技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種中藥制劑及其新用途，特別是涉及一種中藥組合物及其在制備抗血栓藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

有研究表明,惡性腫瘤并發(fā)靜脈血栓的比率可達(dá)2.74％～12.1％,其中以胰腺癌、肺癌NSCLC和胃腸癌的發(fā)生率最高，不但影響患者的生活質(zhì)量，而且延誤抗腫瘤治療。Donati(RicciS,Ant onuz zoA,Gall L,et al.Gemcitabine monotherapy in eld erly patient s with advanced non small celI lung cancer:a mat icen ter phase study.Lung Cancer,2000,27(2):75 80)研究顯示:在腫瘤患者的死亡原因中,血栓及相關(guān)并發(fā)癥僅次于腫瘤本身位居第二。靜脈血栓栓塞、肺栓塞和輕度的DIC的發(fā)生是常見的表現(xiàn)(Rickles FR,Levine M,Edwards RL.Hemostatic alterations in cancer patients.Cancer Metastasis Rev.1992；11:237–248.Buller HR,van Doormaal FF,van Sluis GL,Kamphuisen PW.Cancer and thrombosis:from molecular mechanisms to clinical presentations.J Thromb Haemost.2007；5(Suppl 1):246–254)。凝血紊亂是惡性腫瘤疾病常見的并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為血液高凝導(dǎo)致血栓形成。本發(fā)明口服液，在臨床應(yīng)用中具有治療血栓的作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種抗血栓作用的中藥制劑。

本發(fā)明的目的在于公開一種中藥制劑在抗血栓作用中的新用途。

本發(fā)明的目的在于公開一種中藥制劑在減少肺臟、肝臟及腸系膜組織血栓的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明所述中藥制劑采用如下原料藥制成(按重量份計)：

本發(fā)明所述中藥制劑采用如下原料藥制成(按重量份計)：

所述中藥制劑的原料藥優(yōu)選為：

以原料藥量計算，相當(dāng)于10g原料藥的所述組合物中大黃素、大黃酚的總量不少于0.28mg。

上述中藥原料可按常規(guī)工藝加入常規(guī)輔料制成片劑、膠囊、口服液、丸劑、顆粒劑等臨床可接受的劑型。

以生藥材(原料藥)量計算，相當(dāng)于10g生藥的所述組合物制劑中大黃素、大黃酚的總量不得少于0.28mg。

人參皂苷Rg₁、Re總量計不低于100μg、人參皂苷Rb₁不低于50μg；水蘇堿不低于50μg；吳茱萸堿、吳茱萸次堿總量計不低于100μg；芍藥苷50μg。

中藥組合物的口服液制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟：

步驟1：鱉甲加水煎煮2-4次，每次2-4小時，合并提取液，濾過，濾液濃縮為鱉甲煎液；

步驟2：當(dāng)歸、川芎、姜黃、高良姜、肉桂、丁香、阿魏、降香水蒸氣蒸餾提取5-7小時，收集揮發(fā)油與蒸餾液，

步驟3：步驟2水蒸氣蒸餾提取剩余的藥渣與其余原藥材加水煎煮2-4次，每次1-3小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至清膏1，

步驟4：步驟3的清膏1加乙醇至含醇量達(dá)60-80％，調(diào)節(jié)pH值為7.5～8.0，靜置，濾過，濾液回收乙醇，加水得清膏2，

步驟5：步驟4中的清膏2步驟1的鱉甲煎液，煮沸，放冷，加步驟2的揮發(fā)油與蒸餾液及口服液的常規(guī)輔料，加水?dāng)嚢枋谷芙?，靜置，濾過，濾液經(jīng)常規(guī)工藝制成口服液；

所述步驟2和/或4的靜置為：0～5℃靜置；

所述步驟5中加入口服液的常規(guī)輔料為：1-5重量份聚山梨酯80、1-5重量份甜蜜素。

所述制備方法還包括步驟6：大黃素、大黃酚的總量的含量測定；和/或下述鑒別A、B、C任一一種或幾種。

本發(fā)明還提供該組合物口服液的制備方法，該方法包括如下步驟：

鱉甲加水煎煮2-4次，每次2-4小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至適量；當(dāng)歸、川芎、姜黃、高良姜、肉桂、丁香、阿魏、降香水蒸氣蒸餾提取5-7小時，收集揮發(fā)油與蒸餾液適量，藥渣及其余二十五味加水煎煮2-4次，每次1-3小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度約1.15(50～60℃)的清膏，加乙醇使含醇量達(dá)60-80％，調(diào)節(jié)pH值為7.5～8.0，靜置(0～5℃)10-40小時，濾過，濾液回收乙醇，加水至相對密度約1.06(50～60℃)的清膏，再加入鱉甲煎液，煮沸10-30分鐘，放冷，加揮發(fā)油與蒸餾液及1-5重量分聚山梨酯80、1-5重量分甜蜜素，加水?dāng)嚢枋谷芙?，靜置(0～5℃)24～48小時，濾過，濾液加水至1000體積份，灌封，滅菌，即得；所述體積份與重量份的關(guān)系為g/ml。

所述中藥口服液的制備方法優(yōu)選為：

以上三十四味，鱉甲加水煎煮3次，每次3小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至適量；當(dāng)歸、川芎、姜黃、高良姜、肉桂、丁香、阿魏、降香水蒸氣蒸餾提取6小時，收集揮發(fā)油與蒸餾液適量，藥渣及其余二十五味加水煎煮3次，每次2小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度約1.15(50～60℃)的清膏，加乙醇使含醇量達(dá)60-80％，調(diào)節(jié)pH值為7.5～8.0，靜置24小時，濾過，濾液回收乙醇，加水至相對密度約1.06(50～60℃)的清膏，再加入鱉甲煎液，煮沸20分鐘，放冷，加揮發(fā)油與蒸餾液及2重量分聚山梨酯80、甜蜜素2重量分，加水?dāng)嚢枋谷芙?，靜置24～48小時，濾過，濾液加水至1000體積份，灌封，滅菌，即得。

本發(fā)明所述組合物口服液的制備方法，該方法包括如下步驟：

選取如下原料藥：

鱉甲加加9倍水煎煮3次，每次3小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至160-200ml；當(dāng)歸、川芎、姜黃、高良姜、肉桂、丁香、阿魏、降香加12倍水，水蒸氣蒸餾提取6小時，收集揮發(fā)油與蒸餾液40-60ml，藥渣及其余二十五味加水煎煮三次，第一次加水12倍量煎煮2小時，第二、三次分別加水10倍、8倍，煎煮各1.5小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至50～60℃相對密度為1.15的清膏，加乙醇使含醇量達(dá)70％，調(diào)節(jié)pH值為7.5～8.0，0～5℃靜置20-30小時，濾過，濾液回收乙醇，加水至50～60℃相對密度為1.06的清膏，再加入鱉甲煎液，煮沸20分鐘，放冷，加揮發(fā)油與蒸餾液及聚山梨酯80、甜蜜素，加水?dāng)嚢枋谷芙猓?～5℃靜置24～48小時，濾過，濾液加水，灌封，105℃滅菌60min。

本發(fā)明進(jìn)一步提供上述的中藥制劑在制備抗血栓藥物中的應(yīng)用。所述血栓為抑制靜脈血栓或微血栓。

本發(fā)明進(jìn)一步提供上述的中藥制劑在制備降低血液高凝狀態(tài)或降低微血栓形成后繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明口服液在大鼠血栓模型中具有顯著的降低血液高凝狀態(tài)、減少微血栓形成及降低繼發(fā)性纖溶的作用。在高凝狀態(tài)中會存在繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)，從而表現(xiàn)為FDP和D-二聚體水平的升高。本研究中，我們觀察到兩個治療組的共30個數(shù)據(jù)中約83.3％(10/12)的數(shù)據(jù)與對照組相比有明顯差異。通過組織病理學(xué)分析，在對照組及兩個治療組中均發(fā)現(xiàn)明顯的血管微血栓形成。我們觀察到給予本發(fā)明服液灌胃處理后兩個治療組大鼠中的肺臟、肝臟及腸系膜組織中微血栓的數(shù)量均明顯減少。

附圖說明

圖1：各組大鼠血小板檢測值；

^*P<0.05與空白組比較；^△P<0.05與對照組比較；^▲P<0.05與治療組A比較

圖2-1：正常大鼠肺臟顯微鏡圖；

圖2-2：大鼠肺臟微血栓顯微鏡圖；

圖2-3：正常大鼠肝臟顯微鏡圖；

圖2-4：大鼠肝臟微血栓顯微鏡圖；

圖2-5：正常大鼠腸系膜顯微鏡圖；

圖2-6：大鼠腸系膜微血栓顯微鏡圖

圖3：大鼠肝、肺、腸系膜組織內(nèi)高倍視野下微血栓數(shù)量

^*P<0.05與對照組比較

實驗例1：

1材料與方法

1.1動物

使用體質(zhì)量為180-220g的雄性SD大鼠，7～9周齡(由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供)。在溫度控制室內(nèi)飼養(yǎng)(室溫24±1℃，濕度不得低于40％)，保持12h的明/暗循環(huán)，所有大鼠均提供飲水及食物?？瞻捉M、對照組、治療A組(造模后給予實施例1口服液)和治療B組(造模前3天及造模后均給予實施例1口服液)各包括10只大鼠。

1.2實驗儀器與試劑

角叉菜膠(SIGMA ALDAICH，USA)，電子天平(Sartorius，型號：BS 423S)，顯微鏡，全自動血液分析儀(型號：LH750，美國Beckman公司)；全自動凝血分析儀(型號：Acl-Top，美國IL公司)。

1.3實驗動物分組

將SD大鼠隨機(jī)分為4組，即空白組、對照組、治療A組和治療B組，每組10只。

1.4制作大鼠血栓模型

取SD雄性大鼠，角叉菜膠用生理鹽水配制成2％(20mg/mL)濃度，皮下注射(20mg/kg)，注射部位為后肢足跖部。注射后置于室溫下，多數(shù)動物尾尖部出現(xiàn)暗紅色血栓形成區(qū)，并逐漸向尾根部擴(kuò)大。48～72h后局部從發(fā)紺變?yōu)楹谏?，隨后尾部干細(xì)斷落。評價：24h實驗動物尾部小靜脈和毛細(xì)血管內(nèi)含有大量纖維素和少量白細(xì)胞及血小板，血管內(nèi)皮細(xì)胞核濃縮呈骰子狀，血管內(nèi)壁中性粒細(xì)胞靠邊。72h可見較大血管呈炎癥改變，伴有混合性血栓形成。

1.5實驗方案

4組大鼠均觀察72小時。觀察期間，治療A組大鼠皮下注射角叉菜膠后72h內(nèi)均給予實施例1口服液灌胃處理(2mL/100g體質(zhì)量，1次/8h)。治療B組大鼠在注射角叉菜膠前72h即給予實施例1口服液灌胃處理(2mL/100g體質(zhì)量，1次/8h)，注射角叉菜膠后72h內(nèi)亦給予實施例1口服液灌胃處理(2mL/100g體質(zhì)量，1次/8h)。分別在注射角叉菜膠后24h、48h、72h三個時間點取血標(biāo)本行血常規(guī)、凝血(PT、APTT、INR、FIB、PTA)、D-二聚體含量、纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)IB)、纖維蛋白降解產(chǎn)物(fibrin degradation product，F(xiàn)DP)檢查。在注射角叉菜膠后72h分離出大鼠的肺臟、肝臟及腸系膜組織使用10％的福爾馬林固定。標(biāo)本進(jìn)行脫水后再用石蠟包埋。分別取大鼠左肺上葉、右半肝部及中段小腸系膜進(jìn)行切片，制成切片后(4μm厚)用蘇木精和伊紅染色并進(jìn)行組織病理學(xué)分析，10倍鏡下尋找并選取微血栓數(shù)量最多的視野，在40倍鏡下計數(shù)微血栓個數(shù)。由于標(biāo)本或技術(shù)的原因，部分大鼠標(biāo)本檢測失敗，我們均嚴(yán)格按照隨機(jī)原則重復(fù)進(jìn)行實驗并補充缺失數(shù)據(jù)。

1.6統(tǒng)計分析

每組數(shù)據(jù)均用表示。采用SAS 9.1(血液化驗指標(biāo))及SPSS 9.1(微血栓個數(shù))統(tǒng)計軟件來比較組間差異的統(tǒng)計學(xué)意義。其中對各組血液化驗指標(biāo)進(jìn)行正態(tài)性檢驗后分別采取welch檢驗、Kruskal-wallis檢驗、SNK檢驗來進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組微血栓數(shù)量采用Bonferroni檢驗來進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組大鼠血凝指標(biāo)變化

對照組大鼠三個時間點的PT、APTT值均比空白組明顯縮短，PTA檢測值則明顯升高(表1，P<0.05)；空白組與對照組的INR值之間無統(tǒng)計學(xué)差異；對照組的48小時、72小時FIB值檢測值與空白組相比明顯升高(表1，P<0.05)。以上結(jié)果表明對照組大鼠血液處于高凝狀態(tài)。

與空白組相比：兩個治療組24小時、48小時PT檢測值與其無差異，而72小時PT檢測值則明顯縮短。治療A組、治療B組的三個時間點的PT結(jié)果均比對照組明顯延長(表1，P<0.05)，提示兩個治療組大鼠的血液高凝狀態(tài)均比對照組明顯改善。兩個治療組之間的PT結(jié)果均無差異。

與空白組相比：只有治療B組的72小時的APTT檢測值與之無統(tǒng)計學(xué)差異(表1，P>0.05)。治療A組、治療B組的48小時、72小時的APTT結(jié)果均比對照組明顯延長(表1，P<0.05)。兩個治療組之間相比，只有治療A組的72小時APTT值比治療B組明顯延長。

兩個治療組的INR檢測值中除治療A組的24小時的INR值與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異外，均比對照組明顯增大(表1，P<0.05)。與空白組相比除治療A組的24小時檢測值外均明顯增大。兩個治療組之間的INR結(jié)果均無差異。

兩個治療組中，除治療A組的72小時FIB值、治療B組的24小時FIB值外，其余均比對照組明顯降低(表1，P<0.05)。與空白組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異。兩個治療組中，只有治療B組72小時FIB值比治療A組明顯降低。

兩個治療組中只有治療A組的48小時PTA值與對照組相比明顯升高，余均無統(tǒng)計學(xué)差異(表1，P>0.05)。兩個治療組與空白組相比均明顯升高。兩個治療組之間只有治療A組48小時PTA值比治療B組明顯升高。

以上結(jié)果表明兩個治療組大鼠的血液血凝指標(biāo)絕大多數(shù)均比對照組明顯改善。

表1各組大鼠血凝指標(biāo)結(jié)果

^*P<0.05與空白組比較；^△P<0.05與對照組比較；^▲P<0.05與治療組A比較.

注：PT：凝血酶原時間；APTT：活化部分凝血活酶時間；INR：國際標(biāo)準(zhǔn)化比值；FIB：纖維蛋白原；PTA：凝血酶原活動度。

2.2各組大鼠纖溶指標(biāo)變化

對照組大鼠三個時間點的FDP、D-二聚體檢測值與空白組大鼠相比均明顯升高(表2，P<0.05)，表明對照組大鼠纖溶明顯亢進(jìn)，亦是血液高凝的表現(xiàn)。

治療A組、治療B組的三個時間點的FDP結(jié)果均比對照組明顯減少(表2，P<0.05)。與空白組相比：治療A組24小時、48小時的FDP值明顯增大(表2，P<0.05)，余均無統(tǒng)計學(xué)差異。治療B組24小時、48小時的FDP值比治療A組明顯減小(表2，P<0.05)。

治療A組、治療B組的48小時、72小時的D-二聚體結(jié)果均比對照組明顯減少(表2，P<0.05)。與空白組相比：兩個治療組的D-二聚體值與之均有統(tǒng)計學(xué)差異(表2，P<0.05)。兩個治療組之間的D-二聚體值均無統(tǒng)計學(xué)差異。

以上結(jié)果表明兩個治療組大鼠的血液纖溶指標(biāo)絕大多數(shù)均比對照組明顯改善。

表2各組大鼠纖溶指標(biāo)結(jié)果

^*P<0.05與空白組比較；^△P<0.05與對照組比較；^▲P<0.05與治療組A比較.

注：FDP：纖維蛋白降解產(chǎn)物；D-Dimer：D-二聚體。

2.3各組大鼠血小板檢測值

對照組大鼠三個時間點的PLT檢測值與空白組大鼠相比均明顯升高(圖1，P<0.05)。

治療A組、治療B組的三個時間點的PLT結(jié)果均比對照組明顯減少(圖1，P<0.05)。治療A組24小時PLT結(jié)果比空白組明顯升高，24小時結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異，48小時結(jié)果則明顯降低。治療B組三個時間點檢測結(jié)果均比空白組明顯降低。兩個治療組之間相比：治療B組24小時、48小時的PLT值比治療A組明顯低。治療B組與空白組、對照組及治療組A比均具有顯著性差異*P<0.05.

2.4組織病理學(xué)分析

治療組與對照組大鼠在注射角叉菜膠72小時后處死并將其肺臟、肝臟及腸系膜組織制作病理切片。經(jīng)過H-E染色后進(jìn)行病理學(xué)分析，可以發(fā)現(xiàn)在40倍放大視野下，對照組大鼠的肺臟、肝臟、腸系膜組織內(nèi)可見廣泛的微血栓形成。在對照組肺臟中亦可見到毛細(xì)血管出血、間質(zhì)內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤等病理改變。在對照組肝臟中可見到局部肝細(xì)胞濁腫變性及點片狀壞死。在對照組腸系膜中可見到局部充血、出血(圖2)。

圖2在各組大鼠經(jīng)歷72h的處理之后，取走肺臟、肝臟和腸系膜組織，進(jìn)行H-E染色后通過描述的方法進(jìn)行組織學(xué)檢查。箭頭所指處即為血管內(nèi)微血栓形成，相關(guān)資料如圖(放大倍數(shù)，×40)。

我們在10倍鏡視野下選取微血栓數(shù)量最多的視野，并在40倍鏡下計數(shù)微血栓的數(shù)量，通過比較發(fā)現(xiàn)兩個治療組的肺臟、肝臟及腸系膜組織內(nèi)微血栓的數(shù)量均較對照組明顯減少，而治療組之間微血栓的數(shù)量則無統(tǒng)計學(xué)差異(圖3)。

具體實施方式

下述實施方式均能實現(xiàn)上述實驗例的效果

實施例1：

以上三十四味藥材，鱉甲加水煎煮3次(加9倍水)，每次3小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至適量(約180ml)；當(dāng)歸、川芎、姜黃、高良姜、肉桂、丁香、阿魏、降香水蒸氣蒸餾提取6小時(加12倍水)，收集揮發(fā)油與蒸餾液適量(約50ml)，藥渣及其余二十五味加水煎煮三次，第一次2小時(加水12倍)，第二、三次各1.5小時(分別加水10倍、8倍)，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.15(50～60℃)的清膏，加乙醇使含醇量達(dá)70％，調(diào)節(jié)pH值為7.5～8.0，靜置(0～5℃)24小時，濾過，濾液回收乙醇，加水至相對密度為1.06(50～60℃)的清膏，再加入鱉甲煎液，煮沸20分鐘，放冷，加揮發(fā)油與蒸餾液及聚山梨酯80、甜蜜素，加水?dāng)嚢枋谷芙?，靜置(0～5℃)24～48小時，濾過，濾液加水至規(guī)定量(1000ml)，灌封，滅菌(105℃，60min)，即得。每支10ml。

實施例2：

制備方法：以上三十四味，鱉甲加水煎煮3次，每次3小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至適量；當(dāng)歸、川芎、姜黃、高良姜、肉桂、丁香、阿魏、降香水蒸氣蒸餾提取6小時，收集揮發(fā)油與蒸餾液適量，藥渣及其余二十五味加水煎煮三次，第一次2小時，第二、三次各1.5小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度約1.15(50～60℃)的清膏，加乙醇使含醇量達(dá)70％，調(diào)節(jié)pH值為7.5～8.0，靜置24小時，濾過，濾液回收乙醇，加水至相對密度約1.06(50～60℃)的清膏，再加入鱉甲煎液，煮沸20分鐘，放冷，加揮發(fā)油與蒸餾液，經(jīng)常規(guī)工藝制成片劑。

實施例3：

制備方法：以上三十四味，鱉甲加水煎煮3次，每次3小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至適量；當(dāng)歸、川芎、姜黃、高良姜、肉桂、丁香、阿魏、降香水蒸氣蒸餾提取6小時，收集揮發(fā)油與蒸餾液適量，藥渣及其余二十五味加水煎煮三次，第一次2小時，第二、三次各1.5小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度約1.15(50～60℃)的清膏，加乙醇使含醇量達(dá)70％，調(diào)節(jié)pH值為7.5～8.0，靜置24小時，濾過，濾液回收乙醇，加水至相對密度約1.06(50～60℃)的清膏，再加入鱉甲煎液，煮沸20分鐘，放冷，加揮發(fā)油與蒸餾液，經(jīng)常規(guī)工藝制成顆粒劑。