本發(fā)明涉及一種活性組合物在治療偏頭痛藥物中的應用，屬于醫(yī)藥技術領域，即一種治療偏頭痛藥物組合物。
背景技術：
偏頭痛（migraine）是最常見的原發(fā)性頭痛類型的慢性神經(jīng)血管性疾病。偏頭痛是以頭痛劇烈，或左或右，反復發(fā)作，搏動樣疼痛，一般持續(xù)4～72h為特征的一種臨床常見病、多發(fā)病。可伴有惡心、嘔吐等癥，典型的偏頭痛患者有前驅癥狀，并有誘發(fā)因素，如情緒波動、睡眠不足、飲酒等。光、聲或活動可加重頭痛，安靜環(huán)境中休息則可緩解頭痛。流行病學調查分析，西方國家偏頭痛發(fā)病率較高。在美國，偏頭痛年患病率為11%，18% 的婦女和6%的男性一年至少有一次偏頭痛發(fā)作。偏頭痛的患病率與年齡、性別、種族、收入等因素有關。
我國偏頭痛流行病學調查，按隨機或選點抽樣3837597人。共查出患者37808例，患病率為9852/10萬，發(fā)病率為797/10萬。內陸高原為我國高患病地帶，中南沿海省市患病率低。男女之比為1：4。25～29歲患病率最高（1927.4/10萬），10歲以下最低（42.6/10萬）。北方內陸地區(qū)于夏季頭痛發(fā)作頻率最高，而南方地區(qū)以春季最高。
偏頭痛的發(fā)病機制尚不十分清楚，傳統(tǒng)血管學說認為，偏頭痛是原發(fā)性血管疾病。顱內血管收縮引起偏頭痛先兆癥狀，隨后顱外、顱內血管擴張，血管周圍組織產生血管活性多肽導致無菌性炎癥導致搏動性的頭痛。神經(jīng)學說認為，偏頭痛發(fā)作時神經(jīng)功能的變化是首要的，血流量的變化是繼發(fā)的。5-羥色胺（5-HT）參與頭痛發(fā)生，頭痛發(fā)作時，5-HT 從血小板中釋出，直接作用于顱內小血管使之收縮，并附于血管壁上。當血漿5-HT 濃度下降時，作用于大動脈張力性收縮性作用消失，血管壁擴張出現(xiàn)頭痛。5-HT 既是一種神經(jīng)遞質，又是一種體液介質，對神經(jīng)和血管均有影響。三叉神經(jīng)血管學說認為，三叉神經(jīng)節(jié)損害可能是偏頭痛產生的神經(jīng)基礎。
輕、中度偏頭痛一般采用對乙酰氨基酚、萘普生、布洛芬等藥物，但存在副作用大療效不佳等缺點；中、重度偏頭痛一般選用中樞性5-HT受體拮抗劑，如特異性藥物麥角胺類、曲普坦類等藥物，或采用止痛藥如阿片類藥物。特異性藥物雖然效果好，但對心血管有不良影響。阿片類止痛藥雖然具有很好的鎮(zhèn)痛效果，但長期應用可至成癮依賴性。
本發(fā)明的一種活性組合物在治療偏頭痛藥物中的應用，該活性組合物能預防和治療神經(jīng)血管性偏頭痛。通過檢索，本發(fā)明的活性組合物具有治療偏頭痛的功效未見報道。
本發(fā)明的活性組合物中的活性成分包括：蜜環(huán)菌多糖、低分子量褐藻多糖硫酸酯、γ-氨基丁酸，輔料為麥芽糊精。
蜜環(huán)菌多糖是蜜環(huán)菌中最重要的活性成分。蜜環(huán)菌菌索中分離得到的多糖產物為D－葡萄糖、D－甘露糖、D－半乳糖、D－木糖和半乳糖醛酸；菌絲體和發(fā)酵液多糖為單一葡萄糖組成的葡聚糖；菌索和子實體多糖由葡萄糖、木糖組成。這2種單糖在菌索多糖中的摩爾比為1:14，在子實體多糖中的摩爾比為1:10。蜜環(huán)菌多糖的分子量為10000～70000。蜜環(huán)菌不同發(fā)育階段多糖含量分別為菌絲體含9.00%，發(fā)酵液含0.87g/100ml，菌索含1.12%，子實體含2.27%。
本發(fā)明以野生蜜環(huán)菌或人工發(fā)酵蜜環(huán)菌菌絲體為原料，提取其多糖活性成分。野生蜜環(huán)菌為真菌類擔子菌綱白蘑科蜜環(huán)菌屬植物蜜環(huán)菌Armillaria mellea（Vahl ex Fr.）Quel. 的子實體，是一種藥食兼用真菌。蜜環(huán)菌的菌絲體以菌絲和菌索兩種形式存在，其中菌絲是一種肉眼看不清楚的極纖細的絲狀體，在高倍顯微鏡下觀察，菌絲為無色透明有分隔。在純培養(yǎng)中的菌絲呈現(xiàn)白色或棕色、絨毛狀，蜜環(huán)菌是由營養(yǎng)菌絲形成菌索的少數(shù)菌物屬之一。菌索是由菌絲束組成，表面由排列緊密的菌絲組成，并角質化，對不良環(huán)境有較強的抵抗力，顯示出高度的功能分化。蜜環(huán)菌是天麻生長發(fā)育過程中最重要的營養(yǎng)物質，具有與天麻相似的藥理作用。
野生蜜環(huán)菌又稱榛蘑，藥材收載于《全國中草藥匯編》，榛蘑性味甘，溫。祛風活絡，強筋健骨。用于各種腰腿痛疼，佝僂病，癲癇等癥。榛蘑藥材還收載于《中藥大辭典》，具有祛風活絡，強筋壯骨功能。治羊癇風，各種腰腿疼痛，佝僂病。
褐藻多糖硫酸酯（Fucoidan、FPS）又名巖藻多糖，是以海帶（Laminaria）、裙帶菜（Undaria Pinnatifida）等褐藻為原料，經(jīng)提取精制的多糖類產品。褐藻多糖硫酸酯的活性成分為L-褐藻糖-4-硫酸酯，低分子量褐藻多糖硫酸酯結構和肝素具有相似性，抗凝血作用是其一個突出的特點。在體外褐藻多糖硫酸酯以劑量依賴方式呈現(xiàn)抗凝活性，在體內則比得上肝素的活性。但抗凝血活性以及出血的風險比肝素小，是肝素良好的替代物。
低分子量褐藻多糖硫酸酯，具有顯著的抗凝血作用，對內源性和外源性凝血途徑均具有良好的抑制作用，在連續(xù)給藥時能夠降低血漿纖維蛋白原的含量，并能明顯抑制血栓的形成，還能提高人體抗缺血能力。
褐藻多糖硫酸酯食品標準收載于SC/T 3404-2012《巖藻多糖》，標準中褐藻糖含量為≥15%，硫酸基含量為≥15%；褐藻多糖硫酸酯藥品標準收載于國家藥品標準YBZ00902003-2006，藥品標準中褐藻糖含量為≥25%，水解硫酸基含量為≥22%。
γ-氨基丁酸（GABA）是以L-谷氨酸鈉為原料經(jīng)希氏乳桿菌（Lactobacillus hilgardii）發(fā)酵制成的化合物，分子式：C4H9NO2，分子量：103.12。結構式見圖1
圖1 γ-氨基丁酸結構式
γ-氨基丁酸（GABA）屬強神經(jīng)抑制性氨基酸，是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質。γ-氨基丁酸通過傳遞各種信息而實現(xiàn)調節(jié)機體生理功能，具有鎮(zhèn)靜、催眠、鎮(zhèn)痛、抗驚厥、抗癲癇、降血壓、營養(yǎng)神經(jīng)等生理作用，從而改善神經(jīng)血管性偏頭痛。
在治療偏頭痛過程中，重復服用阿片類止痛藥物，易導致精神和身體依賴以至成癮性。臨床研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制性受體之一的γ-氨基丁酸B型（GABA-B）受體，除了具有鎮(zhèn)痛作用外，還在藥物成癮的臨床治療中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。
γ-氨基丁酸質量標準收載于QB/T 4587-2013《γ-氨基丁酸》和國家衛(wèi)生計生委公告2009年第12號中，食用量：≤500mg/天。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種活性組合物在治療偏頭痛藥物中的應用，即一種治療偏頭痛藥物組合物。
本發(fā)明的另一個目的是提供治療偏頭痛活性組合物的制備方法。
本發(fā)明的技術方案是：一種治療偏頭痛藥物組合物，其特征在于由以下質量百分比原料制成：蜜環(huán)菌多糖30%～60%、低分子量褐藻多糖硫酸酯3%～7%、γ-氨基丁酸8%～17%、輔料麥芽糊精15%～60%。
上述方案中：
治療偏頭痛藥物組合物，由以下質量百分比原料制成：蜜環(huán)菌多糖33%～34%、低分子量褐藻多糖硫酸酯3%～4%、γ-氨基丁酸8%～9%、輔料麥芽糊精55%～56%。
治療偏頭痛藥物組合物，由以下質量百分比原料制成：蜜環(huán)菌多糖60%、低分子量褐藻多糖硫酸酯7%、γ-氨基丁酸17%、輔料麥芽糊精16%。
所述的蜜環(huán)菌多糖是由蜜環(huán)菌為野生榛蘑或人工發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體提取的蜜環(huán)菌多糖。
所述的低分子量褐藻多糖硫酸酯是由海帶科植物海帶（Laminaria Japonica）或墨角藻屬植物墨角藻（FucusvesiculosusL.）提取的褐藻多糖硫酸酯，經(jīng)阿拉伯呋喃糖苷酶降解制成的低分子量褐藻多糖硫酸酯（Fucoidan、FPS），分子量（MW）應為60000～130000。
治療偏頭痛藥物組合物，由以下質量百分比原料制成顆粒：蜜環(huán)菌多糖1000g、低分子量褐藻多糖硫酸酯100g、γ-氨基丁酸250g、麥芽糊精1650g，混合均勻，用14～16目尼龍篩制成濕顆粒，經(jīng)50℃～60℃干燥至水分≤5.0%，裝袋，每袋3g，制成1000袋。
治療偏頭痛藥物組合物，由以下質量百分比原料制成片劑：蜜環(huán)菌多糖3000g、低分子量褐藻多糖硫酸酯350g、γ-氨基丁酸850g、麥芽糊精800g，混合均勻，制成16目的顆粒，壓片，包裝，即得。每片0.5g，制成10000片。
本發(fā)明的制備方法是這樣實現(xiàn)的：
1．蜜環(huán)菌多糖制備
1.1 蜜環(huán)菌子實體多糖的制備：按上述質量比的20倍量稱取蜜環(huán)菌子實體，清洗后60℃干燥，粉碎成1mm左右的粗粉，料液比為1：20，溫度100℃，加水回流提取2次，第一次為3小時，第二次為2小時；合并提取液，真空濃縮成相對密度1.10～1.20（室溫）的清膏；清膏用3～4倍量95%（質量分數(shù)）乙醇沉淀24小時；取沉淀物，用無水乙醇洗滌3次，再用4倍量（質量分數(shù)）≥80℃熱水溶解，放冷至40℃～50℃時，加入1%～3%（質量比）的木瓜蛋白酶，保溫酶解4～5小時；按多糖水溶液：氯仿：正丁醇為25：4：1的比例加入氯仿/正丁醇混合溶液，攪拌30min，以3000r/min離心；取澄清液，濃縮成稠膏，60℃以下真空干燥，粉碎成細粉，即得蜜環(huán)菌子實體多糖。
1.2 蜜環(huán)菌菌絲體多糖的制備：按上述質量比的10倍量取蜜環(huán)菌菌絲體，清洗后60℃干燥，料液比為1：5，溫度90℃～100℃，加水回流提取2次，第一次為2小時，第二次為1小時；合并提取液，真空濃縮成相對密度1.10～1.20（室溫）的清膏；清膏用3～4倍量95%（質量分數(shù)）乙醇沉淀24小時；取沉淀物，用無水乙醇洗滌3次，再用4倍量（質量分數(shù)）≥80℃熱水溶解，放冷至40℃～50℃時，加入1%～3%（質量比）的木瓜蛋白酶，保溫酶解4～5小時；按多糖水溶液：氯仿：正丁醇為25：4：1的比例加入氯仿/正丁醇混合溶液，攪拌30min，以3000r/min離心；取澄清液，濃縮成稠膏，60℃以下真空干燥，粉碎成細粉，即得蜜環(huán)菌菌絲體多糖。
2．低分子量褐藻多糖硫酸酯的制備
按上述質量比的1.2～1.5倍稱取海帶或墨角藻提取的褐藻多糖硫酸酯，按1.5%～3.0%比例溶解于水中，100℃殺菌20～30min；褐藻多糖硫酸酯水溶液降溫至60℃～70℃時，按1%～3%的比例加入阿拉伯呋喃糖苷酶，最適pH≤7，最適反應溫度60℃，反應時間4～5h，對褐藻多糖硫酸酯進行降解；真空濃縮，濃縮液加乙醇至75%，收集沉淀物，干燥，粉碎，即得低分子量褐藻多糖硫酸酯，其分子量（MW）應為60000～130000。
3．γ-氨基丁酸選擇來源于L-谷氨酸鈉為原料經(jīng)希氏乳桿菌（Lactobacillus hilgardii）發(fā)酵而制成的γ-氨基丁酸。γ-氨基丁酸含量≥20％，水分≤10％，灰分≤18％。
4．本發(fā)明的活性組合物顆粒劑的制備：分別稱取蜜環(huán)菌多糖1000g、低分子量褐藻多糖硫酸酯100g、γ-氨基丁酸250g、麥芽糊精1650g，混合均勻，用14～16目尼龍篩制成濕顆粒，經(jīng)50℃～60℃干燥至水分≤5.0%（質量比），裝袋，每袋3g，制成1000袋。
5．本發(fā)明的活性組合物片劑的制備：分別稱取蜜環(huán)菌多糖3000g、低分子量褐藻多糖硫酸酯350g、γ-氨基丁酸850g、麥芽糊精800g，混合均勻，制成16目的顆粒，壓片，包裝，即得。每片0.5g，制成10000片。
本發(fā)明的活性組合物具有預防和治療偏頭痛的功能。
本發(fā)明的優(yōu)點是：1、以食品的活性成分為原料，采用的是藥食同源物質，食用安全，預防和治療效果好，適合偏頭痛人群長期服用，攜帶方便。2、本發(fā)明組合物治療組對單胺類遞質水平均明顯改善，明顯升高腦組織5-HT、NE、DA，說明本發(fā)明組合物能營養(yǎng)機體有關神經(jīng)元，促使其控制的神經(jīng)傳遞物質生成增多，從而改善偏頭痛癥狀。NE的變化與模型組比較有明顯的改善作用。本發(fā)明組合物對硝酸甘油所致的偏頭痛大鼠具有預防性治療作用。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明做進一步描述。
實施例1
1．蜜環(huán)菌多糖制備
1.1 蜜環(huán)菌子實體多糖的制備：按上述質量比的20倍量稱取蜜環(huán)菌子實體，清洗后60℃干燥，粉碎成1mm左右的粗粉，料液比為1：20，溫度100℃，加水回流提取2次，第一次為3小時，第二次為2小時；合并提取液，真空濃縮成相對密度1.10～1.20（室溫）的清膏；清膏用3～4倍量95%（質量分數(shù)）乙醇沉淀24小時；取沉淀物，用無水乙醇洗滌3次，再用4倍量（質量分數(shù)）≥80℃熱水溶解，放冷至40℃～50℃時，加入1%～3%（質量比）的木瓜蛋白酶，保溫酶解4～5小時；按多糖水溶液：氯仿：正丁醇為25：4：1的比例加入氯仿/正丁醇混合溶液，攪拌30min，以3000r/min離心；取澄清液，濃縮成稠膏，60℃以下真空干燥，粉碎成細粉，即得蜜環(huán)菌子實體多糖。
1.2 蜜環(huán)菌菌絲體多糖的制備：按上述質量比的10倍量取蜜環(huán)菌菌絲體，清洗后60℃干燥，料液比為1：5，溫度90℃～100℃，加水回流提取2次，第一次為2小時，第二次為1小時；合并提取液，真空濃縮成相對密度1.10～1.20（室溫）的清膏；清膏用3～4倍量95%（質量分數(shù)）乙醇沉淀24小時；取沉淀物，用無水乙醇洗滌3次，再用4倍量（質量分數(shù)）≥80℃熱水溶解，放冷至40℃～50℃時，加入1%～3%（質量比）的木瓜蛋白酶，保溫酶解4～5小時；按多糖水溶液：氯仿：正丁醇為25：4：1的比例加入氯仿/正丁醇混合溶液，攪拌30min，以3000r/min離心；取澄清液，濃縮成稠膏，60℃以下真空干燥，粉碎成細粉，即得蜜環(huán)菌菌絲體多糖。
實施例2
低分子量褐藻多糖硫酸酯的制備：取海帶或墨角藻提取的褐藻多糖硫酸酯，按1.5%～3.0%比例溶解于水中，100℃殺菌20～30min；褐藻多糖硫酸酯水溶液降溫至60℃～70℃時，按1%～3%的比例加入阿拉伯呋喃糖苷酶，最適pH≤7，最適反應溫度60℃，反應時間4～5h，對褐藻多糖硫酸酯進行降解；真空濃縮，濃縮液加乙醇至75%，收集沉淀物，干燥，粉碎，即得低分子量褐藻多糖硫酸酯，其分子量（MW）應為60000～130000。
實施例3
本發(fā)明的活性組合物顆粒劑的制備：分別稱取蜜環(huán)菌多糖1000g、低分子量褐藻多糖硫酸酯100g、γ-氨基丁酸250g、麥芽糊精1650g，混合均勻，用14～16目尼龍篩制成濕顆粒，經(jīng)50℃～60℃干燥至水分≤5.0%（質量比），裝袋，每袋3g，制成1000袋。
實施例4
本發(fā)明的活性組合物片劑的制備：分別稱取蜜環(huán)菌多糖3000g、低分子量褐藻多糖硫酸酯350g、γ-氨基丁酸850g、麥芽糊精800g，混合均勻，制成16目的顆粒，壓片，包裝，即得。每片0.5g，制成10000片。
實驗例1．按實施例1制備的活性成分蜜環(huán)菌多糖，照分光光度法測定多糖含量：
1.1 試劑和對照品
除非另有說明，在分析中僅使用確認為分析純的試劑和符合GB/T 6682中的蒸餾水。
1.1.1 硫酸（H2SO4），ρ=1.84g/mL
1.1.2 無水乙醇（C2H6O）
1.1.3 苯酚（C6H6O），重蒸餾
1.1.4 葡萄糖（C6H12O6），使用前于105℃恒溫烘干至恒重。
1.1.5 80%苯酚溶液：稱取80g苯酚于100mL燒杯中，加水溶解，定容至100mL后轉至棕色瓶中，置4℃冰箱中避光貯存。
1.1.6 5%苯酚：吸取苯酚5mL溶液（1.1.5），溶于75ml水中，混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。
1.1.6 100mg/L標準葡萄糖溶液：準確稱量0.1000g葡萄糖（1.1.4）于100ml燒杯中，加水溶解，定容至1000ml容量瓶中，搖勻，至4℃冰箱密塞貯存。
1.2 儀器設備及裝置
1.2.1 可見光分光光度計
1.2.2 分析天平，感量0.001g
1.2.3 離心機
1.3 操作步驟
1.3.1 試樣制備
稱取0.5g～1.0g樣品，精確到0. 001g，置于50mL具塞離心管內。用5mL水浸潤樣品，緩慢加人20mL無水乙醇，同時使用渦旋振蕩器振搖，使混合均勻，置超聲提取器中超聲提取30min。提取結束后，于4 000r/ min離心10min，棄去上清液。不溶物用10mL80%乙醇溶液（質量比）洗滌、離心。用水將上述不溶物轉移入圓底燒瓶，加人50mL蒸餾水，裝上磨口的空氣冷凝管，于沸水浴中提取2h。冷卻至室溫，過濾，將上清液轉移至100mL容量瓶中，殘渣洗滌2次～3次，洗滌液轉至容量瓶中，加水定容。此溶液為樣品測定液。
1.3.2 標準曲線
分別吸取0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、1.0mL的標準葡萄糖溶液（1.1.6）置20mL具塞試管中，用蒸餾水補至1.0mL，向試液中加入1.0mL苯酚溶液（1.1.5），然后快速加入5.0mL硫酸（于液面垂直加入，勿接觸試管壁，以便與反應液充分混合），靜置10min，使用渦旋振蕩器使反應液充分混合，然后將試管放置于30℃水浴中反應20min，在490nm處測定吸光度，以葡萄糖質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，制定標準曲線。
1.4 測定
吸取1.00mL樣品溶液于20mL具塞試管中，按1.3.1至1.3.2步驟操作，測定吸光度。同時做空白試驗。
1.5 結果計算
樣品中多糖含量以質量分數(shù)w計，單位以克每百克（g/100g）表示，按公式（1）計算：
式中：
m1：從標準曲線上查得樣品測定液中含糖量，單位為微克（μg）；
V1：樣品定容體積，單位為毫升（mL）；
V2：比色測定時所移取樣品測定液的體積，單位為毫升（mL）；
m2：樣品質量，單位為克（g）；
0.9：葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數(shù)。
計算結果保留至小數(shù)點后兩位。
本品蜜環(huán)菌多糖（以葡萄糖計）不得低于30g/100g。
實驗例2．按實施例2制備的活性成分低分子量褐藻多糖硫酸酯，照分光光度法、高效液相色譜法、分子排阻色譜法測定褐藻糖含量、硫酸基含量和分子量與分子量分布：
2.1 褐藻糖含量測定
（1）對照品溶液的制備：取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥的褐藻糖約10mg，精密稱定，加少量水溶解，溶液轉移至100ml 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。
（2）標準曲線的制備：精密吸取對照品溶液 0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、0.90ml，置比色管中，分別加水至1.0ml，冰水浴中加入87%硫酸溶液4.5ml，搖勻；1分鐘后，在沸水浴中準確加熱10分鐘，迅速冷卻至室溫，加3%半胱氨酸鹽酸鹽溶液0.1ml，搖勻，靜置90分鐘。照分光光度法（中國藥典2015年版四部通則0401）測定，分別在427nm和396nm的波長處測定吸光度。以吸光度之差為縱坐標，以對照品量為橫坐標，繪制標準曲線。
（3）測定法：取經(jīng)五氧化二磷干燥的本品約0.1g，精密稱定，加水溶解，濾過，濾液轉移至100ml 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。取0.2ml置比色管中，照標準曲線制備方法， 自“加水至1.0ml”起，同法測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中相當于褐藻糖的 含量。
本品以干燥品計，含褐藻糖不得少于25％（質量比）。
2.2 硫酸基含量測定：照高效液相色譜法（中國藥典2015版四部通則0512）測定。
（1）色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：AJS－10型陰離子色譜柱；以碳酸氫鈉－碳酸鈉溶液（取0.2mol/L碳酸氫鈉溶液和0.2mol/L碳酸鈉溶液各10ml，再用水稀釋至1000ml）為流動相；以 ASCD-100型抑制電導池為檢測器。理論板數(shù)按硫酸根計算應不低于3500。
（2）對照品溶液的制備：取于105℃干燥2小時的硫酸鉀約907mg（相當于硫酸根500mg），精密稱定，置1000ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備溶液。精密吸取對照品儲備溶液2ml，置50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液標準曲線的制備精密吸取對照品溶液10ml、15ml、20ml，置25ml量瓶中，分別加水稀釋至刻度，搖勻，精密吸取10μl，注入離子色譜儀，測定。以硫酸根的量為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線。
（3）測定法：取本品內容物約0.1g，精密稱定，置10ml安瓿中，加1mol/L鹽酸8ml，封管，在105℃水解4小時，冷卻至室溫，開管，濾過，濾液置100ml量瓶中，以少量水洗滌濾紙與濾器，洗液與濾液合并，加水稀釋至刻度，搖勻；精密量取5ml，置100ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密吸取供試品溶液10μl，注入離子色譜儀，測定，以標準曲線法計算，即得。
本品以干燥品計，含硫酸基不得少于22％（質量比）。
2.3 分子量與分子量分布
照分子排阻色譜法（中國藥典2015年版四部通則0514）測定。
（1）色譜條件及系統(tǒng)適應性試驗：測多糖專用凝膠柱（Shodx OHPaK SB-804HQ）；以 0.71％硫酸鈉溶液為流動相（內含0.02％疊氮化鈉）；柱溫35℃；流速為每分鐘0.5ml；示差折光檢測器。稱取葡聚糖P-5和葡聚糖P-800適量，分別用流動相制成每1ml含5mg的溶液，取20μL注入液相色譜儀，測得保留時間tT和tO；供試品溶液和對照品溶液色譜圖中的保留時間tR 均應在tT和tO之間。理論板數(shù)按葡聚糖P-5峰計算應不小于3000。
（2）對照品溶液：取已知分子量的8個系列葡聚糖對照品，加流動相制成每1ml含5mg的 溶液，振搖，室溫放置過夜，既得。
（3）供試品溶液：取本品適量，加流動相制成每1ml含5mg的溶液，室溫放置過夜，用0.45um的濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。
（4）測定法：取上述各對照品溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，用GPC軟件計算出回歸方程。取供試品溶液20μl，同法測定，用GPC軟件計算供試品的重均分子量及分子 量分布。
本品重均分子量（MW）應為60000～130000，10％大分子部分重均分子量不得大于 750000。
實驗例3．按實施例3、實施例4制成的治療偏頭痛的活性組合物，經(jīng)分光光度法測定蜜環(huán)菌多糖含量：
（1）樣品處理：
a. 樣品提?。悍Q取樣品2.0g，置于100mL容量瓶中，加水80mL，于沸水浴上加熱2小時，冷卻至室溫后補加水至刻度，混勻后過濾，棄去初濾液，收集余下濾液供沉淀多糖。
b. 沉淀粗多糖：準確吸取（a）項終初濾液5.0mL，置于50mL離心管中，加入無水乙醇20mL，混勻5min后，以3000r/min離心5min，棄去上清液。殘渣用80%（體積分數(shù)）乙醇溶液數(shù)毫升洗滌，離心后棄上清液，反復操作3～4次。殘渣用水溶解并定容至5.0mL，混勻后，供沉淀葡聚糖。
c. 沉淀葡聚糖：準確吸?。╞）項終溶液2.0mL置于20mL離心管中，加入100g/L氫氧化鈉溶液2.0mL銅試劑溶液2.0mL，沸水浴中煮沸2min，冷卻，以3000r/min離心5min，棄去上清液。殘渣用洗滌液數(shù)毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復操作3次，殘渣用10%（體積分數(shù)）硫酸溶液2.0mL溶解并轉移至50mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。此溶液為樣品測試溶液。
（2）標準曲線繪制：準確稱取葡聚糖標準使用液0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL（相當于葡聚糖0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg）分別置于25mL比色管中，準確補充水至2.0mL，加入50g/L苯酚溶液1.0mL，在旋轉混勻器上混勻，小心加入濃硫酸10.0mL，于旋轉混勻器上小心混勻，置沸水浴中煮沸2min，冷卻后用分光光度計在485nm波長處以試劑空白溶液為參比，1cm比色皿測定吸光度值。以葡聚糖濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。
（3）樣品測定：準確吸取樣品測定液2.OmL，置于25mL比色管中，加人50g/L苯酚溶液1.OmL，在旋轉混勻器上混勻，小心加入濃硫酸10.OmL于旋轉混勻器上小心混勻，置沸水浴中煮沸2min，冷卻至室溫，用分光光度計在485nm波長處，以試劑空白為參比，1cm比色皿測定吸光度值。從標準曲線上查出葡聚糖含量，計算樣品中粗多糖含量，同時做樣品空白實驗。
本發(fā)明活性組合物顆粒劑，每袋含蜜環(huán)菌多糖（以葡聚糖計）≥200mg；本發(fā)明活性組合物片劑，每片含蜜環(huán)菌多糖（以葡聚糖計）≥60mg。
實驗例4．對實施例3所述的治療偏頭痛的活性組合物進行動物試驗如下：
1．材料與儀器
1.1 動物
雄性豚鼠，體重230～260g，由吉林大學實驗動物中心提供，單籠飼養(yǎng)，自然光照，自然通風，自由進食水。
1.2 藥物
本發(fā)明活性組合物顆粒劑，規(guī)格：3g/袋；天麻素膠囊（昆明制藥集團股份有限公司生產），批準文號：H20013044，規(guī)格：50mg/粒。硝酸甘油注射液（四環(huán)藥業(yè)股份有限公司生產），批號20150501，規(guī)格：5mg/mL。
1.3 儀器
電化學檢測器（HPLC，5600A，Esa，USA）；Sigma 3K15 通用臺式冷凍離心機； PHSJ-3F數(shù)字式pH計（上海雷磁儀器廠）。
2．實驗方法
將實驗動物隨機分為空白組、模型組、本發(fā)明活性組合物治療組、天麻素膠囊治療組，每組10只。造模前每組預防性給藥5d，均為灌胃給藥；本發(fā)明活性組合物按治療劑量給藥為0.5g/kg體重；天麻素膠囊給藥劑量為14mg/kg體重。模型組與假手術組除注入等量的生理鹽水外，其它處理與各組相同。
除空白對照組外，其余各組動物于第5天治療后皮下注射硝酸甘油注射液10mg/kg，對實驗性偏頭痛動物造模。以出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、前肢頻繁撓頭、爬籠次數(shù)增多等提示模型動物頭部不適的癥狀為造模成功的指標。
觀察大鼠造模后耳紅出現(xiàn)和消失的時間；從造模之時起觀察大鼠造模后在每一時間段撓頭的次數(shù)；撓頭出現(xiàn)時間以大鼠出現(xiàn)連續(xù)撓頭次數(shù)達5次以上為標志，消失時間以一個時間段 中大鼠撓頭次數(shù)少于5次并出現(xiàn)倦怠、疲乏的表現(xiàn)為標志。
觀察大鼠行為評價結束后，將動物斷頭處死，取腦，迅速分離腦干，稱重，放入預先編號的凍存管中，快速置于液氦中儲存，備用。采用高效液相（電化學法）測定大鼠腦內5-羥色胺（5-HT)、 5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）、多巴胺（DA）及去甲腎上腺素（NE）等單胺類神經(jīng)遞質的含量。實驗結果見表1～表3。
實驗發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明組合物治療組和天麻素膠囊治療組對偏頭痛大鼠耳紅、撓頭等行為均具有干預作用，能明顯升高大鼠腦組織中5-羥色胺、多巴胺及去甲腎上腺素的含量。模型組腦內神經(jīng)遞質NE、5-HT含量明顯下降，DA含量變化不大，說明偏頭痛發(fā)作與腦干某些神經(jīng)細胞分泌功能下降有關。本發(fā)明組合物治療組對單胺類遞質水平均明顯改善，明顯升高腦組織5-HT、NE、DA，說明本發(fā)明組合物能營養(yǎng)機體有關神經(jīng)元，促使其控制的神經(jīng)傳遞物質生成增多，從而改善偏頭痛癥狀。NE的變化與模型組比較有明顯的改善作用。
本發(fā)明組合物能預防偏頭痛發(fā)作，這種作用可能與調節(jié)機體單胺類神經(jīng)遞質的釋放和代謝機制得以恢復，進而改善腦及血管的功能障礙有關。
綜上所述，本發(fā)明組合物對硝酸甘油所致的偏頭痛大鼠具有預防性治療作用，其作用機制與腦內神經(jīng)遞質5-HT、DA、NE密切相關。