本申請是國際申請日為2013年03月07日、國際申請?zhí)枮閜ct/us2013/029696、進入國家階段的申請?zhí)枮?01380014970.0、發(fā)明名稱為“短抗微生物脂肽”的pct申請的分案申請。本申請要求2012年3月20日提交的美國臨時申請?zhí)?1/613,212的優(yōu)先權(quán)益，其通過引用整體并入本文。本發(fā)明涉及具有生物活性及治療活性的肽。具體而言，本發(fā)明涉及展現(xiàn)抗微生物活性的kpv或kdpt的脂化二肽或三肽類似物。具體而言，本發(fā)明的肽提供比基礎(chǔ)三肽，賴氨酸-脯氨酸-纈氨酸和賴氨酸-d-脯氨酸-酪氨酸增強的抗微生物活性。本發(fā)明進一步涉及使用這些肽來治療侵襲皮膚及其它相關(guān)體表(例如口腔)的多種損傷、發(fā)炎或細(xì)菌感染的方法。
背景技術(shù)：
：數(shù)十年來研究者一直致力于開發(fā)抗微生物治療和試劑。最近，存在對用于治療數(shù)目漸增的耐藥性細(xì)菌、病毒及真菌感染的新的抗微生物劑的需求。在科學(xué)文獻和已頒布專利二者中已報道多種生物活性肽。肽在歷史上已從天然來源分離，且最近已成為結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系研究的對象。此外，天然肽已充當(dāng)設(shè)計合成肽類似物的起點。有多個專利描述了含有短肽的化妝品組合物。例如，美國專利號6,492,326提出了含有五肽和皮膚護理活性成份的皮膚護理組合物的制備和用途。strom等人2003(journalofmedicinalchemistry46:1567-1570)描述含有化學(xué)修飾的抗細(xì)菌短肽，主要集中于極短肽(二聚體和三聚體)。也描述了某些六肽。然而，并未測試或討論這些六肽的抗微生物活性。α-促黑激素(α-msh)是具有有效抗炎活性的13-氨基酸神經(jīng)肽。其是通過較大前體分子前阿黑皮素(pre-opiomelanocortin)的翻譯后加工來產(chǎn)生。已證實α-msh的羧基末端三肽(由殘基11至13構(gòu)成)kpv在體內(nèi)和體外發(fā)揮抗炎活性(brzoska,t.、luger,ta.等人，α-melanocyte-stimulatinghormoneandrelatedtripeptides:biochemistry,anti-inflammatoryandprotectiveeffectsinvitroandinvivo,andfutureperspectivesforthetreatmentofimmune-mediatedinflammatorydiseases.endocrinereviews2009.29(5):581-602)。已描述了結(jié)構(gòu)相關(guān)衍生物kdpt(kpt)與il-1β的殘基193-195共線且似乎能夠與il-1i型受體相互作用(lugert.a.及brzoskat.α-mshrelatedpeptides:anewclassofanti-inflammatoryandimmunomodulatingdrugs.annrheumdis2007;66(增刊iii):iii52-iii55)。有一篇報道提出，kpv對金黃色葡萄球菌(s.aureus)及白色念珠菌(c.albicans)具有抗微生物影響但并未確定mic(cutulim等人，2000,antimicrobialeffectsofα-mshpeptides,j.leukocytebiology,67:233-239)。與kpv不同，從未報道kdpt三肽具有抗微生物影響。因此，本領(lǐng)域需要開發(fā)具有針對眾多微生物(包含革蘭氏(gram)陰性及革蘭氏陽性細(xì)菌)的寬范圍有效抗微生物活性的肽。抗微生物肽的制造成本對醫(yī)藥及化妝品應(yīng)用而言也是關(guān)鍵考慮因素。我們在本發(fā)明中公開了有成本效益的抗微生物短肽，其可在醫(yī)藥或化妝品組合物中使用，用于局部治療或管控與細(xì)菌及真菌感染相關(guān)的皮膚狀況。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及展現(xiàn)抗微生物活性的kpv或kdpt的脂化二肽或三肽類似物。具體而言，本發(fā)明的肽提供比基礎(chǔ)三肽賴氨酸-脯氨酸-纈氨酸及賴氨酸-d脯氨酸-酪氨酸增強的抗微生物活性。分離肽的目標(biāo)抗細(xì)菌活性是針對那些侵襲皮膚及相關(guān)粘膜表面的細(xì)菌。盡管不欲限于任何具體機制，但本發(fā)明肽能夠通過抑制細(xì)菌生長和抑制與細(xì)菌感染相關(guān)的發(fā)炎來促進皮膚健康。本發(fā)明的一個實施方案是關(guān)于以下通式的脂化二肽或三肽：c12-18脂質(zhì)-kxz-nh2，其中k是賴氨酸；x是脯氨酸、d-脯氨酸(脯氨酸的d-異構(gòu)體)、組氨酸或精氨酸；z是任選的，且如果存在則z是纈氨酸、蘇氨酸、丙氨酸或亮氨酸；且末端cooh經(jīng)nh2酰胺化。該肽是經(jīng)c12-18脂質(zhì)脂化且優(yōu)選是經(jīng)以下酸的脂質(zhì)部分：月桂酸(c12)、肉豆蔻酸(c14)、十五烷酸(c15)、棕櫚酸(c16)或硬脂酸(c18)。十五烷?；白貦磅；亲顑?yōu)選的脂質(zhì)基團。優(yōu)選的脂化二氨基酸及三氨基酸包含c12-18脂質(zhì)-賴氨酸-脯氨酸-纈氨酸-nh2；c12-18脂質(zhì)-賴氨酸-d-脯氨酸-蘇氨酸-nh2；c12-18脂質(zhì)-賴氨酸-脯氨酸-丙氨酸-nh2；c12-18脂質(zhì)-賴氨酸-脯氨酸-亮氨酸-nh2；c12-18脂質(zhì)-賴氨酸-脯氨酸-nh2；c12-18脂質(zhì)-賴氨酸-d-脯氨酸-nh2；c12-18脂質(zhì)-賴氨酸-組氨酸-nh2；及c12-18脂質(zhì)-賴氨酸-精氨酸-nh2。本發(fā)明的另一實施方案是關(guān)于含有醫(yī)藥上或化妝品上可接受的載體和一或多種上述肽的組合物。這些組合物中的肽濃度優(yōu)選介于約0.1μg/ml至約20μg/ml或約0.1μg/ml至約10%(w/v)范圍內(nèi)。適于局部應(yīng)用的優(yōu)選組合物形式是氣溶膠、乳液、液體、水溶液、洗劑、乳霜、糊劑、軟膏、粉劑及泡沫劑。本發(fā)明還涉及使用上述組合物來治療或預(yù)防哺乳動物皮膚的微生物感染的方法。通常，治療方法意味著向皮膚(表皮)及相關(guān)粘膜組織的受侵襲區(qū)域施用有效量的含肽組合物且保持有效時間量。當(dāng)細(xì)菌感染是由選自痤瘡丙酸桿菌(p.acnes)、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌(e.coli)及白色念珠菌的細(xì)菌引起時也可使用這些方法。此外，本發(fā)明的肽及含有這些肽的組合物可提供納入一般皮膚護理及化妝品制劑(例如各種皮膚化妝品、皮膚乳霜、洗劑、防曬劑及治療性洗劑或乳霜(例如抗痤瘡制劑))中的有用特征。具體實施方式為更充分理解本文所描述的本發(fā)明，進行以下詳細(xì)描述。本發(fā)明一般性涉及包括以下通式的kpv或kdpt的抗微生物脂化二肽或三肽類似物的組合物及方法：c12-18脂質(zhì)-kxz-nh2，其中k是賴氨酸；x是脯氨酸、d-脯氨酸、組氨酸或精氨酸；z是任選的，且如果存在則z是纈氨酸、蘇氨酸、丙氨酸或亮氨酸；且末端cooh經(jīng)nh2酰胺化。可用來提供本發(fā)明化合物的c12-18脂質(zhì)組份的飽和或不飽和脂肪酸的實例包含：系統(tǒng)名常用名簡寫名十二烷酸月桂酸12:0十四烷酸肉豆蔻酸14:0十六烷酸棕櫚酸16:0十七烷酸珠光脂(曼陀羅)酸17:0十八烷酸硬脂酸18:09-順-十四碳烯酸肉豆蔻油酸14:1(n?5)9-順-十六碳烯酸棕櫚油酸16:1(n?7)6-順-十六碳烯酸sapienicacid16:1(n?10)全順-7,10,13-十六碳三烯酸16:3(n?3)9-順-十八碳烯酸油酸18:1(n?9)全順-9,12-十八碳二烯酸亞麻油酸18:2(n?6)α-促黑激素(α-msh)是具有有效抗炎活性的13-氨基酸神經(jīng)肽。其是通過較大前體分子前阿黑皮素的翻譯后加工來產(chǎn)生。已證實α-msh的羧基末端三肽(包括殘基11至13)kpv在體內(nèi)和體外發(fā)揮抗炎活性(brzoska,t.、luger,ta.等人，α-melanocyte-stimulatinghormoneandrelatedtripeptides:biochemistry,anti-inflammatoryandprotectiveeffectsinvitroandinvivo,andfutureperspectivesforthetreatmentofimmune-mediatedinflammatorydiseases.endocrinereviews2009.29(5):581-602)。已描述了結(jié)構(gòu)相關(guān)衍生物kdpt(kpt)與il-1β的殘基193-195共線且似乎能夠與il-1i型受體相互作用(lugert.a.及brzoskat.α-mshrelatedpeptides:anewclassofanti-inflammatoryandimmunomodulatingdrugs.annrheumdis2007;66(增刊iii):iii52-iii55)。有一篇報道提出，kpv對金黃色葡萄球菌及白色念珠菌具有抗微生物影響但未確定mic(cutulim等人，2000,antimicrobialeffectsofα-mshpeptides,j.leukocytebiology,67:233-239)。與kpv不同，從未報道kdpt三肽具有抗微生物影響。我們使用clsi(clinicalandlaboratorystandardinstitute)推薦的用于抗微生物劑的標(biāo)準(zhǔn)方案(methodsfordilutionantimicrobialsusceptibilitytestsforbacteriathatgrowaerobically；approvedstandard-第9版)來進行最低抑制濃度(mic)確定。令人驚奇地是，kpv與kdpt在至多達2000μg/ml濃度下都不顯示針對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌或酵母菌的可檢測的mic。該較差抗微生物概況使得兩種三肽遠不符合期望用于需要抗微生物活性的治療或化妝品應(yīng)用。我們經(jīng)由用不同長度的脂質(zhì)對kpv及kdpt的α氨基實施n末端乙酰化來修飾兩種肽。該修飾產(chǎn)生具有針對廣譜微生物的新的、優(yōu)良且出乎意料的抗微生物活性的分子。所得脂三肽顯示令人驚奇地優(yōu)于親本肽的抵抗革蘭氏陰性及革蘭氏陽性細(xì)菌及酵母菌的抗微生物活性。脂質(zhì)長度也影響該活性且我們發(fā)現(xiàn)，具有碳數(shù)目介于12至18范圍內(nèi)的脂質(zhì)最有效。脂化后，mic在mullerhinton培養(yǎng)液中顯著改良，針對痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及白色念珠菌的mic介于1μg/ml至64μg/ml范圍內(nèi)。用a或l替換pal-kpv-nh2中的第三殘基保留抗微生物活性且此發(fā)現(xiàn)促使我們從kpv或kdpt移除第三氨基酸殘基。所得脂二肽pal-kp-nh2、pal-k-dp-nh2都顯示新的抗微生物活性。此外，kp-nh2與kdp-nh2二者在人類皮膚角質(zhì)細(xì)胞中針對組胺誘導(dǎo)的il-6表達顯示中等抗炎活性(數(shù)據(jù)未顯示)。我們進一步用v、a、f、g、s、h、k、i、l、d、r、s、w或y取代第二殘基p或dp。此工作提供了一組具有從未報道過的具有新的抗微生物活性的脂二肽。在醫(yī)藥或化妝品制劑中可將該抗微生物活性轉(zhuǎn)變成治療應(yīng)用?？傊景l(fā)明是基于以下發(fā)現(xiàn)：衍生自kpv的特定脂二肽及脂三肽，其是由脂質(zhì)-kxz組成，其中脂質(zhì)可合意地選自棕櫚?；?、月桂?；?、肉豆蔻?；?、十五烷?；坝仓；?；且x可選自呈l-或d-對映異構(gòu)形式的p、g、i、h及r，z是任選的且如果存在則z是羧基末端酰胺化的v、t、a或l。這些短脂肽是針對包含以下的革蘭氏陽性及革蘭氏陰性細(xì)菌的新的抗微生物劑：大腸桿菌(e.coli)、金黃色葡萄球菌(s.aureus)、痤瘡丙酸桿菌(p.acnes)、皮癬菌(dermatophyte，例如發(fā)癬菌(trichophytonspp.))及酵母菌念珠菌(candidaspp.，包含白色念珠菌、光滑念珠菌(c.glabrata)及熱帶念珠菌(c.tropicalis))?？s寫關(guān)鍵詞：以上所列示的脂質(zhì)是使用標(biāo)準(zhǔn)肽化學(xué)經(jīng)由酰胺鍵與二肽或三肽偶聯(lián)：myr=肉豆蔻酸，pen=十五烷酸，pal=棕櫚酸，ste=硬脂酸，lau=月桂酸。氨基酸的右旋形式縮寫成“d”，例如脯氨酸的右旋形式是d-脯氨酸。此外，氨基酸的縮寫遵循常規(guī)用法：丙氨酸alaa精氨酸argr天冬酰胺asnn天冬氨酸aspd半胱氨酸cysc谷氨酸glue谷氨酰胺glnq甘氨酸glyg組氨酸hish異亮氨酸ilei亮氨酸leul賴氨酸lysk甲硫氨酸metm苯丙氨酸phef脯氨酸prop絲氨酸sers蘇氨酸t(yī)hrt色氨酸t(yī)rpw酪氨酸t(yī)yry纈氨酸valv用于醫(yī)藥配制及施用的技術(shù)的細(xì)節(jié)可參見最新版的remington’spharmaceuticalsciences(mackpublishing公司，eastonpa.)。盡管希望經(jīng)由局部表面遞送，但仍有其它遞送方式，例如：經(jīng)口、胃腸外、氣溶膠、肌內(nèi)、皮下、經(jīng)皮、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或鼻內(nèi)施用。本發(fā)明可配制在多種載體媒介物中，例如噴霧劑；氣溶膠；水包油型乳液；油包水型乳液；面霜或身體乳霜；防曬洗劑或曬后洗劑；或其它局部施用媒介物。此外，本發(fā)明的肽及含有這些肽的組合物可提供有用特征，用于納入一般皮膚護理及化妝品制劑(例如各種皮膚化妝品、皮膚乳霜、洗劑、防曬劑及治療性洗劑或乳霜(例如抗痤瘡制劑))中。如本文所使用，術(shù)語“治療劑”意指用于治療、抵抗、改善、預(yù)防或改良患者的不期望狀況或疾病的制劑。本發(fā)明所治療狀況包括多種通常侵襲諸如人類等哺乳動物的皮膚或粘膜區(qū)域的細(xì)菌感染。當(dāng)由選自痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及白色念珠菌的細(xì)菌或真菌引起細(xì)菌感染時，這些方法也是可用的。根據(jù)所涵蓋的具體應(yīng)用，可將本發(fā)明所提供的醫(yī)藥組合物配制成溶液、懸浮液、胃腸外制劑、軟膏、乳霜、洗劑、噴霧劑、粉劑或片劑膠囊。胃腸外制劑可包含媒介物，例如經(jīng)過特別蒸餾的無熱原水、磷酸鹽緩沖液或生理食鹽水。軟膏、乳霜、洗劑及噴霧劑可包含諸如植物油或礦物油、白石蠟脂或高分子量(即大于c12)醇等載體。片劑或膠囊可包含稀釋劑(例如乳糖)、粘合劑、潤滑劑(例如硬脂酸)及崩解劑(例如玉米淀粉)。含有有效量活性劑的口用噴霧劑也可使用一或多種本發(fā)明脂化肽配制?？蓪⒋瞬牧献鳛榭刮⑸飫?，每天在牙齒及牙齦表面的各四分象限上噴霧0.25ml至0.5ml份量1次至3次。在假牙佩戴者的情形下，可每天帶上假牙之前將噴霧劑直接用于假牙表面。若需要，可提供含有有效量抗微生物劑的漱口水制劑。本發(fā)明組合物也可包含醫(yī)藥上或皮膚病學(xué)上可接受的載體。載體的實例包含乳液及凝膠。乳液通常是油相與水相的混合物。組合物也可包括磨砂膏(exfoliantabrasive)材料。組合物也可包括穩(wěn)定劑。組合物也可包括控泡化合物。組合物也可包含一或多種其它皮膚護理活性組份。皮膚護理活性組份的實例包含脫屑活性物質(zhì)、抗痤瘡活性物質(zhì)、維生素b3化合物、類視色素(包含視黃醇、視黃醛、視黃醇酯、視黃醇丙酸酯、視黃酸及視黃醇棕櫚酸酯)、羥酸、自由基捕獲劑、螯合劑、抗炎劑、局部麻醉劑、防曬活性物質(zhì)(tanningactive)、亮膚劑、溶脂劑、類黃酮、抗微生物活性物質(zhì)、皮膚愈合劑、抗真菌活性物質(zhì)、菌綠烯醇(farnesol)、植烷三醇、尿囊素、水楊酸、煙酰胺、右泛醇、生育酚乙酸酯及葡糖胺。組合物也可包含防曬劑化合物。防曬劑化合物的實例包含無機防曬劑化合物及有機防曬劑化合物。無機防曬劑化合物可包含金屬氧化物，例如氧化鋅、氧化鈦及氧化鐵。有機防曬劑化合物可包含甲氧基肉桂酸辛基酯、水楊酸辛基酯、對苯二亞甲基二樟腦磺酸、阿伏苯宗(avobenzone)及奧克立林(octocrylene)。材料及方法1.肽合成.所有所揭示的肽都是使用標(biāo)準(zhǔn)fmoc(9-茀基甲氧基羰基)固相化學(xué)來合成。這些肽是使用標(biāo)準(zhǔn)氨基酸制備為酰胺化或游離酸序列。2.細(xì)菌菌株及培養(yǎng)條件.此研究中所包含的細(xì)菌菌株列示于表1中。除非另外指明，否則使大腸桿菌ub1005、金黃色葡萄球菌sap0017(mrsa)及白色念珠菌105在37℃下于muellerhinton(mh)(difco,bdbiosciences,md)瓊脂板及培養(yǎng)液(每公升含2g牛肉膏、17.5g酸水解酪蛋白及1.5g淀粉)中生長。在敏感性測試之前將來自冷凍原液的細(xì)菌于剛制成的mh瓊脂板上繼代培養(yǎng)。對于痤瘡丙酸桿菌，使細(xì)菌在37℃下在使用厭氧罐及anaerogentm(oxoid,basingstoke,hampshire,england)產(chǎn)生的厭氧條件中于bbltm腦心浸液(becton,dickinson&company，sparksmd)培養(yǎng)液或瓊脂板中生長。3.抗微生物活性的測定.使用經(jīng)改良clsi微量滴定培養(yǎng)液稀釋分析(methodsfordilutionantimicrobialsusceptibilitytestsforbacteriathatgrowaerobically；approvedstandard–第9版)來測定每一肽的最低抑制濃度(mic)。使用105-106個菌落形成單位(cfu)/ml或104cfu/ml(對于酵母菌)的接種物。以在37℃下孵育15h至20h后大于90%的微生物生長被抑制的最低肽濃度作為mic值。對于痤瘡丙酸桿菌，在測定mic之前，將其在37℃下在厭氧條件下孵育2周。使用給定濃度(約2-5倍mic)的混合有指示劑微生物的肽實施殺菌動力學(xué)。適當(dāng)稀釋后，在規(guī)定時間間隔后將細(xì)胞平鋪于瓊脂板上且在37℃下孵育過夜。在痤瘡丙酸桿菌的情形下，需要延長孵育時間段。計數(shù)cfu且繪制成經(jīng)肽治療后細(xì)菌隨時間的存活率，此指示肽殺死微生物的有效性。4.皮膚組織毒性測定.皮膚毒性及相容性是使用epiderm(epi-200)皮膚組織及mtt試劑盒(mtt-100)(mattek,ashland,ma)根據(jù)制造商說明書來測定。分別使用1%tritonx-100及pbs作為陽性(有毒)及陰性(無毒)對照。5.基因概況分析.使用由sunnybiodiscovery公司(santapaula,ca)實施的pcr陣列分析人類真皮成纖維細(xì)胞中的84個編碼細(xì)胞外基質(zhì)粘附分子的基因。人類真皮成纖維細(xì)胞是來自zen-bio,researchtrianglepark,nc(目錄編號為df-f，批號為dfmf112410)。使細(xì)胞(低傳代)在dmem/10%fcsw/o酚紅中生長直至其達到鋪滿期，此后將其以一式兩份與3μg/ml、5μg/ml或10μg/ml測試材料或水一起孵育24h。孵育結(jié)束時，在nikonts倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞。未發(fā)現(xiàn)實驗條件有細(xì)胞毒性。定性評價顯示，在5μg/ml測試材料下經(jīng)受有絲分裂的細(xì)胞多于在10μg/ml測試材料下，且因此選擇5μg/ml條件用于rna提取。在孵育時間段結(jié)束時，將細(xì)胞保存在rnalater溶液(ambion,austin,tx)中并保持6h。用來自machery-nagel,bethleem,pa的nucleospinrnaii試劑盒提取且純化rna。用agilenthp-8452a二極管陣列分光光度計在230nm、260nm及280nm下評價所純化總rna。均衡各樣品的rna濃度且使用來自qiagen(前sabiosciences)的使用pcr陣列pahs-013a(www.sabiosciences.com/rt_pcr_product/html/pahs-013a.html)與第一鏈合成(1ststrandsynthesis)試劑盒、sybrgreen主混合物及pcr運行條件的bioradicycleriq檢測系統(tǒng)通過實時定量pcr來測量所關(guān)注基因的表達。在用rt2剖析儀pcr陣列數(shù)據(jù)分析3.5版軟體將基因表達正規(guī)化至所攜載的5個管家基因后，使用效率δδct方法來量化結(jié)果。結(jié)果及討論kpv三肽與kdpt三肽二者在體外和體內(nèi)的抗炎活性是已知的。也已報道在磷酸鹽緩沖液中kpv三肽具有針對金黃色葡萄球菌及白色念珠菌的抗微生物活性(cutulism.等人，antimicrobialeffectsofα-mshpeptides.j.leukocytebio.200067:233-239)。然而，從未測定或報道過kpv的mic值。也未知kdpt是否具有抗微生物影響。我們使用clsi推薦的微量培養(yǎng)液稀釋分析(用于在活體外測定抗生素及抗真菌劑的mic的標(biāo)準(zhǔn)分析)在培養(yǎng)基中測試kpv及k-dpt的抗微生物活性(methodsfordilutionantimicrobialsusceptibilitytestsforbacteriathatgrowaerobically；approvedstandard-第9版)。令人驚奇地是，在mh培養(yǎng)液中，具有或不具有c末端酰胺化的kpv(hb2067、hb2068)與kdpt(hb2089、hb2090)二者在至多達2000μg/ml的濃度下都不顯示可檢測的mic(表1)。這與rauch及合作者所描述的發(fā)現(xiàn)一致，即使用針對白色念珠菌菌株sc5314(用于抗真菌敏感性實驗的標(biāo)準(zhǔn)實驗室菌株)的生長分析顯示，kpv在至多達100μm下不能抑制酵母菌生長(rauchi.、holzmeisters.及koflerb.anti-candidaactivityofalpha-melanocyte-stimulatinghormone(alpha-msk)peptides.j.leukoc.biol.2009.85(3):371-372)。用不同長度的脂質(zhì)修飾kpv及kdpt，這旨在尋找抗微生物概況優(yōu)于親本三肽或相對于其經(jīng)改良的類似物。三肽核心的乙?；沂玖钊梭@奇的結(jié)果。脂質(zhì)長度似乎至關(guān)重要且表2顯示使用kpv的結(jié)果作為實例。碳數(shù)目介于11至18范圍內(nèi)的脂質(zhì)似乎對kpv及kdpt兩者的抗微生物活性具有正面影響(表1、表2)。對于kpv及kdpt，最佳脂質(zhì)長度確定為15及16個碳(表1、表2)。這些脂質(zhì)顯著增強兩種肽針對廣譜微生物(包含革蘭氏陽性、革蘭氏陰性細(xì)菌及酵母菌)的抗微生物活性，如seqidno5(hb2178)、7或24(hb2180或hb2200)、17(hb2192)、23(hb2199)所證實(表1、表2)。實際上，與在至多達2000ug/ml下無活性的單獨親本三肽kpv-nh2或kdpt-nh2相比，脂肽針對痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及白色念珠菌的mic顯示接近2000倍的改良，其介于1-64μg/ml范圍內(nèi)(表1)。將脂質(zhì)長度增加至18-碳消除了革蘭氏陰性選擇性活性，但保留了革蘭氏陽性及酵母菌選擇性活性二者(表1、表2)。進一步用a或l取代pal-kpv-nh2中的第三氨基酸以獲得seqidno30(hb2208)及31(hb2209)。令人感興趣的是，seqidno30與31二者都維持適宜廣譜抗微生物活性，從而表明，所觀察到的新的抗微生物活性可能需要或可能不需要pal-kpv-nh2中的第三殘基v。除了其如通過mic指示的廣譜活性外，包含seqidno5(hb2178)、7(2180)、30(hb2208)及31(hb2209)在內(nèi)的類似物在殺菌分析中都具有殺菌性且在20min內(nèi)消滅5-6log的金黃色葡萄球菌(表3)?？傊紨?shù)目介于12至18范圍內(nèi)的脂質(zhì)附接至kpv-nh2或kdpt-nh2可產(chǎn)生具有先前從未報道過的新的廣譜抗微生物活性的脂三肽。pal-kpv-nh2或pal-kdpt-nh2中的第三殘基對于所觀察到的新的抗微生物活性而言可能關(guān)鍵或可能不關(guān)鍵。由于諸如hb2184及hb2182等未酰胺化對應(yīng)部分的活性較低或無活性，因此c末端酰胺化對于所描述的抗微生物活性極為關(guān)鍵。用a及l(fā)取代pal-kpv-nh2中的第三殘基未消除活性促使我們進行進一步修飾。因此，我們移除pal-kpv-nh2及pal-kdpt-nh2二者的第三氨基酸殘基以獲得脂二肽seqidno26(hb2202)及seqidno27(hb2203)。兩種衍生物均顯示與親本脂三肽pal-kpv-nh2及pal-kdpt-nh2相似的新的抗微生物活性(表1)。該活性出人意料且從未被公開。殺菌動力學(xué)表明，兩種脂二肽衍生物在pbs中具有同等殺菌性且在20min的直接接觸內(nèi)消滅超過5log的包含痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及酵母菌白色念珠菌在內(nèi)的微生物(表3)。本發(fā)明所描述脂二肽的抗微生物活性也表現(xiàn)為兩種脂二肽在10%胎牛血清存在下都維持針對金黃色葡萄球菌的顯著殺菌活性(表3)。此尤其顯著。肽抗生素通常因干擾且結(jié)合宿主蛋白從而導(dǎo)致抗微生物活性降低而引起問題。慮及皮膚切口或病變(包含痤瘡病變)通常伴隨受傷區(qū)域的血清浸潤，在血清中的抗微生物活性對于潛在治療而言非常重要。為證實pal-kp-nh2含有最佳活性設(shè)計，交換p與k的位置，以產(chǎn)生hb2251(pal-pk-nh2)及hb2255(pal-pk-oh)。與pal-kp-nh2相比，pal-pk-nh2顯示活性降低超過8倍。未酰胺化衍生物pal-pk-oh及pal-kp-oh無活性，再次表示c末端酰胺化對于抗微生物活性至關(guān)重要。使用epidermtm皮膚模型(mattek,ashland,ma)與改良mtt分析法的組合來測試脂二肽產(chǎn)生皮膚刺激性的可能性。epidermtm皮膚模型展現(xiàn)均勻且高度可再現(xiàn)的類似活體內(nèi)形態(tài)及生長特征。epidermtm是由類似那些活體內(nèi)所發(fā)現(xiàn)的組織性基底層、棘層、顆粒層及角質(zhì)化層組成。將這些組織用期望濃度的每一化合物處理20hr。如表1中所見，由hb2202、hb2203、hb2180、hb2208及hb2209代表的所選脂肽在至多達2000μg/ml下都未對組織活力展現(xiàn)負(fù)面效應(yīng)。受新的脂二肽hb2202及hb2203的鼓勵，再用v、a、f、g、l、s、h、k、i、s、r、t、y或w替代pal-kp-nh2及pal-k-dp-nh2的第二殘基來進一步修飾。如表1中所顯示，該修飾法使得進一步發(fā)現(xiàn)一組新的脂二肽，其展現(xiàn)廣譜抗微生物活性(pal-kh-nh2、pal-kr-nh2、pal-kr-oh)或更強的革蘭氏陽性選擇性活性(pal-kg-nh2、pal-kl-nh2及pal-ki-nh2)(表1)。選擇三種代表性化合物seqidno.26(hb2202)、seqidno.41(hb2242)及seqidno.55(hb2259)對人類真皮成纖維細(xì)胞進行基因概況研究。如表4中所顯示，該三種化合物在對人類真皮成纖維細(xì)胞的影響方面顯示相似傾向/模式。受影響的基因是那些參與傷口愈合及抗纖維化級聯(lián)作用者。該三種化合物對整合素的影響顯示在：hb2202及hb2242上調(diào)itga2(整合素α2)表達，而hb2259誘導(dǎo)itga6(整合素α6)(表4)。整合素與膠原蛋白結(jié)合，且在細(xì)胞與基質(zhì)的相互作用中扮演重要角色。這些蛋白質(zhì)在完整皮膚中是由基底角質(zhì)細(xì)胞大量表達，且為人類皮膚傷口的上皮再生所必需。這些化合物也調(diào)節(jié)adamts(具有1型凝血酶敏感蛋白的adam金屬肽酶)及thbs3(凝血酶敏感蛋白)的表達(表4)，該兩種蛋白都參與傷口愈合。在動物模型研究中，在thbs基因剔除小鼠中，下調(diào)凝血酶敏感蛋白時，與對照小鼠相比，顯示會在缺血后具有增強的動脈生成、血管生成及血流恢復(fù)(kyriakidestr及maclauchlans.theroleofthrombospondinsinwoundhealing,ischemia,andtheforeignbodyreaction.jcellcommunsignal2009.3:215-225)。表4中也顯示，所有三種化合物都顯著下調(diào)ctgf(結(jié)締組織生長因子)以及ctnnd1(連環(huán)蛋白)的表達。ctgf與ctnnd1兩者都與纖維增生活性相關(guān)，且已發(fā)現(xiàn)在諸如瘢痕瘤及肥厚性瘢痕(hts)等病癥中的表達水平升高(poonr等人，catenindrivenneoplasticandreactivefibroproliferativedisorders.plosone.2012;7:e37940)。hts代表傷口愈合的基本過程中的畸變，從而使成纖維細(xì)胞產(chǎn)生過量膠原蛋白。燒傷、創(chuàng)傷性損傷及手術(shù)程序通常引起hts。在用抗微生物劑消除諸如細(xì)菌及真菌等感染物后，傷口感染也使皮膚留下hts。脂二肽也影響kal1(表4)。這因為已發(fā)現(xiàn)由kal1基因編碼的蛋白質(zhì)在異位性皮炎中參與調(diào)節(jié)表皮神經(jīng)密度而尤其令人感興趣。kal1過表達抑制軸突過度生長，從而可能抑制異位性皮炎中的神經(jīng)支配過強及異常搔癢感(tengaras等人，keratinocyte-derivedanosmin-1,anextracellularglycoproteinencodedbythex-linkedkallmannsyndromegene,isinvolvedinmodulationofepidermalnervedensityinatopicdermatitis.jdermatolsci2010.58:64-71)。總之，除所論述的廣譜抗微生物活性外，短脂肽還可活化人類真皮細(xì)胞以促進傷口愈合及抗纖維化活性。因此，這些脂肽有益于抗微生物治療后的傷口恢復(fù)。表1.kpv類似物的抗微生物活性及皮膚組織毒性表2.脂質(zhì)長度對kpv-nh2的抗微生物活性的影響表3.所選kpv類似物的殺菌動力學(xué)表4.對人類真皮成纖維細(xì)胞的基因概況研究本發(fā)明包含下列實例以展示本發(fā)明的某些優(yōu)選實施例。傷口感染是因多重抗藥性病原體(如mrsa)的頻率增加而加重的顯著問題。本發(fā)明可在治療上或化妝品上應(yīng)用于治療、改善且預(yù)防細(xì)菌相關(guān)皮膚狀況(包含痤瘡、異位性皮炎、酒渣鼻)或真菌相關(guān)皮膚狀況(包含頭皮屑及足癬)。金黃色葡萄球菌是醫(yī)院獲得性感染的主要原因，最常與血流、皮膚及軟組織、呼吸機輔助肺炎及導(dǎo)管相關(guān)。由耐甲氧西林(methicillin)金黃色葡萄球菌(mrsa)引起的感染頻率增加尤其引人關(guān)注，尤其在美國在加護病房中患病率大于55%，且該發(fā)病率導(dǎo)致較長住院時間、較高成本及較高死亡風(fēng)險?；蛐团cha-mrsa不同的社區(qū)獲得性mrsa(ca-mrsa)在無傳統(tǒng)風(fēng)險因子的患者中現(xiàn)也已成為確立的威脅。除金黃色葡萄球菌外，革蘭氏陽性細(xì)菌化膿性鏈球菌是復(fù)雜的皮膚及皮膚結(jié)構(gòu)感染(ssti)的主要原因。本發(fā)明提供針對mrsa相關(guān)感染的潛在預(yù)防及治療。尋常痤瘡是常見人類皮膚疾病，其特征在于皮膚區(qū)域具有皮脂溢出、粉刺、丘疹、膿皰、結(jié)節(jié)及可能的瘢痕。受痤瘡侵襲的區(qū)域包含面部、胸上部及背部。重度痤瘡具有發(fā)炎性，但痤瘡也可以非發(fā)炎形式表現(xiàn)。細(xì)菌痤瘡丙酸桿菌可引起發(fā)炎，從而在微小粉刺或粉刺周圍的真皮中導(dǎo)致發(fā)炎性病變，這導(dǎo)致發(fā)紅且可導(dǎo)致結(jié)?；蛏剡^多。抗微生物短脂肽可用于呈下列形式(但不限于下列形式)的痘疤控制：筆、泡沫劑、擦拭巾(wipe)、乳霜、洗劑、噴霧劑、調(diào)色劑及/或清潔劑。另一潛在用途可是使用當(dāng)前技術(shù)與(但不限于)水楊酸或類視色素的組合。毛囊炎是用于描述皮膚任一處的一或多個毛囊的任何發(fā)炎的詞語，其包含在非裔美國男性中尤其普遍的胡須假性毛囊炎(例如剃刀突塊)及頭皮毛囊炎。毛囊炎是毛囊的感染。輕微情形往往導(dǎo)致搔癢而重度情形則可導(dǎo)致深度結(jié)瘢。其是因細(xì)菌經(jīng)由毛囊的小開口進入皮膚所致。在毛囊炎的大多數(shù)情形下，受損毛囊隨后經(jīng)葡萄球菌屬(staphylococcus)細(xì)菌感染。須癢是面部胡須區(qū)域、通常上唇處毛囊的葡萄球菌感染。須癬與須癢相似，但感染是由真菌引起。有多個建議可幫助預(yù)防此皮膚狀況，例如使用抗細(xì)菌肥皂及頭皮毛囊炎洗發(fā)精。也已使用氫化可體松(hydrocortisone)、抗生素或維a酸(retinoin)乳霜來治療剃刀突塊引起的刺激及丘疹。本發(fā)明所描述的廣譜抗微生物脂肽應(yīng)適用于由以下引起的病癥：毛囊損傷、毛囊阻塞、剃須或衣服、頭盔帶及諸如此類在頸部、腹股溝或生殖器區(qū)域引起的摩擦。頭皮屑是常見慢性頭皮狀況，其特征在于頭皮搔癢及皮膚脫屑。馬拉色菌屬(malassezia)是熟知酵母菌，其引起常見人類皮膚疾病，包含頭皮屑、變色糠疹、脂溢性皮炎、牛皮癬及異位性皮炎。發(fā)癬也稱為毛發(fā)錢癬或頭皮錢癬，其是頭皮的表面真菌感染。該疾病主要是因發(fā)癬菌屬及小芽孢菌屬(microsporum)中的皮癬菌侵入毛干所致。發(fā)癬菌屬感染的病例主要存在于中美洲至美國及西歐的一部分。該疾病具有感染性且可通過人類、動物或具有真菌的對象傳播。也存在攜帶者狀態(tài)，其中真菌存在于頭皮上但未出現(xiàn)臨床體征或癥狀。足癬也稱為足部錢癬或足癬，其也是引起受影響區(qū)域起鱗皮、脫屑及搔癢的足部皮膚的真菌感染。其是由發(fā)癬菌引起。在一些情形下，真菌感染可伴隨有繼發(fā)性細(xì)菌感染。諸如特比萘芬(terbinafine)、伊曲康唑(itraconazole)及氟康唑(fluconazole)等抗真菌藥已開始獲得用于治療的許可。本文所公開的具有針對細(xì)菌及真菌的廣譜活性的脂二肽可具有作為局部治療用于預(yù)防所描述狀況且使其消退的潛能。異位性皮炎(ad)是發(fā)炎性、慢性復(fù)發(fā)性、非接觸傳染性和搔癢性皮膚病癥，其侵襲15%-30%兒童及2%-10%成人。異位性皮炎有時稱為濕疹或異位性濕疹，在嬰兒及兒童中最常見。其特征在于搔癢癥、濕疹性病變、干燥癥(皮膚干燥)及苔蘚樣硬化(皮膚增厚及皮膚條紋增加)。在ad皮膚上發(fā)現(xiàn)的最常見細(xì)菌是金黃色葡萄球菌。實際上，大于90%的ad患者在病變及非病變皮膚上定殖有金黃色葡萄球菌，而5%的ad患者在健康皮膚上定殖有金黃色葡萄球菌。ad皮膚顯示表皮障壁功能缺陷以及如通過抗微生物肽的表達降低所表明的表皮先天性免疫系統(tǒng)缺陷。本文所描述具有抗微生物活性及抗炎活性的脂肽應(yīng)是ad護理的替代選擇?？诔粢卜Q為呼吸臭，其是用來描述呼吸中發(fā)散非常令人討厭的氣味的術(shù)語?？诔艄烙嬍窃谥兰把乐懿『髮で笱揽茙椭牡谌畛Ｒ娫?。呼吸臭及齒齦病是由革蘭氏陰性細(xì)菌(例如牙齦卟啉單胞菌(porphyromonasgingivalis)、伴放線放線桿菌(actinobacillusactinomycetemcomitans)、擬桿菌(bacteroidesspp.))引起。這些細(xì)菌也引起口腔上皮內(nèi)襯的重度發(fā)炎。具有抗炎活性的抗革蘭氏陰性選擇性肽將適用于維持健康口腔護理。三氯沙(triclosan)是具有抗細(xì)菌、抗真菌及抗病毒特性的氯化芳香族化合物。其用于多種常見家居用品中，包含肥皂、漱口水、洗碗精、牙膏、除臭劑及手部消毒液。報告已提出，三氯沙可與自來水中的氯組合形成氯仿，美國環(huán)境保護局(unitedstatesenvironmentalprotectionagency)將氯仿歸類為可能的人類致癌物，意指其可能引起癌癥。本文所揭示的抗微生物脂二肽因具有適當(dāng)抗細(xì)菌及抗真菌特性且無致癌風(fēng)險而有很大潛能會替代三氯沙。類似地，體味也受棒狀桿菌屬(corynebacterium)的成員作用的影響?？蓪⑺枋黾夹g(shù)的抗微生物特性納入化妝品粉劑、凝膠、半固體、乳霜或如腋下或足部除臭劑的其它形式。細(xì)菌性陰道炎(bv)是稱為陰道炎的陰道感染的最一般原因。通常，并不將其視為“性傳播感染”。細(xì)菌性陰道炎正侵襲20%至70%的女性。除了搔癢及灼熱感外，強烈的氣味及異常陰道分泌物是該疾病最常見的癥狀。陰道念珠菌病是涉及稱為念珠菌的酵母菌或真菌的過度生長的陰道感染。此酵母菌通常如眾多其它生物體一樣存在于口、腸及陰道中。若微生物平衡遭到破壞(如在使用廣譜抗生素時、激素波動時及其它情況下可能發(fā)生)，則可發(fā)生酵母菌過度生長。陰道念珠菌病通常稱為“酵母菌感染”，其是在接近75%的成年女性的一生中侵襲其的常見問題。也與陰道發(fā)炎相關(guān)的是非白色念珠菌，例如光滑念珠菌及熱帶念珠菌；皰疹及b族鏈球菌。這些狀況各異且可因乳酸桿菌(lactobacillusspp.)的損失而惡化，乳酸桿菌是用作針對條件病原體的保護性障壁的天然共生體。因此，使用本文所公開的抗微生物肽來控制存于(但不限于)潤滑劑中的指示微生物(例如)可提供如女性保潔產(chǎn)品的有效護理?；瘖y品制造商將化學(xué)防腐劑添加至化妝品及洗劑以殺死細(xì)菌且延長這些產(chǎn)品的儲藏壽命。然而，一些防腐劑引起皮疹及其它過敏反應(yīng)，且研究已將一些這些試劑與癌癥及其它健康問題相關(guān)聯(lián)。在大于70%的化妝品、皮膚洗劑及除臭劑中發(fā)現(xiàn)諸如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丁酯及對羥基苯甲酸乙酯等合成對羥基苯甲酸酯防腐劑。對羥基苯甲酸酯防腐劑模仿雌激素的效應(yīng)。即使少量這些有效化學(xué)品也可使身體的天然激素系統(tǒng)失衡。已將人工觸發(fā)的雌激素失衡與女性乳癌及年輕男孩的睪固酮缺陷相關(guān)聯(lián)?；瘖y品工業(yè)也使用甲醛作為防腐劑。即使添加至化妝品的量較小，其在那些對化學(xué)品敏感者中也可引起過敏反應(yīng)。因此，所描述廣譜抗微生物脂二肽的一種有成本效益的潛在應(yīng)用是可替代有害化學(xué)品作為化妝品工業(yè)的防腐劑。在以上治療方法中用于遞送肽的組合物可是氣溶膠、乳液、液體、洗劑、乳霜、糊劑、軟膏、粉劑或泡沫劑或其它醫(yī)藥上可接受的制劑。此外，這些肽可使用較少涉及的制劑(例如去離子水/蒸餾水、pbs或標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)用鹽水溶液)來遞送。通常，醫(yī)藥上可接受的制劑將包含任何適用于人類皮膚上的載體。這些醫(yī)藥上可接受的載體包含乙醇、二甲基亞砜、甘油、二氧化硅、氧化鋁、淀粉及等效載體及稀釋劑。制劑可視情況具有化妝品吸引力及/或含有諸如類視色素或其它肽等可用作本發(fā)明肽的治療作用的佐劑的其它試劑。也可將抗生素添加至制劑以避免感染，由此允許發(fā)生最大愈合過程。組合物中肽的濃度可是約0.1μg/ml至約50μg/ml或約0.1μg/ml至約10%(w/v)；然而，所采用的最終濃度可在這些范圍外變化，這取決于傷口/組織狀況的性質(zhì)、本發(fā)明肽的生物活性及為獲得增強的組合物吸收而使用的任何佐劑或技術(shù)。本發(fā)明組合物可含有一或多種發(fā)揮皮膚護理活性的其它試劑。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，在組合物要與人類角質(zhì)組織接觸的情況下，則除本發(fā)明肽的外的任何其它組份應(yīng)適于施加至角質(zhì)組織；即，這些其它組份在摻入組合物中時顯示在合理醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)的過度毒性、不相容性、不穩(wěn)定性、過敏反應(yīng)及諸如此類。ctfacosmeticingredienthandbook，第二版(1992)描述皮膚護理工業(yè)中常用的眾多種非限制性化妝品及醫(yī)藥成份，其適用于本發(fā)明組合物中。這些成份類別的實例包含：磨料、吸收劑、美觀組份(例如芳香劑)、顏料、著色劑/色素、精油、皮膚感受劑(skinsensate)、收斂劑等(例如丁香油、薄荷腦、樟腦、案樹油、丁香酚、乳酸薄荷酯、金縷梅餾出物)、抗痤瘡劑、抗結(jié)塊劑、消泡劑、抗微生物劑(例如碘丙基胺基甲酸丁酯)、抗氧化劑、粘合劑、生物添加劑、緩沖劑、膨脹劑、螯合劑（chelatingagents）、化學(xué)添加劑、化妝品殺生物劑、變性劑、藥物收斂劑、外用鎮(zhèn)痛藥、成膜劑或材料、遮光劑、ph調(diào)節(jié)劑、拋射劑、還原劑、多價螯合劑（sequestrants）、美白及亮膚劑(例如對苯二酚、曲酸、抗壞血酸、抗壞血酸基磷酸鎂、抗壞血酸基葡糖胺)、皮膚調(diào)節(jié)劑(例如潤濕劑)、柔膚劑及/或皮膚愈合劑(例如泛醇及其衍生物、庫拉索蘆薈(aloevera)、泛酸及其衍生物、尿囊素、甜沒藥醇(bisabolol)及甘草酸二鉀)、皮膚治療劑、增稠劑以及維生素及其衍生物?？蓪⒈景l(fā)明肽及相關(guān)組合物施用人類和動物(包含所有哺乳動物)。也可與典型和/或?qū)嶒灢牧?例如組織移植物、組織培養(yǎng)產(chǎn)品、氧及敷料)組合施用。常用敷料的列表通常，組合物可經(jīng)局部、經(jīng)口、經(jīng)皮、全身性或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知可用于將本發(fā)明肽遞送至損傷部位的任何其它方法施用。組合物也可以體外或離體方式施加至(例如)在培養(yǎng)物中生長的細(xì)胞或患者移植物。由于這些肽尺寸較小，因此預(yù)期其自身即能夠獲得一定程度的穿過皮膚的滲透率；然而，可使用某些技術(shù)來促進此移動。例如，可將親脂性(非極性)基團添加至肽或可將肽于親脂性賦形劑中遞送至皮膚，以增強肽至角質(zhì)層的可及性，從而允許移位至下表皮層。以此方式，可將這些親脂性修飾視為前藥?？稍谫x形劑中使用滲透促進劑諸如已知溶劑及表面活性劑以允許更好地吸收肽。預(yù)期可用于促進肽到達靶組織/損傷的專門技術(shù)包含離子電滲、電泳及超聲波。離子電滲裝置是由兩個浸泡于電解質(zhì)溶液中且置于皮膚上的電極組成。當(dāng)跨過電極施加電流時，產(chǎn)生跨過角質(zhì)層驅(qū)動肽遞送的電場。電穿孔涉及施加高電壓電脈沖以增加穿過脂雙層的滲透。這在施加電流的持續(xù)時間及強度方面與離子電滲不同(離子電滲使用相對恒定的低電壓電場)。人們相信，電穿孔的高電壓電脈沖引起脂薄層膜中的親水孔的可逆形成，其可顯著增強滲透。超聲波將頻率大于16khz的聲波施加至皮膚，這導(dǎo)致聲波所穿過的組織壓縮及膨脹。所得壓力變化產(chǎn)生眾多可增強肽滲透的過程(例如空泡化、混合、溫度升高)。以上所有肽制劑及應(yīng)用都為本領(lǐng)域所熟知。制備及使用本發(fā)明肽的其它模式描述于(例如)美國專利第6,492,326號及第6,974,799號中，該兩個專利的全文都以引用方式并入本文中。根據(jù)本公開內(nèi)容無需過多實驗即可制得且實施本文所公開且主張的所有組合物或方法。盡管已根據(jù)優(yōu)選實施方案描述本發(fā)明的組合物及方法，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，可在不背離本發(fā)明的概念、精神及范疇下改變這些組合物及/或方法及本文所描述方法的步驟或步驟的順序。更具體而言，應(yīng)明了，可用某些在化學(xué)和生理上都相關(guān)的試劑取代本文所描述的試劑，同時可達成相同或相似結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員可明了的所有這些相似取代及修改都視為在本發(fā)明范疇內(nèi)。當(dāng)前第1頁12