本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，且特別涉及黨參果膠多糖CPP1c的應(yīng)用及其藥物和保健品。

背景技術(shù)：

黨參為桔?？浦参铮h參(Codonopsis pilosula(Franch.)Nann.f)，素花黨參(Codonopsis pilosula Nann.f var.modesta(Nann.f)L.T.Shen)和川黨參(Codonopsis tang shen O.liv)的干燥根。性味甘平，有補中益氣，健脾益肺，生津和胃的功效?，F(xiàn)代藥理研究證實，黨參具有增強機體免疫力、改善胃腸功能、調(diào)節(jié)血糖、清除自由基、抗炎、抗氧化等功能。植物化學(xué)研究表明，黨參主要含有生物堿、苯丙素類、三萜類、聚乙炔類、甾醇、揮發(fā)油、黃酮類及多糖類化合物等多種化合物；其中，黨參多糖是黨參的主要活性成分之一。

近年來，多糖作為一種無毒副作用且免疫活性較強的天然藥物日益得到人們的廣泛關(guān)注。

目前，對黨參多糖，尤其是黨參果膠多糖CCP1c的藥用及保健價值的了解還很少。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供黨參果膠多糖CPP1c的在制備促進淋巴細(xì)胞增殖的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第二目的在于提供黨參果膠多糖CCP1c在制備改善淋巴細(xì)胞活性的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三目的在于提供黨參果膠多糖CCP1c在制備促進免疫相關(guān)分子分泌的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第四目的在于提供黨參果膠多糖CCP1c在制備促進免疫相關(guān)基因表達(dá)的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第五目的在于提供黨參果膠多糖CCP1c在制備促進免疫相關(guān)蛋白分子表達(dá)量的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第六目的在于提供黨參果膠多糖CCP1c在制備促進淋巴細(xì)胞歸巢的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第七目的在于提供黨參果膠多糖CCP1c在制備增強免疫力的保健品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第八目的在于提供一種藥物。

本發(fā)明的第九目的在于提供一種保健品。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。

黨參果膠多糖，包括黨參果膠多糖CPP1c，黨參果膠多糖CPP1c由鼠李糖Rha、阿拉伯糖Ara、半乳糖Gal和半乳糖醛酸GalA按照摩爾比2.99:1.154:1.94:33.29構(gòu)成；黨參果膠多糖CPP1c的糖鏈為1→4連接的鼠李糖Rha、1→5連接的阿拉伯糖Ara、1→4連接的半乳糖醛酸GalA和1→6連接的半乳糖Gal；其結(jié)構(gòu)單元具有以下結(jié)構(gòu)式：

本發(fā)明中提到的黨參果膠多糖主要指黨參果膠多糖CPP1c，黨參果膠多糖CPP1c藥用和保健價值較為突出。

上述黨參果膠多糖CCP1c在制備促進淋巴細(xì)胞增殖的藥物中的應(yīng)用。

上述黨參果膠多糖CCP1c在制備改善淋巴細(xì)胞活性的藥物中的應(yīng)用。

上述黨參果膠多糖CCP1c在制備促進免疫相關(guān)分子分泌的藥物中的應(yīng)用。

上述黨參果膠多糖CCP1c在制備促進免疫相關(guān)基因表達(dá)的藥物中的應(yīng)用。

上述黨參果膠多糖CCP1c在制備促進免疫相關(guān)蛋白分子表達(dá)量的藥物中的應(yīng)用。

上述黨參果膠多糖CCP1c在制備促進淋巴細(xì)胞歸巢的藥物中的應(yīng)用。

一種藥物，其活性成分為黨參果膠多糖CPP1c。

一種保健品，其活性成分為黨參果膠多糖CPP1c。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供的黨參果膠多糖CPP1c在促進淋巴細(xì)胞增殖，改善淋巴細(xì)胞活性，促進免疫相關(guān)分子分泌，促進免疫相關(guān)基因表達(dá)，促進免疫相關(guān)蛋白表達(dá)和促進淋巴細(xì)胞歸巢的藥物中的應(yīng)用，增強機體的免疫能力，具有較高的藥用價值和保健功能，用于制備的藥品和保健品，具有良好的增強免疫的效果。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術(shù)方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實施例，因此不應(yīng)被看作是對范圍的限定，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。

圖1為本發(fā)明實驗例1中的黨參果膠多糖CPP1c促進淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果圖；

圖2為本發(fā)明實驗例3中的黨參果膠多糖CPP1c對免疫相關(guān)因子分泌影響的結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明實驗例3中的黨參果膠多糖CPP1c對免疫相關(guān)因子分泌的影響結(jié)果圖；

圖4為本發(fā)明實驗例4中的黨參果膠多糖CPP1c對體外淋巴細(xì)胞免疫相關(guān)基因的mRNA表達(dá)的影響結(jié)果圖；

圖5為本發(fā)明實驗例4中的黨參果膠多糖CPP1c對體內(nèi)淋巴細(xì)胞免疫相關(guān)基因的mRNA表達(dá)的影響結(jié)果圖；

圖6為本發(fā)明實驗例5中的黨參果膠多糖CPP1c對體外淋巴細(xì)胞免疫相關(guān)蛋白的表達(dá)的影響結(jié)果圖；

圖7為本發(fā)明實驗例5中的黨參果膠多糖CPP1c對體內(nèi)淋巴細(xì)胞免疫相關(guān)蛋白的表達(dá)的影響結(jié)果圖；

圖8為本發(fā)明實驗例6中的黨參果膠多糖CPP1c對體內(nèi)淋巴細(xì)胞的遷移和歸巢的影響結(jié)果圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實驗動物雄性昆明小鼠，購于蘭州大學(xué)實驗動物中心(許可證號：SCXK(甘)2013-0002)；雄性SAMP8小鼠(6月齡)，購于北京華阜康生物科技股份有限公司(許可證號：SCXK(京)2014-0004)。

實驗試劑MTT(Sigma，美國)，ConA/LPS(Sigma，美國)，PE-CD3、FITC-CD3、FITC-CD4、Percp/cy5.5-CD8、PE-CD28、APC-CD152(美國Biolegend公司)，單克隆抗體PI3K、p38MAPK、CD28(美國Biolegend公司)，IL-2、IFN-γ、TNF-α等ELISA檢測試劑盒(深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)，總RNA提取試劑盒(上海Promega公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴增試劑盒(南京諾唯贊公司)，PI3K、p38MAPK、CD28引物(上海生工生物工程股份有限公司)。

下面對本發(fā)明實施例提供的黨參果膠多糖CCP1c在制備增強免疫的藥物中的應(yīng)用作進一步的說明。

免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子組成，是機體執(zhí)行免疫應(yīng)答及免疫功能的重要系統(tǒng)。其中，免疫細(xì)胞是免疫系統(tǒng)發(fā)揮免疫功能的基礎(chǔ)。淋巴細(xì)胞是免疫細(xì)胞的重要組成部分，在體內(nèi)分布廣泛，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞等亞類，分別介導(dǎo)機體的細(xì)胞免疫、體液免疫及對腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的殺傷作用等重要免疫學(xué)功能。機體免疫功能的高低直接影響機體的抗病能力。提高機體免疫力在很多疾病的治療中發(fā)揮重要作用。許多疾病都需要通過增加免疫細(xì)胞數(shù)量來提高機體免疫力。研究表明，一些免疫復(fù)方可以通過激活免疫細(xì)胞而增強機體免疫力。

多糖作為一種無毒副作用且免疫活性較強的天然藥物日益得到人們的廣泛關(guān)注。

黨參果膠多糖，包括黨參果膠多糖CPP1c；黨參果膠多糖CPP1c由鼠李糖Rha、阿拉伯糖Ara、半乳糖Gal和半乳糖醛酸GalA按照摩爾比2.99:1.154:1.94:33.29構(gòu)成；黨參果膠多糖CPP1c的糖鏈為1→4連接的鼠李糖Rha、1→5連接的阿拉伯糖Ara、1→4連接的半乳糖醛酸GalA和1→6連接的半乳糖Gal；其結(jié)構(gòu)單元具有以下結(jié)構(gòu)式：

上述黨參果膠多糖CPP1c在制備促進淋巴細(xì)胞增殖的藥物中的應(yīng)用。

淋巴細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中有著極其重要的作用，是機體免疫功能的主要承擔(dān)者。檢測中藥單體或相關(guān)化合物是否具有促進淋巴細(xì)胞增殖的能力是評價該化合物是否具有增強免疫功能性質(zhì)的重要依據(jù)。MTT實驗是檢測淋巴細(xì)胞體外增殖的經(jīng)典實驗，是一種可靠、簡便的檢測細(xì)胞增殖的技術(shù)，在判定藥物影響機體免疫功能的研究中被廣泛應(yīng)用。

上述黨參果膠多糖CPP1c在制備改善淋巴細(xì)胞活性的藥物中的應(yīng)用。

進一步地，上述黨參果膠多糖CPP1c促進CD28⁺T細(xì)胞的增加，并減少CD152⁺T細(xì)胞。

在外周血淋巴細(xì)胞中，CD28⁺T細(xì)胞占54％-86％，增加CD28⁺T細(xì)胞有助于提高機體免疫能力。淋巴細(xì)胞中，CD28分子與CD152分子競爭性的與B7結(jié)合；如果分泌CD28分子的CD28⁺T細(xì)胞增多，即相對的減少CD152分子的數(shù)量，即達(dá)到增強免疫的效果。

上述黨參果膠多糖CPP1c在制備促進免疫相關(guān)分子分泌的藥物中的應(yīng)用。

進一步地，免疫相關(guān)分子包括干擾素γ、白介素-2和腫瘤壞死因子α。

白介素2(IL-2)主要由活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，是機體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中重要的調(diào)節(jié)分子，在抑制腫瘤細(xì)胞生長及免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要的作用。IL-2具有促進T細(xì)胞增殖分化、活化B淋巴細(xì)胞、增強T細(xì)胞和NK細(xì)胞活性、誘導(dǎo)干擾素生成的作用。

干擾素γ(IFN-γ)主要由活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，是機體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中重要的調(diào)節(jié)分子，在抑制腫瘤細(xì)胞生長及免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要的作用。IFN-γ可增強抗原提呈細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞的相互作用，進而增強T淋巴細(xì)胞輔助抗體產(chǎn)生。IFN-γ水平的高低是機體細(xì)胞免疫的重要標(biāo)志。

腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα)是一種主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，并參與正常炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。α腫瘤壞死因子在許多病理狀態(tài)下產(chǎn)生增多，包括敗血癥、惡性腫瘤、心臟衰竭和慢性炎性疾病。在重癥類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的血液及關(guān)節(jié)中都可發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子增多。

上述黨參果膠多糖CPP1c在制備促進免疫相關(guān)基因表達(dá)的藥物中的應(yīng)用。

進一步地，免疫相關(guān)基因包括PI3K基因、CD28基因、p38MAPK基因。

PI3K的聚集與活化在協(xié)同刺激信號過程中占據(jù)重要位置。CD28與B7的結(jié)合，使CD28的胞漿區(qū)基序YMNM中Tyr173磷酸化，活化PI3K，促使PIP2轉(zhuǎn)化成PIP3，PIP3與AKT相結(jié)合，使其磷酸化而被活化?；罨腁KT誘導(dǎo)下面的級聯(lián)反應(yīng)，從而調(diào)控T細(xì)胞的功能。

不同類型的細(xì)胞(包括免疫細(xì)胞)的增殖和分化的必要而充分的條件是Ras蛋白，而Ras蛋白參與的細(xì)胞調(diào)控信號通路中，p38MAPK基因參與表達(dá)MAPK是很重要的一環(huán)，MAPK蛋白加入細(xì)胞核，使許多底物蛋白活化，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞(包括免疫細(xì)胞)的增殖和分化。

上述黨參果膠多糖CPP1c在制備促進免疫相關(guān)蛋白分子表達(dá)量的藥物中的應(yīng)用。

進一步地，免疫相關(guān)蛋白包括PI3K、CD28、p38MAPK。

上述黨參果膠多糖CPP1c在制備促進淋巴細(xì)胞歸巢的藥物中的應(yīng)用。

淋巴細(xì)胞歸巢是以淋巴細(xì)胞表面的歸巢受體與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附分子——血管地址素的相互作用為基礎(chǔ)定向移動的一種遷移活動，在淋巴細(xì)胞的成熟、再循環(huán)以及向炎癥部位滲出過程中均會發(fā)生，淋巴細(xì)胞在動物體內(nèi)的遷移、流動和歸巢是產(chǎn)生免疫功能的前提。

黨參果膠多糖CPP1c能夠促進淋巴細(xì)胞定向移動并歸巢，即提高機體的免疫能力。

上述黨參果膠多糖CPP1c在制備增強免疫力的保健品中的應(yīng)用。

一種藥物，其活性成分為黨參果膠多糖CPP1c。

一種保健品，其活性成分為黨參果膠多糖CPP1c。

以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的特征和性能作進一步的詳細(xì)描述。

實施例1

本實施例提供黨參果膠多糖CPP1c的制備和檢測方法。

黨參果膠多糖CPP1c的提取方法，包括以下步驟：

1.1黨參多糖CPP1的制備提?。狐h參藥材粉碎后，經(jīng)95％乙醇脫脂處理后，于90℃以上溫度的熱水中進行提取，提取液濃縮后，提取液用終濃度為10-40％乙醇沉淀，過濾，沉淀為粗黨參多糖CPP1，并除蛋白和色素。

1.2稱取除蛋白脫色素后的CPP1樣品100mg，溶于100mL經(jīng)0.45μm濾膜過濾的水，離心(3000rpm，3min)，取上清液。DE-52纖維素柱在用0.45μm濾膜過濾的水進行平衡后(大約12h)，將上述制得溶液上樣，流速為25mL/h。

1.3上樣結(jié)束后，用0.45μm濾膜過濾的水洗脫，洗脫速度設(shè)置為25mL/h，并用配套的試管收集洗脫液。采用苯酚硫酸法對每管中的洗脫液的吸光度進行測定，做管號(橫坐標(biāo))與吸光度值(縱坐標(biāo))的洗脫曲線，至幾乎沒有糖出現(xiàn)時，停止洗脫；將洗脫液合并，濃縮并透析后，冷凍干燥得水洗脫部分。

1.4水洗收集結(jié)束后，分別用0.1mol/L、0.2mol/L和0.4mol/L的NaCl溶液以1.2的方法進行洗脫及之后的操作，收集用0.4mol/L的NaCl溶液洗脫所得產(chǎn)物并命名為黨參果膠多糖CPP1c。

本發(fā)明的發(fā)明人通過結(jié)合多種化學(xué)分析方法及儀器分析方法等，解析了黨參果膠多糖CPP1c的結(jié)構(gòu)；通過HPGPC測得上述制備方法制備的黨參果膠多糖CPP1c產(chǎn)物純度為99.02％，表明CPP1c為均一性多糖。通過HPGPC以右旋糖酐系列標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖右旋糖酐對照品，測得CPP1c的相對分子量為1.259×10⁵Da；在0.9％NaCl和0.2％NaN₃溶液中均是呈現(xiàn)高度分支的聚合物。

黨參果膠多糖CPP1c和黨參果膠多糖CPP1a的單糖組成測定：

單糖的測定：

2.1準(zhǔn)確稱取CPP1c 10mg，準(zhǔn)確移入新鮮配制的2mol/L三氟乙酸2mL，密封好，置于120℃完全酸水解3h。3h后，取出，減壓旋干。

2.2反復(fù)加入甲醇(1-2mL)，繼續(xù)旋干，以達(dá)到將三氟乙酸完全除去的目的。向上述殘渣中繼續(xù)加入鹽酸羥胺10mg，吡啶0.5mL，同時加入肌醇六乙酰酯4mg(作為內(nèi)標(biāo))，充分混合后，置于90℃條件下繼續(xù)反應(yīng)半小時。

2.3放至室溫后，移取乙酸酐0.5mL于上述反應(yīng)液中，充分混合，同樣置于90℃條件下繼續(xù)反應(yīng)半小時，減壓旋干。將殘渣溶于適量氯仿溶液中，用0.45μm有機濾膜進行過濾后，采用GC法對樣品進行分析。各單糖的混合對照品(包含有Rha、Ara、Xyl、Man、Glu、Gal)按照2.1和2.2處理樣品的方法進行相同操作。

2.4上述操作結(jié)束后，用氣相色譜GC就行測定；GC的條件為，色譜柱：OV-101(50m×0.25mm i.d.)，進樣量1μL，程序升溫，以15℃/min從175℃升到190℃，保留5min，再以5℃/min升到250℃，保留1.5min。

糖醛酸測定：

3.1準(zhǔn)確稱取CPP1c 10mg，移入新鮮配制的2mol/L三氟乙酸2mL，密封好，置于120℃完全酸水解3h。3h后，取出，減壓旋干。

3.2反復(fù)加入甲醇(1-2mL)，繼續(xù)旋干，以達(dá)到將三氟乙酸完全除去的目的。移入78μL新鮮配制的Na₂CO₃溶液(0.5mol/L)，于30℃條件下繼續(xù)反應(yīng)45min，加入500μL新鮮配制的NaBH₄溶液(W/V，4％)，常溫下繼續(xù)反應(yīng)1.5h后。

3.3為除去未反應(yīng)的NaBH₄，向3.2溶液中慢慢加入新鮮配制的25％乙酸，一直到不再有氣泡產(chǎn)生為止。將反應(yīng)液過已處理的732型陽離子交換樹脂，并用6mL水進行洗脫。收集洗脫液，并于45℃條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干后，反復(fù)加入適量甲醇，繼續(xù)旋干，以達(dá)到將硼酸鹽完全除去的目的。

3.4將3.3殘渣密封后，置于85℃反應(yīng)2h后，用1mL吡啶將殘渣溶解，并加正丙胺1mL后，混勻并密封，于55℃繼續(xù)反應(yīng)0.5h。放冷后，55℃水浴條件下，氮氣吹干。向殘渣中相繼滴入吡啶及乙酸酐各500μL，密封后，95℃繼續(xù)反應(yīng)1h。放冷，0.45μm有機濾膜過濾除雜后，采用GC法分析樣品。各單糖的混合對照品(包含有Rha、Ara、Xyl、Man、Glu、Gal、GluA、GalA)按照3.1-3.3處理樣品的方法進行相同操作。

上述操作結(jié)束后，通過氣相色譜GC進行測定，氣相色譜色譜柱：OV-101(50m×0.25mm i.d.)；進樣量：2μL；程序升溫：160℃保留4min，以5℃/min升到190℃保留4min，再以3℃/min升到210℃保留15min，以10℃/min升到260℃保留5min。

核磁測定：

稱取20mg干燥的黨參果膠多糖CPP1c和黨參果膠多糖CPP1a，反復(fù)用D₂O(0.5mL)溶解并冷凍干燥三次后，進行¹H NMR及¹³C NMR分析。

通過上述方法測得黨參果膠多糖CPP1c由鼠李糖Rha、阿拉伯糖Ara、半乳糖Gal和半乳糖醛酸GalA按照摩爾比2.99:1.154:1.94:33.29構(gòu)成；黨參果膠多糖CPP1c的糖鏈為1→4連接的鼠李糖Rha、1→5連接的阿拉伯糖Ara、1→4連接的半乳糖醛酸GalA和1→6連接的半乳糖Gal；其結(jié)構(gòu)單元具有以下結(jié)構(gòu)式：

實施例2

本實施例提供黨參果膠多糖CPP1c在制備促進淋巴細(xì)胞增殖的藥物中的應(yīng)用。

體外實驗

第一部分，淋巴細(xì)胞的制備

將在無菌條件下獲得的SAMP8小鼠或正常小鼠的脾臟用淋巴細(xì)胞分離液進行分離，將其轉(zhuǎn)到離心管中，并小心沿著管壁加入1640培養(yǎng)基，使其與分離液形成界面。3000rpm離心0.5h。用吸管小心將呈霧狀的脾細(xì)胞層吸出，用培養(yǎng)基進行清洗后，將細(xì)胞調(diào)整為所需濃度。

第二部分，淋巴細(xì)胞增殖實驗

1.1實驗分組，正常組：普通小鼠脾淋巴細(xì)胞+空白培養(yǎng)基；模型組：SAMP8小鼠脾淋巴細(xì)胞+空白培養(yǎng)基；黨參果膠多糖CPP1c給藥組：SAMP8小鼠脾淋巴細(xì)胞+CPP1c(CPP1c的終濃度為50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)。

1.2細(xì)胞懸液，按照1.1分組情況，分別將普通小鼠或SAMP8小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液種板，每孔50μL(約含細(xì)胞1×10⁴個)，設(shè)9個平行孔。

1.3給藥，按1.2平行孔分組，向正常組和模型組加空白培養(yǎng)基，向黨參果膠多糖CPP1c給藥組加入梯度濃度的黨參果膠多糖CPP1c；每個組中的3個孔加入刀豆蛋白ConA(5μg/mL)100μL，3個孔加入LPS(10μg/mL)100μL，另3孔加入空白培養(yǎng)基100μL。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)，于培養(yǎng)箱中孵育48h，每個孔加入20μL濃度為5mg/mL的MTT，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中4h后，加入SDS，小心吹打，使其充分混勻。

1.5孵育，繼續(xù)孵育12h后，測OD值(570nm)。

按照公式計算刺激指數(shù)：刺激指數(shù)(SI)＝ConA誘導(dǎo)孔OD均值/無ConA誘導(dǎo)孔OD均值；或刺激指數(shù)(SI)＝LPS誘導(dǎo)孔OD均值/無LPS誘導(dǎo)孔OD均值；刺激指數(shù)與細(xì)胞增殖呈正相關(guān)的相關(guān)，即刺激指數(shù)大細(xì)胞的增殖能力強。

結(jié)果如圖1所示，與正常組小鼠比較，模型組的刺激指數(shù)明顯降低；黨參果膠多糖CPP1c給藥組在ConA或LPS的的誘導(dǎo)下，刺激指數(shù)較模型組高，而且隨著給藥濃度的提高刺激指數(shù)增加明顯。由于刺激指數(shù)與增殖能力正相關(guān)。所以可以得出：模型組小鼠脾淋巴細(xì)胞在ConA或LPS誘導(dǎo)增殖能力明顯減低，而黨參果膠多糖CPP1c給藥組與模型組相比較，且呈現(xiàn)劑量依賴性，從而表明黨參果膠多糖CPP1c具有促進淋巴細(xì)胞增殖的能力。

實施例3

本實施例提供黨參果膠多糖CPP1c在制備改善淋巴細(xì)胞活性的藥物中的應(yīng)用。

體外實驗

參考實施例2制備的小鼠淋巴細(xì)胞和分組。

進行體外淋巴細(xì)胞活性的實驗；方法如下：

1.1分別將普通小鼠或SAMP8小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液種于24孔板中，每孔500μL(約含1×10⁷個)。

1.2按正常組：普通小鼠脾淋巴細(xì)胞+空白培養(yǎng)基；模型組：SAMP8小鼠脾淋巴細(xì)胞+空白培養(yǎng)基；黨參果膠多糖CPP1c給藥組：SAMP8小鼠脾淋巴細(xì)胞+CPP1c(CPP1c的終濃度為50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)分組；分別向正常組和模型組加空白培養(yǎng)基，向黨參果膠多糖CPP1c給藥組加入梯度濃度的黨參果膠多糖CPP1c，每組設(shè)置2個平行孔。于培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，將細(xì)胞分別收集在離心管中，離心，輕輕吸出細(xì)胞上方的培養(yǎng)上清液，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3加入PBS洗去培養(yǎng)基后，再次加入500μL的PBS重懸細(xì)胞。取每組細(xì)胞懸液100μL兩份，其中一份分別加FITC-CD3 1μL，PE-CD28 2.5μL，APC-152 5μL，混合均勻后，4℃避光反應(yīng)0.5h。另一份加1.25μL的PE-CD3，5μL的PE/CY7-CD8，0.5μL的FITC-CD4，混合均勻后，4℃避光反應(yīng)0.5h。離心，收集各組細(xì)胞，分別用PBS將其重懸，流式細(xì)胞儀測定。

體內(nèi)實驗

本實驗共設(shè)4組，即正常組、模型組、CPP1c給藥組以及胸腺肽陽性對照組。其中，正常組小鼠為普通小鼠，模型組、給藥組以及陽性對照組小鼠均為SAMP8小鼠，每組10只。給藥組小鼠灌胃黨參多糖CPP1c(200mg/kg)，陽性對照組小鼠灌胃胸腺肽(10mg/kg)、正常組及模型組均灌胃等量的生理鹽水，灌胃14天后，進行實驗。

按照實施例2提供的淋巴細(xì)胞制備的方法，制備上述各組小鼠的脾淋巴細(xì)胞懸液，并根據(jù)本實施例體外實驗的細(xì)胞重懸方法重懸體內(nèi)實驗組的淋巴細(xì)胞并進行觀察。

體外實驗測得CPP1c對T細(xì)胞亞群比例的影響，如表1所示，相較于正常組，模型組小鼠CD8⁺T細(xì)胞比例降低(P＜0.05)，CD4⁺T細(xì)胞的比例升高，且CD4⁺/CD8⁺比值較高(P＜0.05)，偏離正常值(1.5-2.5)；同時，模型鼠中，促進T細(xì)胞活化的CD28⁺T的比例降低(P＜0.05)，抑制T細(xì)胞活化的CD152⁺T細(xì)胞表達(dá)升高(P＜0.05)。相較于模型組，CPP1c給藥組小鼠CD8⁺T細(xì)胞比例升高，CD4⁺T細(xì)胞的比例降低，使得CD4⁺/CD8⁺比值具有降低趨勢，接近正常值；另外，給藥組小鼠的CD28⁺T細(xì)胞比例升高，CD152⁺T細(xì)胞比例降低。

表1 CPP1c對體外培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞T細(xì)胞亞群比例的影響(n＝3)

a表示與Normal組相比有顯著性差異，即P<0.05；b均表示與Model組有顯著性差異，即P<0.05。

體內(nèi)實驗結(jié)果如表2所示，相較于正常組，模型組小鼠脾淋巴細(xì)胞CD8⁺T細(xì)胞比例降低(P＜0.05)，CD4⁺T細(xì)胞的比例升高，且CD4⁺/CD8⁺比值偏離正常值(P＜0.05)；同時，CD28⁺T細(xì)胞的比例減少(P＜0.05)，CD152⁺T細(xì)胞的比例升高(P＜0.05)。相較于模型組，CPP1c給藥組小鼠及胸腺肽陽性對照組小鼠，CD8⁺T細(xì)胞比例升高，CD4⁺T細(xì)胞的比例降低，使CD4⁺/CD8⁺比值接近正常值；另外，給藥組小鼠CD28⁺T細(xì)胞比例升高，CD152⁺T細(xì)胞比例降低。

表2 CPP1c對體內(nèi)培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞T細(xì)胞亞群比例的影響(n＝3)

a表示與Normal組相比有顯著性差異，即P<0.05；b均表示與Model組有顯著性差異，即P<0.05。

因此，CPP1c能促進小鼠CD28⁺T細(xì)胞比例升高，CD152⁺T細(xì)胞比例降低。

實施例4

本實施例提供黨參果膠多糖CPP1c在制備促進免疫相關(guān)分子分泌的藥物中的應(yīng)用。

體外實驗

采用ELISA法對細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-2、IFN-γ、TNF-α含量進行測定。具體實驗步驟如下：

1.1實驗前，將所有需要用到的試劑充分混合均勻，混合過程中避免泡沫的產(chǎn)生，并將其放在室溫中平衡0.5h。

1.2將稀釋后的不同濃度的Cytokine standard及樣品加入實驗孔中，每孔100μL，同時設(shè)置只加Dilutionbuffer R(1×)的空白孔，均設(shè)復(fù)孔3個。

1.3每孔加入稀釋后的Biotinylated antibody，孵育1.5h后，進行清洗。隨后，每孔加入稀釋后的Streptavidin-HRP并孵育0.5h，清洗后，加入TMB，37℃避光溫育20min左右，加入Stop solution終止反應(yīng)，測OD值(450nm)。

1.4制作標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與OD值間的線性曲線，并計算樣品濃度。

體內(nèi)實驗

取小鼠全血，放置2h后，離心，取血清，按照上述的ELISA方法操作，檢測血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α含量。

在體外實驗中，結(jié)果如圖2所示，模型組小鼠的IL-2、IFN-γ及TNF-α含量較正常小鼠顯著降低(P＜0.05)。相較于模型組，CPP1c給藥組的IL-2、IFN-γ及TNF-α分泌量均明顯升高且呈劑量依賴型。

在體內(nèi)實驗中，如圖3所示，模型組小鼠的IL-2、IFN-γ及TNF-α含量較正常小鼠顯著下降(P＜0.05)。相較于模型組，CPP1c組及胸腺肽陽性對照組的IL-2、IFN-γ及TNF-α含量均顯著升高。

因此，CPP1c可能以促進脾細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-2及TNF-α的方式，增強機體的免疫功能，從而發(fā)揮免疫作用。

實施例5

本實施例提供黨參果膠多糖CPP1c在制備促進免疫相關(guān)基因表達(dá)的藥物中的應(yīng)用。

體外實驗

參考實施例2的細(xì)胞培養(yǎng)、分組和重懸的步驟，設(shè)置待測組和對照組；分別收集各組細(xì)胞，并提取樣本的總RNA，測定其濃度并將各樣本RNA濃度調(diào)整一致，進行逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量qRT-PCR，并以β-actin作為內(nèi)參基因，測定各組PI3K基因、CD28基因、p38MAPK基因mRNA的相對表達(dá)量。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)擴增曲線及溶解曲線和Ct值，用相對定量的方法，計算相對表達(dá)量。

相對表達(dá)量F＝2^{-{[待測組基因Ct平均值-待測組內(nèi)參基因Ct平均值]-[對照組基因Ct平均值-對照組內(nèi)參基因Ct平均值]}}

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：2×RT Mix 10μL，HiSCRIPT Enzyme Mix 2μL，Oligo(dT)18(50μM)1μL，Random hexamers(50ng/μL),1μL，Total RNA 10pg-1μg，RNase free ddH₂O補足到20μL。反應(yīng)程序，25℃，5min；50℃，15min；85℃，5min。

熒光定量qRT-PCR反應(yīng)體系，AceQTM qPCR SYBR Green Master Mix，10μL；primer F，0.4μL，primer R，0.4μL，ROX Reference Dye 1，0.4μL；cDNA，2μL；ddH₂O補足到20。反應(yīng)程序為：預(yù)變性，95℃，5min；循環(huán)反應(yīng)，95℃，10s，60℃，30s；循環(huán)40次；溶解曲線，95℃，15s；60℃，60s，95℃，15s。

體內(nèi)實驗

按照實施例2提供的淋巴細(xì)胞制備的方法，取實施例3提供的體內(nèi)實驗組小鼠的脾淋巴細(xì)胞。按照本實施例體外實驗提供的實驗方法，檢測各組細(xì)胞中的PI3K基因、CD28基因、p38MAPK基因mRNA的相對表達(dá)量。

擴增反應(yīng)所用引物對如表3所示。

表3 PCR反應(yīng)所用引物

本實驗中，以β-actin為內(nèi)參基因，以模型組為對照組，采用相對定量法2^-ΔΔCt，測各基因的mRNA的表達(dá)量。

體外實驗結(jié)果如圖4顯示，與模型組小鼠相比，CPP1c組小鼠脾淋巴細(xì)胞中PI3K、CD28、p38MAPK基因的mRNA的表達(dá)量均呈升高趨勢(P＜0.05)，且呈劑量依賴型；而在體內(nèi)實驗結(jié)果如圖5顯示，與模型組小鼠相比，CPP1c組及胸腺肽陽性對照組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中PI3K、CD28、p38MAPK基因的mRNA的表達(dá)量明顯升高(P＜0.05)。

因此，CPP1c可通過促進p38MAPK、CD28及PI3K基因的mRNA的表達(dá)，發(fā)揮增強免疫的作用。

實施例6

本實施例提供了黨參果膠多糖CPP1c在制備促進免疫相關(guān)蛋白分子表達(dá)量的藥物中的應(yīng)用。

體外實驗

參考實施例3的細(xì)胞培養(yǎng)、分組和重懸的步驟，設(shè)置待測組和對照組；分別收集各組細(xì)胞，加入裂解液進行裂解，離心并取上清液。測上清液中所含蛋白量，將各樣品調(diào)整為相同的蛋白濃度后，加入上樣緩沖液(細(xì)胞蛋白溶液：上樣緩沖液＝3:1)并煮沸10min，所得即為樣品溶液。將樣品上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后，分別用一抗(PI3K、p38MAPK及CD28)及相應(yīng)二抗孵育，TBST清洗后，加入ECL發(fā)光液，并用凝膠成像儀分析。

體內(nèi)實驗

按照實施例2提供的淋巴細(xì)胞制備的方法，取實施例3體內(nèi)實驗組小鼠的脾淋巴細(xì)胞。按照本實施例體外實驗提供的實驗方法，檢測各組PI3K、CD28、p38MAPK蛋白的含量。

在體外實驗中，結(jié)果如圖6所示，圖中，左圖為蛋白質(zhì)印跡結(jié)果圖，右圖為目的蛋白現(xiàn)對于內(nèi)參的表達(dá)量比值圖；相較于模型組，不同劑量濃度的CPP1c對SAMP8小鼠的脾淋巴細(xì)胞p38MAPK、CD28及PI3K蛋白表達(dá)量均呈現(xiàn)增加趨勢。

在體內(nèi)實驗中，結(jié)果如圖7所示，圖中，左圖為蛋白質(zhì)印跡結(jié)果圖，右圖為目的蛋白相對于內(nèi)參的表達(dá)量比值圖；與模型組比較，CPP1c組及胸腺肽陽性對照組小鼠的脾淋巴細(xì)胞p38MAPK、CD28及PI3K蛋白表達(dá)量均增加。

因此，可以看出，CPP1c可以通過促進小鼠的脾淋巴細(xì)胞p38MAPK、CD28及PI3K蛋白表達(dá)量增加；從而提高免疫能力。

實施例7

本實施例提供黨參果膠多糖CPP1c在制備促進淋巴細(xì)胞歸巢的藥物中的應(yīng)用。

本實驗中，保證所有操作均在25℃條件下進行

1.1取未給藥的正常小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液(含2×10⁷個細(xì)胞)于離心管中，離心后，細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基洗1次。棄上清，使離心管中剩余液體小于25μL。

1.2加1mL稀釋液C，輕輕重懸細(xì)胞。

1.3染液的配制：向1mL稀釋液C中加入4μL PKH26的乙醇溶液。

1.4將1mL淋巴細(xì)胞懸液迅速加入到1mL上述染液中，染色5min。

1.5加入2mL血清終止染色，并培養(yǎng)1min。離心，用完全培養(yǎng)基洗1.4轉(zhuǎn)染的細(xì)胞2次后，重懸細(xì)胞。

1.6小鼠射尾靜脈注射PKH26染色的淋巴細(xì)胞懸液，0.5mL/只(約含細(xì)胞5×10⁵個)，活體成像儀追蹤，并拍照。

實驗結(jié)果如圖8所示，在注射PKH26標(biāo)記小鼠淋巴細(xì)胞1h后，可以看到淋巴細(xì)胞廣泛分布于小鼠體內(nèi)。而7、21及24h后，在正常小鼠中，淋巴細(xì)胞逐漸移向淋巴組織(如胸腺、脾臟)，并最終(24h)歸巢于脾臟。在模型鼠中，淋巴細(xì)胞雖然也逐漸移向淋巴組織(如胸腺、脾臟)，但由于模型鼠胸腺的萎縮及淋巴細(xì)胞功能的下降，而使大部分淋巴細(xì)胞最終(24h時)歸巢于胸腺。在SAMP8鼠灌胃給藥CPP1c或胸腺肽后，大部分淋巴細(xì)胞出現(xiàn)向脾臟及胸腺歸巢的現(xiàn)象，從而表明CPP1c具有促進淋巴細(xì)胞歸巢的功能。

實施例8

本實施例提供了黨參果膠多糖CPP1c在制備增強免疫力的保健品中的應(yīng)用。

該保健品具有促進淋巴細(xì)胞增殖、改善淋巴細(xì)胞活性、促進免疫相關(guān)分子及相關(guān)基因表達(dá)和促進淋巴細(xì)胞歸巢的作用。

實施例9

本實施例提供了一種藥物，該藥物的活性成分為黨參果膠多糖CPP1c，該藥物還包括其他的常規(guī)增強免疫的藥物。

該藥物具有增強機體免疫的作用。

實施例10

本實施例提供了一種保健品，該保健品的活性成分為黨參果膠多糖CPP1c，該保健品還包括其他常規(guī)的增強免疫的保健藥。

該保健品具有增強機體免疫的作用。

綜上所述，本發(fā)明實施例的黨參果膠多糖CPP1c在制備增強免疫的藥物及保健品中的應(yīng)用；黨參果膠多糖CPP1c能促進促進淋巴細(xì)胞增殖、改善淋巴細(xì)胞活性、促進免疫相關(guān)分子及相關(guān)基因表達(dá)和促進淋巴細(xì)胞歸巢，具有較好的醫(yī)藥價值和保健功能，值得推廣和應(yīng)用。

以上所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。本發(fā)明的實施例的詳細(xì)描述并非旨在限制要求保護的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。