本發(fā)明涉及藥物
技術領域：
，具體來說是一種用于防治肺纖維化的隱丹參酮類及其應用。
背景技術：
：肺纖維化（pulmonaryfibrosis，PF）是病因未明的慢性、進展性間質(zhì)型肺炎的一種特殊類型。發(fā)病人群為50～70歲，男性多發(fā)于女性。生存率低，早期癥狀不明顯，目前治療主要是以緩解病情為主。肺組織分實質(zhì)和間質(zhì)兩部分，實質(zhì)是進行氣體交換的場所，而間質(zhì)則是肺纖維化的發(fā)生部位。過敏反應、環(huán)境顆粒、感染或機械性的損傷均可導致正常組織結(jié)構(gòu)的破壞。急性受損的內(nèi)皮細胞會釋放炎癥因子和啟動抗纖溶系統(tǒng)凝集。同時血小板在受損部位大量聚集，形成富含纖維的凝塊。在炎癥階段，趨化因子梯度會招募大量的炎癥細胞如中性粒細胞、嗜酸性粒細胞等，它們分泌大量的細胞因子，如白介素IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TGF-β，促進上皮細胞向成纖維細胞以及成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化，最終產(chǎn)生大量的細胞外基質(zhì)。在纖維化階段，細胞外基質(zhì)如膠原、纖連蛋白通過整合素等細胞表面受體，介導下游信號的發(fā)生，導致肺組織的正常結(jié)構(gòu)被增厚的纖維組織所填充，氣體交換功能喪失和呼吸衰竭。成纖維細胞異常活化分化成肌成纖維細胞，是肺纖維化合成大量的細胞外基質(zhì)（ECM）的來源。目前可能導致肺纖維化的因素主要包括自身免疫性疾病、抗腫瘤藥物的使用、誤服農(nóng)藥、各種病毒感染以及長期吸入粉塵、長期吸煙等。肺動脈高壓、慢性阻塞性肺疾病、肺癌、胃食管反流病和缺血性心臟病，是肺纖維化常見的合并癥。迄今為止，治療肺纖維化的方法主要有肺移植，去除長期抗原刺激，和藥物治療。其中肺移植是終末肺階段唯一有效的治療方法，但由于缺乏適當?shù)墓w及免疫排斥反應，其開展受到很大的限制。而在藥物治療方面，糖皮質(zhì)激素可以減輕炎癥反應、抑制免疫過程，對以肺泡炎癥為主的肺纖維化有著一定的幫助；但是對彌漫性肺纖維化病人療效甚差，且長期使用糖皮質(zhì)激素副作用太大。中藥理肺化纖方等還處于初步發(fā)展階段。吡啡尼酮是目前新的一種對抗纖維化治療效果比較好的口服藥物，但因其價格不菲，臨床應用受限。丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參SalviamiltiorrhizaBunge的干燥根及根莖，是最常用的活血化瘀中藥之一，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有去瘀止痛、養(yǎng)血安神的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，丹參具有保護血管內(nèi)皮細胞、抗心律失常、抗動脈粥樣硬化、改善微循環(huán)、保護心肌、抑制和解除血小板聚集、增加冠脈流量，提高機體耐缺氧能力，抑制膠原纖維的產(chǎn)生和促進纖維蛋白的降解，抗炎，抗脂質(zhì)過氧化和清除自由基，以及保護肝細胞、抗肺纖維化等作用。隱丹參酮是一種從中藥丹參中提取的有效成分，IUPAC命名（R）-1，2，6，7，8，9-Hexahydro-1，6，6-trimethyl-phenanthro（1，2-b）furan-10，11-dione，英文名稱Cryptotanshinone，分子式C19H2003，分子量294.33；CAS號35825-57-1，物理性質(zhì)：橙色粉末。溶于甲醇、乙醇、苯、乙醚，易溶于丙酮、氯仿；與濃硫酸作用顯紅色，在避光及非溶液狀態(tài)下最穩(wěn)定。熔點184-185℃，易溶于氯仿，溶于甲醇等有機溶劑，微溶于水。隱丹參酮是從植物丹參根部提取的醌類二萜，現(xiàn)代藥理研究表明隱丹參酮具有抑菌作用、抗炎作用、類激素樣藥理作用，臨床用于治療心肌纖維化、肺部急性損傷、關節(jié)炎。迄今為止，未見隱丹參酮作為治療肺纖維化的應用。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術問題是：提供隱丹參酮在制備預防和/或治療肺纖維化疾病藥物中的用途，隱丹參酮通過抑制肺成纖維細胞增殖、抑制肺成纖維細胞活化、降低肺纖維化組織內(nèi)羥脯氨酸含量、降低肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α含量，具有防治肺纖維化的新用途。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是：一種隱丹參酮（Ⅰ）或其藥學上可接受鹽或含有它們中任何一種藥物組合物在制備藥物中的應用；（Ⅰ）。進一步的，隱丹參酮或其藥學上可接受鹽用于預防或/和治療肺纖維化疾病藥物中的應用。進一步的，所述隱丹參酮在制備預防和/或治療肺纖維化疾病藥物中時，抑制肺成纖維細胞活化或增殖的濃度為5～20μM。進一步的，所述隱丹參酮在制備預防和/或治療肺纖維化疾病藥物中時，抑制人胚肺成纖維細胞纖維蛋白表達的濃度為10～20μM。進一步的，所述隱丹參酮在用于治療SD大鼠肺纖維化時，其使用劑量范圍是6～60mg/kg。進一步的，所述隱丹參酮在制備降低肺纖維化大鼠體重、肺系數(shù)、組織內(nèi)羥脯氨酸含量藥物中的用途。進一步的，所述隱丹參酮在制備降低肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α含量藥物中的用途。進一步的，所述隱丹參酮在制備影響大鼠肺纖維化組織病理結(jié)構(gòu)藥物中的用途。本發(fā)明的有益技術效果：隱丹參酮是從植物丹參根部提取的醌類二萜，現(xiàn)代藥理研究表明隱丹參酮具有抑菌作用、抗炎作用、類激素樣藥理作用，臨床用于治療心肌纖維化、肺部急性損傷、關節(jié)炎；可用于用于預防或/和治療肺纖維化疾病藥物，也可用于制備降低肺纖維化大鼠體重、肺系數(shù)、組織內(nèi)羥脯氨酸含量藥物，可用于制備降低肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α含量藥物和制備影響大鼠肺纖維化組織病理結(jié)構(gòu)藥物。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1為隱丹參酮治療28天對大鼠肺組織病理形態(tài)變化的影響（HE染色）；圖2為隱丹參酮治療28天對大鼠肺組織病理形態(tài)變化的影響（MASSON染色）。具體實施方式下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。實驗例1隱丹參酮對人胚肺成纖維細胞（HLF）細胞增殖的影響：（1）實驗材料：HLF細胞購于中山大學實驗動物中心。DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco）、類胎牛血清（美國Hyclone）、MTT（Sigma）；（2）實驗方法：5.0×103的HLF細胞加入到96孔板的板孔中，培養(yǎng)24h。吸出原培養(yǎng)液，加入含有不同濃度（2.5μM、5μM、10μM、20μM）的隱丹參酮的完全培養(yǎng)液，以加入不含隱丹參酮的完全培養(yǎng)液作為正常對照。繼續(xù)培養(yǎng)48h，向每孔中加入20μL的含有5mg/mLMTT的磷酸鹽緩沖鹽水，培養(yǎng)4h后，吸出每孔的培養(yǎng)液，每孔加入200μL的二甲基亞砜（DMSO）。震蕩15min，在490nm波長，檢測各孔吸光度值，檢測細胞活力；（3）實驗結(jié)果：詳見表1。隱丹參酮在3.125-100μM范圍內(nèi)，沒有明顯細胞毒性表1隱丹參酮對人胚肺成纖維細胞（HLF）增殖的細胞毒作用（`x±s）。實驗例2隱丹參酮對TGF-β1刺激人胚肺成纖維細胞（HLF）細胞異?；罨挠绊懀海?）實驗材料：HLF細胞購于中山大學實驗動物中心。DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco）、類胎牛血清（美國Hyclone）、人轉(zhuǎn)化生長因子-β1（HumanTGF-β1，PeproTechInc）；（2）實驗方法：5.0×103的HLF細胞加入到96孔板的板孔中，培養(yǎng)24小時。將肺成纖維細胞分為：TGF-β1處理組（5ng/mL作用時間48h）；TGF-β1處理組（5ng/mL作用時間48h）+隱丹參酮2.5μM；TGF-β1處理組（5ng/mL作用時間48h）+隱丹參酮5μM；TGF-β1處理組（5ng/mL作用時間48h）+隱丹參酮10μM。TGF-β1處理組（5ng/mL作用時間48h）+隱丹參酮20μM。48h后BrdU檢測細胞增殖情況。以TGF-β1未刺激組作為對照，分析各組肺成纖維細胞增殖率的差異；（3）實驗結(jié)果見表2表2隱丹參酮對TGF-β1刺激肺成纖維細胞增殖的影響（`x±s）#p<0.05vsControl;##p<0.01vsControl;*p<0.05，**p<0.01vsmodel.表2結(jié)果可以看出，TGF-β1刺激肺成纖維細胞48h，肺成纖維細胞增殖率明顯增加，說明TGF-β1刺激肺成纖維細胞可以在體外誘導肺成纖維細胞增殖，而加隱丹參酮后5-20μM48h，明顯抑制肺成纖維細胞增殖，說明隱丹參酮抑制肺成纖維細胞異?；罨嶒灷?隱丹參酮對TGF-β1刺激肺成纖維細胞纖維蛋白表達的影響：（1）材料與方法：HLF細胞購于中山大學實驗動物中心；DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco）、人轉(zhuǎn)化生長因子-β1（HumanTGF-β1，PeproTechInc）、α-SMA抗體（Boster公司）、鼠二抗（美國Thermo）；胰蛋白酶、α-tubulin抗體（美國Sigma）、兔二抗（美國Promega）；（2）試驗方法：將細胞接種于6孔板，胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長融合至70～80%，用無血清培養(yǎng)基饑餓24h，換新鮮培養(yǎng)液，將傳代的HLF細胞分為：對照組、隱丹參酮組、隱丹參酮25μM，作用時間48hTGF-β1處理組（5ng/mL作用時間48h）；TGF-β1處理組（5ng/mL作用時間48h）+隱丹參酮25μM；48h后收獲并裂解細胞提取細胞總蛋白。BCA測定蛋白濃度后，取23μg樣品蛋白進行10%的十二烷基磺酸鈉2聚丙烯酞胺（SDS-PAGE）凝膠變性電泳，然后轉(zhuǎn)至（PVDF膜，α-tublin作內(nèi)參，Westernblot檢測細胞α-SMA的表達。以TGF-β1未刺激組作為對照，使用Graphpadprism統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，各組之間的差異采用one-wayANOVA分析；（3）試驗結(jié)果表3隱丹參酮對TGF-β1刺激肺成纖維細胞的α-SMA表達影響（n=4）組別COL-I（%）正常組1.00±0.12隱丹參酮組（20μM）1.22±0.21TGF一β1刺激組2.08±0.76##TGF一β1刺激+隱丹參酮組（10μM）1.15±0.17TGF一β1刺激+隱丹參酮組（20μM）0.90±0.64**#p<0.05vsControl;##p<0.01vsControl;*p<0.05，**p<0.01vsmodel.表3結(jié)果可以看出，TGF-β1刺激肺成纖維細胞48h，纖維蛋白α-SMA表達明顯下降，說明TGF-β1刺激肺成纖維細胞可以在體外誘導向肺成纖維母細胞轉(zhuǎn)化，而加隱丹參酮25μM后48h，明顯抑制α-SMA表達，說明隱丹參酮抑制肺成纖維細胞向肺成纖維母細胞轉(zhuǎn)化。實驗例4隱丹參酮對博萊霉素（BLM）誘導的肺纖維化模型大鼠的影響用博萊霉素制作的肺纖維化模型，其病理組織學和生理學改變與人類肺纖維化近似，因此成為肺纖維化造模的常用藥物。博萊霉素經(jīng)氣管滴注給藥可誘導SD大鼠發(fā)生肺纖維化。在博來霉素給藥后，灌胃給予藥物隱丹參酮，劑量分別為6mg/kg、20mg/kg、60mg/kg，對照組為等劑量的水；（1）實驗材料實驗動物：清潔級SD（Sprague-Dawley）大鼠60只，8周齡，體重180-220g，雌性，購自于中山大學實驗動物中心（許可證號：SYXK（粵）2011-0029），動物合格證編號:44008500011143，環(huán)境溫度:20～26℃，濕度40～70%，自由攝食飲水；博萊霉素（invitrogen）、吡非尼酮（上海麥克林）、羥脯氨酸檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）、隱丹參酮（中山大學藥物化學研究所）；隱丹參酮由中山大學藥物化學研究所提供（批號：20071011，含量：95%），臨用前稱取60mgCTS單體原料藥至10mL0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）中，震蕩混勻制成混懸液，配成濃度為60mg·mL?1的高劑量CTS，依次稀釋得中劑量（20mg·mL?1）、低劑量（6mg·mL?1）。灌胃給藥體積均為10mL/kg；（2）實驗方法動物分組：大鼠采用隨機數(shù)字表法分成6組，每組10只，分別為對照組、模型組、隱丹參酮低、中、高劑量組、吡非尼酮組（60mg/kg）；模型制備：大鼠博來霉素誘導的肺纖維化模型的建立：10%水合氯醛（3.5ml/kg）麻醉后，固定于手術臺上，局部消毒后，用剪刀剪開喉部皮膚，做頓性分離逐漸使氣管暴露，后用1ml注射器吸取配備好的博萊霉素溶液0.1ml（5mg/kg），向氣管內(nèi)快速注射，后垂直放置大鼠，將其左右旋轉(zhuǎn)3-4周，使博萊霉素溶液均勻分布于肺部，后用針線縫合手術傷口，讓大鼠自然清醒；給藥方案：各組動物經(jīng)博萊霉素造模后，第二天開始大鼠每隔一天稱重一次，按照相應的體重灌胃給藥，正常組及模型組給予等體積生理鹽水，陽性對照組給予吡非尼酮，各治療組分別給予不同劑量的隱丹參酮。連續(xù)給藥28天；檢測指標：實驗第28天為終點，觀察各組大鼠的大體情況并記錄，后在水合氯醛腹腔麻醉的條件下，收集各組大鼠的肺泡灌洗液，稱肺重，取血離心測定細胞因子，下半部分福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋切片，做HE染色和Masson染色；（3）實驗結(jié)果1）隱丹參酮對博萊霉素誘導肺纖維化大鼠肺組織中羥脯氨酸（HYp）和肺系數(shù)的影響（x士s，n=10～12）造模后給藥28天，與正常對照組相比，模型組大鼠體重顯著減輕，肺組織中羥脯氨酸含量顯著增加（p<0.05），肺系數(shù)顯著高于正常組（p<0.01）；隱丹參酮各劑量組大鼠體重顯著增加，大鼠肺組織中羥脯氨酸的含量低于模型組，肺系數(shù)均低于模型組。陽性對照吡非尼酮組大鼠肺組織中羥脯氨酸含量與模型組相比顯著降低（p<0.01），肺系數(shù)亦有所下降，見表4；表4隱丹參酮對博萊霉素誘導肺纖維化大鼠肺組織中羥脯氨酸（HYP）和肺系數(shù)的影響#p<0.05vsControl;##p<0.01vsControl;*p<0.05，**p<0.01vsmodel.2）隱丹參酮對肺纖維化大鼠肺泡灌洗液炎癥細胞因子表達的影響大鼠博萊霉素造模28天后，肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α表達較空白對照組明顯上升（p<0.01）；大鼠灌胃隱丹參酮后，能明顯降低肺組織中以上細胞因子的表達），見表5；表5隱丹參酮對肺纖維化大鼠肺組織中細胞因子表達的影響組別劑量（mg/kg）IL-1β（ng/L）IL-6（ng/L）TNF-α（ng/mL）對照組（10mg/kg）6.75±1.189.31±1.18131.75±25.00模型組（10mg/kg）17.23±3.72##27.91±5.30##341.9±81.23##吡非尼酮組608.64±2.70**9.84±2.31**214.16±60.54*隱丹參酮組低劑量組612.44±1.5612.27±4.07**168.61±16.72**中劑量組2011.53±1.24*11.63±0.20**143.35±38.43**高劑量組604.43±0.43**13.25±0.20**214.16±60.54**注:#p<0.05vsControl;##p<0.01vsControl;*p<0.05，**p<0.01vsmodel.3）隱丹參酮對肺纖維化大鼠肺組織病理結(jié)構(gòu)改變的影響HE染色結(jié)果顯示：正常組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡壁未見增厚，肺泡腔透亮，腔內(nèi)未見明顯滲出，無炎性細胞浸潤，無成纖維細胞增生。模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔增寬，大量炎性細胞浸潤及成纖維細胞增生，肺纖維化形成。隱丹參酮各給藥組與模型組比較情況好轉(zhuǎn)，病變范圍明顯減少，肺實質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞較少。陽性對照吡非尼酮組病變程度較模型組有所減輕。見附圖1；馬蘇染色結(jié)果顯示：正常對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，纖維化模型組大鼠在肺泡間隔、肺泡壁，以及終末細支氣管、呼吸性細支氣管和小支氣管管壁周圍均可見到大量增生的藍色膠原纖維，隱丹參酮各組與模型組相比纖維化程度輕，膠原總含量較少，表明隱丹參有減輕膠原纖維增生，改善肺間質(zhì)纖維化的作用，陽性對照吡非尼酮組病變程度較模型組有所減輕，見附圖2。本
技術領域：
技術人員可以理解，除非另外定義，這里使用的所有術語（包括技術術語和科學術語）具有與本發(fā)明所屬領域中的普通技術人員的一般理解相同的意義。還應該理解的是，諸如通用字典中定義的那些術語應該被理解為具有與現(xiàn)有技術的上下文中的意義一致的意義，并且除非像這里一樣定義，不會用理想化或過于正式的含義來解釋。最后所應說明的是：以上實施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術方案，盡管參照上述實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應該理解：依然可以對本發(fā)明進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍當中。當前第1頁1 2 3