì)中，使用原位攪拌法使三者充分混合，彼此之間發(fā)生疏水相互作用；

具體地，先將三者分別分散在DMSO溶劑中，制備成母液，濃度分別為12mg/mL，100mg/mL，20mg/mL。按照一定比例混合，三者質(zhì)量比OA-UCNPs：DSPE-PEG₂₀₀₀：抗腫瘤前藥為10：(10～20)：(1～10)，進(jìn)一步優(yōu)選為10：20：1?；旌虾笤谑覝叵聰嚢璺磻?yīng)4h。

(3)通過(guò)納米沉淀法將所述混合物在超聲下滴加到水溶液中，在擴(kuò)散進(jìn)入水相時(shí)合成載藥納米顆粒；

(4)對(duì)上述載藥納米粒子進(jìn)行分離純化，干燥或分散在超純水中。

作為優(yōu)選，選擇高速離心法進(jìn)行分離提純，轉(zhuǎn)速15000g，時(shí)間10min。分離純化步驟用于除去未和UCNPs作用包載的DSPE-PEG₂₀₀₀和抗腫瘤藥物。

本發(fā)明還提供了一種集熒光成像與載藥的稀土上轉(zhuǎn)換納米藥物載體在制備抗癌藥物及熒光成像方面的應(yīng)用。本發(fā)明的納米藥物載體可以有效包載藥物，并通過(guò)上轉(zhuǎn)換熒光成像進(jìn)行腫瘤診斷，利用被動(dòng)靶向在腫瘤部位進(jìn)行藥物緩釋和給藥，同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的上轉(zhuǎn)換熒光成像診斷和化療治療，解決單一納米載體多功能化的問(wèn)題。其中所述腫瘤包括乳腺癌、腸癌、肺癌、胃癌或?qū)m頸癌。

作為優(yōu)選，熒光成像選擇外接的功率可調(diào)的980nm光纖偶合二極管激光器作為激發(fā)光源。

本發(fā)明的有益效果：通過(guò)單步合成法即可獲得表面PEG化的稀土上轉(zhuǎn)換納米藥物載體，合成工藝簡(jiǎn)單、成本低廉、效率高、適于大批量生產(chǎn)；本發(fā)明的稀土上轉(zhuǎn)換納米藥物載體在水中具有良好的分散性，穩(wěn)定性好；本發(fā)明將熒光探針和抗腫瘤藥物實(shí)現(xiàn)一體化裝載，在熒光成像指導(dǎo)下進(jìn)行藥物緩釋和靶向給藥，減小毒副作用，提高治療的準(zhǔn)確性。

附圖說(shuō)明

圖1從左到右分別為實(shí)施例2中OA-UCNPs+DSPE-PEG₂₀₀₀+SN38前體藥物1，OA-UCNPs+DSPE-PEG₂₀₀₀+SN38，SN38的DMSO溶液充分振搖后于超聲下滴加入水中后的照片。

圖2為實(shí)施例2制備的稀土上轉(zhuǎn)換納米藥物載體(1@pUCNPs)(灰色實(shí)線)和不含藥物的納米顆粒(pUCNPs)(黑色虛線)以及DSPE-PEG₂₀₀₀包載SN38前體藥物1(PEGylated 1)(黑色實(shí)線)的紫外-可見(jiàn)吸收曲線。

圖3為UCNPs載藥率與不同UCNPs/藥物反應(yīng)質(zhì)量比的關(guān)系圖，其中(a)中藥物是SN38前體藥物1，(b)中藥物是CTX前體藥物2。

圖4為納米粒子的透射電鏡(TEM)照片(上)和高分辨透射電鏡(HRTEM)照片(下)，(a)：實(shí)施例1制備的NaYF₄:Yb,Er上轉(zhuǎn)換納米顆粒(OA-UCNPs)；(b)：DSPE-PEG₂₀₀₀包覆的NaYF₄:Yb,Er上轉(zhuǎn)換納米顆粒(pUCNPs)；(c)：實(shí)施例2制備的稀土上轉(zhuǎn)換納米藥物載體(1@pUCNPs)。黑色和白色比例尺分別表示100nm和5nm。

圖5為實(shí)施例1制備的稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒(OA-UCNPs)和實(shí)施例2制備的稀土上轉(zhuǎn)換納米藥物載體(1@pUCNPs)以及不含藥物的納米顆粒(pUCNPs)的動(dòng)態(tài)光散射粒徑分布圖(a)和zeta電位圖(b)，圖中，d_h表示粒子在溶劑中的動(dòng)態(tài)光散射粒徑，PDI為多分散指數(shù)。

圖6為實(shí)施例1制備的稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒(OA-UCNPs)和實(shí)施例2制備的稀土上轉(zhuǎn)換納米藥物載體(1@pUCNPs)以及不含藥物的納米顆粒(pUCNPs)在980nm光源激發(fā)下的上轉(zhuǎn)換熒光光譜比較，其中UCNPs的濃度均為1.5mg/mL，OA-UCNPs分散在環(huán)己烷中，后兩者分散在水中。

圖7為實(shí)施例2制備的稀土上轉(zhuǎn)換納米藥物載體(1@pUCNPs)在37℃，0.2％Tween 80釋放介質(zhì)中的藥物累積釋放曲線。

圖8為實(shí)施例2制備的稀土上轉(zhuǎn)換納米藥物載體(1@pUCNPs)和Bcap-37細(xì)胞孵育共培養(yǎng)4h后的共聚焦成像照片。(a)中綠色熒光和紅色熒光通道均為UCNPs的熒光；(b)中UCNPs通道選擇的是紅色波段的上轉(zhuǎn)換熒光。

圖9為實(shí)施例2制備的稀土上轉(zhuǎn)換納米藥物載體(1@pUCNPs)在活體水平上的抗腫瘤效果評(píng)價(jià)，(a)：乳腺癌Bcap37細(xì)胞荷瘤裸鼠經(jīng)不同藥物處理后的腫瘤體積變化曲線；(b)：荷瘤裸鼠經(jīng)不同藥物處理后第24天的腫瘤質(zhì)量。

圖10為不同藥物處理對(duì)乳腺癌Bcap-37細(xì)胞荷瘤裸鼠體重變化影響圖。

圖中，1表示修飾了亞麻酸的7-乙基-10-羥基喜樹(shù)堿，2表示修飾了亞麻酸的卡巴他賽，Saline表示生理鹽水，SN38表示7-乙基-10-羥基喜樹(shù)堿，CPT-11表示伊立替康。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明不限于此。

實(shí)施例1稀土上轉(zhuǎn)換納米粒子(UCNPs)的合成

準(zhǔn)確稱(chēng)取六水合氯化釔(YCl₃·6H₂O)(0.2366g，0.78mmol)，六水合氯化鐿(YbCl₃·6H₂O)(0.0775g，0.20mmol)和無(wú)水氯化鉺(ErCl₃)(0.0055g，0.02mmol)加入至100mL圓底燒瓶中，再加入6mL OA和15mL 1-ODE，充分混合攪拌。N₂保護(hù)下升溫至100℃除O₂和H₂O，繼續(xù)升溫至160℃反應(yīng)40min至反應(yīng)物完全溶解，得到淺黃色透明澄清溶液，冷卻至室溫。另稱(chēng)取NH₄F 0.1482g(4mmol)和NaOH 0.1g(2.5mmol)溶于10mL甲醇中，超聲分散，劇烈攪拌下逐滴加入到之前冷卻溶液中。升溫至50℃，攪拌1h，然后升溫至100℃，除甲醇和水。待甲醇揮發(fā)完全后，N₂保護(hù)下加熱至300℃反應(yīng)1.5h。冷卻至室溫，加入大量乙醇，4320g離心8min。沉淀用環(huán)己烷分散后，加乙醇離心，如此用環(huán)己烷與乙醇反復(fù)洗滌三次，抽真空干燥。

將適量制備的稀土上轉(zhuǎn)換納米粒子NaYF₄:Yb,Er分散在環(huán)己烷溶液中，球狀滴加到銅網(wǎng)上，分別在透射電鏡(TEM)和高分辨透射電鏡(HRTEM)下觀察。由圖4(a)可見(jiàn)，制備的上轉(zhuǎn)換納米粒子尺寸均一，粒徑為44.0±1.7nm。HRTEM圖中可以看到清晰的晶格條紋，表明納米粒子具有良好的結(jié)晶度，圖中標(biāo)示的間距0.518nm的晶面對(duì)應(yīng)六方晶型NaYF₄:Yb,Er的(100)晶面。

實(shí)施例2納米沉淀法制備稀土上轉(zhuǎn)換納米藥物載體

將上轉(zhuǎn)換納米粒子(OA-UCNPs)、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000(DSPE-PEG₂₀₀₀)、亞麻酸修飾的SN38前體藥物1分別超聲分散在DMSO溶液中，濃度分別為12mg/mL、100mg/mL、20mg/mL。將三種分散液充分混合，室溫下緩慢振蕩4h，然后在超聲下逐滴加入超純水中，繼續(xù)振搖30min。離心(15000g，10min)，棄去上清液。沉淀經(jīng)洗滌離心兩次后，冷凍干燥過(guò)夜。作為對(duì)照，將OA-UCNPs、DSPE-PEG₂₀₀₀、單純SN38分子的DMSO溶液混合振蕩，超聲下滴加到超純水中。用同樣的方法制備亞麻酸修飾的卡巴他賽前體藥物2的稀土上轉(zhuǎn)換納米載體。負(fù)載兩種藥物的納米載體分別表示為1@pUCNPs和2@pUCNPs。

如圖1所示，OA-UCNPs+DSPE-PEG₂₀₀₀+1混合制備納米藥物得到澄清的膠體溶液，而OA-UCNPs+DSPE-PEG₂₀₀₀+SN38混合滴入水中出現(xiàn)白色渾濁，和單純SN38滴入水中現(xiàn)象一致，表明SN38未被包載，說(shuō)明單純不修飾長(zhǎng)鏈烷基的藥物前體不能和UCNPs的疏水層進(jìn)行組裝，可能和其自身的剛性平面結(jié)構(gòu)有關(guān)，而修飾了長(zhǎng)鏈后，具有高彈性可自由旋轉(zhuǎn)，增強(qiáng)和油酸分子之間的疏水作用實(shí)現(xiàn)組裝。

包載前藥1的上轉(zhuǎn)換納米藥物載體的紫外-可見(jiàn)吸收光譜如圖2所示，在367nm處有明顯的SN38特征吸收峰，與只有DSPE-PEG₂₀₀₀包覆前藥1形成的納米粒子(PEGylated 1)的吸收峰基本重疊，表明UCNPs不會(huì)對(duì)SN38吸收峰造成影響，可以用此特征吸收峰來(lái)定量1@pUCNPs中的活性SN38含量。

實(shí)施例3實(shí)施例2中稀土上轉(zhuǎn)換納米藥物載體藥物包載率測(cè)定

固定OA-UCNPs和DSPE-PEG₂₀₀₀的量(質(zhì)量比1:2)，加入不同質(zhì)量的前藥1，進(jìn)行充分包載后，通過(guò)紫外可見(jiàn)吸收光譜(367nm吸收峰)測(cè)定裝載到UCNPs上的藥物1的量，計(jì)算載藥率。用相似的方法測(cè)定前藥2的載藥量。由于卡巴他賽的摩爾吸光系數(shù)較小，UCNPs吸收峰會(huì)影響其測(cè)定，因此收集離心上清液和洗液，測(cè)定未被包載的2來(lái)間接測(cè)定藥物包載，其中紫外特征吸收峰是274nm，同時(shí)扣除相同波長(zhǎng)處DSPE-PEG₂₀₀₀的吸收。平行測(cè)定三次。

圖2是藥物包載率測(cè)定結(jié)果，當(dāng)藥物/UCNPs的投料質(zhì)量比為1時(shí)，達(dá)到SN38前藥1的飽和載藥率，約為12.3％。而卡巴他賽前藥2載藥率為18.9％。為了確保前藥能被完全包載如UCNPs中，以下實(shí)施例中使用的OA-UCNP/DSPE-PEG2000/1的投料質(zhì)量比固定為10:20:1。

實(shí)施例4實(shí)施例2中稀土上轉(zhuǎn)換納米藥物載體的表征

采用透射電鏡(TEM)和高分辨透射電鏡(HRTEM)分別表征納米粒子的形貌，制樣時(shí)將納米粒子分散在H₂O中，液滴以球狀滴加到銅網(wǎng)上，干燥后再電鏡下觀察，在視野范圍內(nèi)隨機(jī)選取200個(gè)粒子進(jìn)行粒徑統(tǒng)計(jì)分析。粒子的動(dòng)態(tài)光散射(DLS)粒徑和zeta電位使用馬爾文粒度分析儀測(cè)定。熒光光譜表征采用外接980nm固體激光器的熒光光譜儀表征。

pUCNPs、1@pUCNPs的TEM和HRTEM表征結(jié)果如圖4所示。粒徑分別為49.5±1.5nm和50.3±1.5nm，和OA-UCNPs相比，粒徑增加了約5nm，表明成功包載了DSPE-PEG₂₀₀₀。DLS粒徑分析結(jié)果和zeta電位表征結(jié)果如圖5所示。OA-UCNPs在環(huán)己烷中的動(dòng)力學(xué)直徑為91.94nm，pUCNPs和1@pUCNPs在水中的動(dòng)力學(xué)直徑分別為113.0nm和119.7nm，DLS峰形尖銳，表明沒(méi)有明顯的團(tuán)聚，增加的粒徑與DSPE-PEG₂₀₀₀的水化層尺寸相符合。pUCNPs和1@pUCNPs的zeta電位分別為-6.28mV和-5.79mV，由于DSPE-PEG₂₀₀₀中存在PO₄^-，電位稍微偏負(fù)，但數(shù)值小，表面電荷對(duì)載體運(yùn)輸過(guò)程影響較小。

圖6比較了上述納米藥物載體(1@pUCNPs)和實(shí)施例1制備的稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒(OA-UCNPs)以及不含藥物的納米顆粒(pUCNPs)在980nm光源激發(fā)下的上轉(zhuǎn)換熒光光譜，相較于相同濃度OA-UCNPs環(huán)己烷分散液的熒光光譜，1@pUCNPs在水中的熒光光譜弱了一半，這是因?yàn)樗畬?duì)980nm的激發(fā)光有吸收，另外水分子的高能振動(dòng)會(huì)加強(qiáng)Er³⁺的非輻射弛豫過(guò)程從而導(dǎo)致熒光猝滅，但是上述納米藥物載體的熒光強(qiáng)度仍然能夠滿(mǎn)足成像的需求。

實(shí)施例5實(shí)施例2中稀土上轉(zhuǎn)換納米藥物載體藥物釋放速率測(cè)定

將實(shí)施例2中制備的含0.2mg/mL前藥1的納米載體裝入透析袋中(截留分子量3500Da)，密封后放入一定體積0.2％吐溫80溶液中，置于恒溫?fù)u床，37℃下緩慢振搖。在預(yù)先設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)，取出1mL透析袋外部的釋放液，并補(bǔ)充等量的0.2％吐溫80溶液。采用紫外吸收法測(cè)定367nm的特征吸收來(lái)定量釋放的活性SN38，計(jì)算釋放效率，平行測(cè)定三次。

圖7顯示制備的稀土上轉(zhuǎn)換納米藥物載體(1@pUCNPs)在37℃，0.2％Tween 80釋放介質(zhì)中的藥物累積釋放結(jié)果，曲線表明藥物釋放速率較慢，96h時(shí)累計(jì)釋放效率約為36％，有利于持續(xù)釋放保持藥效。

實(shí)施例6實(shí)施例2中稀土上轉(zhuǎn)換納米藥物載體體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔板中(5000個(gè)細(xì)胞/孔)，37℃、5％CO₂、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入100μL含不同濃度下列物質(zhì)的培養(yǎng)基，分別是pUCNPs、CPT-11，SN38，PEGylated 1和1@pUCNPs，以CPT-11、SN38、PEGylated 1作為對(duì)照，每種藥每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，加完藥后在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48或72h。棄去培養(yǎng)液，每孔加入100μL CCK-8溶液(母液用新鮮培養(yǎng)基稀釋10倍)，繼續(xù)培養(yǎng)30min至2h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處各孔的吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率，繪制細(xì)胞存活曲線，得到藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的IC₅₀(半數(shù)抑制濃度)。稀土上轉(zhuǎn)換納米藥物載體1@pUCNPs對(duì)各種腫瘤細(xì)胞的體外毒性結(jié)果見(jiàn)表1。

表1各試驗(yàn)藥物的體外毒性評(píng)價(jià)結(jié)果(μM)

由表1可見(jiàn)，稀土上轉(zhuǎn)換納米藥物載體1@pUCNPs和細(xì)胞孵育48h后，對(duì)乳腺癌細(xì)胞系Bcap-37的IC₅₀值為2.24±0.25μM，其抗腫瘤活性是CPT-11的26倍；對(duì)宮頸癌細(xì)胞系HeLa的IC₅₀值為5.85±1.96μM，其抗腫瘤活性是CPT-11的9倍；對(duì)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的IC₅₀值為0.76±0.09μM，其抗腫瘤活性是CPT-11的45倍；對(duì)胃癌細(xì)胞系SGC-7901的IC₅₀值為10.81±2.83μM，其抗腫瘤活性是CPT-11的16倍。1@pUCNPs和細(xì)胞孵育72h后，對(duì)四種細(xì)胞的存活率影響更明顯。其中對(duì)乳腺癌細(xì)胞系Bcap-37的IC₅₀值為0.23±0.05μM，其抗腫瘤活性是CPT-11的122倍；對(duì)宮頸癌細(xì)胞系HeLa的IC₅₀值為1.69±0.34μM，其抗腫瘤活性是CPT-11的18倍；對(duì)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的IC₅₀值為0.16±0.03μM，其抗腫瘤活性是CPT-11的52倍；對(duì)胃癌細(xì)胞系SGC-7901的IC₅₀值為1.75±0.33μM，其抗腫瘤活性是CPT-11的22倍。

細(xì)胞毒性結(jié)果表明，稀土上轉(zhuǎn)換納米藥物載體1@pUCNPs具有比CPT-11更明顯的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力，和單純SN38以及SN38-PEG組裝成的納米粒有類(lèi)似的抗腫瘤效果，表明1@pUCNPs可以有被細(xì)胞有效攝取，并釋放活性SN38分子。

實(shí)施例7實(shí)施例2中稀土上轉(zhuǎn)換納米藥物載體的成像性能和細(xì)胞攝取行為

為評(píng)價(jià)上轉(zhuǎn)換納米藥物載體在細(xì)胞水平上的成像性能以及考察細(xì)胞對(duì)上述載體的攝取行為，使用共聚焦激光掃描熒光顯微鏡(CLSM)進(jìn)行觀察研究。將貼壁后的Bcap-37和含1@pUCNPs(UCNPs等效濃度100μg/mL)的培養(yǎng)基、FITC-dextran復(fù)合物(終濃度0.1mg/mL)一起培養(yǎng)4h。用PBS清洗3次除去過(guò)量的UCNPs和FITC-dextran，用4％多聚甲醛的PBS溶液固定20min，再用PBS充分洗滌，細(xì)胞核用Hoechst 33258(20μg/mL)染色15min。再次用PBS充分洗滌，加入1.5mL PBS在CLSM下觀察熒光成像。波長(zhǎng)參數(shù)選擇：Hoechst：405nm波長(zhǎng)激發(fā)，425-475nm波長(zhǎng)范圍收集；FITC-dextran：488nm激發(fā)，500-600nm范圍收集；UCNPs：980nm激發(fā)，分別在495-550nm和575-650nm收集綠色熒光和紅色熒光。

制備的納米藥物載體和Bcap-37細(xì)胞孵育的共聚焦成像結(jié)果如圖8所示。圖8(a)中顯示了細(xì)胞中明亮的綠色和紅色上轉(zhuǎn)換熒光，兩者疊加為黃色，表明1@UCNPs可以被細(xì)胞有效攝取。為了進(jìn)一步研究?jī)?nèi)吞方式，使用FITC-葡聚糖一起培養(yǎng)，溶酶體攝取FITC-葡聚糖，從而被熒光標(biāo)記，圖8(b)中顯示1@pUCNPs的熒光(紅色小點(diǎn))和FITC-葡聚糖的熒光(綠色小點(diǎn))部分重疊，表明1@pUCNPs通過(guò)溶酶體胞吞作用被細(xì)胞攝取，而仍有一些未重疊則是因?yàn)樗幬锉话毯笠褟娜苊阁w中釋放。

結(jié)果表明上述上轉(zhuǎn)換納米藥物載體可以有效地被細(xì)胞胞吞，同時(shí)可借助其上轉(zhuǎn)換熒光觀察胞吞過(guò)程。

實(shí)施例8實(shí)施例2中稀土上轉(zhuǎn)換納米藥物載體體內(nèi)抗腫瘤能力

在BALB/c裸鼠的乳腺部位原位移植Bcap-37腫瘤，當(dāng)腫瘤平均體積達(dá)到～70mm³時(shí)，每隔一天(以第一次注射為第0天)通過(guò)尾靜脈分別注射生理鹽水、pUCNPs(30mg/kg)、CPT-11(等效SN38 10mg/kg)和1@pUCNPs(等效SN38 10mg/kg)水溶液，共給藥3次，每4天測(cè)量一次小鼠體重和腫瘤尺寸，計(jì)算腫瘤體積：(長(zhǎng)度×寬度²)/2。給藥后第24天處死所有小鼠，取出腫瘤，稱(chēng)重。

圖9(a)顯示了乳腺癌Bcap-37細(xì)胞荷瘤裸鼠經(jīng)藥物處理后腫瘤體積隨時(shí)間的變化。1@pUCNPs給藥組的腫瘤生長(zhǎng)得到了明顯減緩，用藥后第24天，腫瘤生長(zhǎng)抑制率達(dá)到61％，和生理鹽水組相比，兩者存在極顯著性差異(n＝6，p<0.001)，而CPT-11給藥組的腫瘤抑制效率僅為14％，和生理鹽水組不存在顯著性差異(n＝6,p>0.05)。圖9(b)為荷瘤裸鼠自第一次給藥后第24天的腫瘤質(zhì)量比較，1@pUCNPs給藥組腫瘤平均質(zhì)量明顯小于CPT-11給藥組，兩者存在顯著性差異(n＝6，p<0.05)。

圖10顯示藥物處理對(duì)小鼠體重的影響，給藥初期1@pUCNPs組體重略有下降，但后期體重增加直至和對(duì)照組保持相同的生長(zhǎng)趨勢(shì)，表明1@pUCNPs對(duì)動(dòng)物無(wú)明顯毒性。

結(jié)果表明，上述稀土上轉(zhuǎn)換納米藥物載體具有明顯的腫瘤生長(zhǎng)抑制效果，且無(wú)明顯的毒性，有良好的抗腫瘤應(yīng)用價(jià)值。