本發(fā)明涉及組織工程骨領域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種用于髕骨修復的組織工程骨支架及其制備方法。
背景技術：
目前，人工全膝關節(jié)置換術(total knee arthroplasty，簡稱TKA)是治療各種膝關節(jié)炎癥的一種有效且成熟的治療方式。隨著髕骨的機械力學機制的深入研究，髕骨在膝關節(jié)活動中所起的作用被越來越多的人所重視。為了降低TKA術后髕前區(qū)疼痛的發(fā)生率，往往也進行髕骨表面置換。在髕骨表面置換手術過程中，關鍵步驟是通過對髕骨截骨，并將髕骨假體植入以恢復髕骨正常厚度。合理的髕骨截骨是減少髕骨骨折、髕骨外傾等術后并發(fā)癥的重要保證。同時，為了保護髕骨血運，應盡量保留髕下脂肪墊。但是在手術中往往會出現髕骨假體磨損、松動以及斷裂等，這些并發(fā)癥可以直接導致髕骨表面置換的失敗。
技術實現要素：
本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。
本發(fā)明還有一個目的是提供一種用于髕骨修復的組織工程骨支架，其能夠將所述組織工程骨支架按照可降解材料的降解速度分層設置，并匹配脂肪干細胞的成骨分化速度；促進髕骨生長，提高髕骨置換手術的成功率。
為了實現根據本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點，提供了一種用于髕骨修復的組織工程骨支架，其包括：
內層支架，其為由羥丙基殼聚糖制成三維多孔支架，所述三維多孔支架上負載脂肪干細胞后并置于生物反應器中進行傳代培養(yǎng)10次以上；
中層支架，其為由可降解鎂合金材料制成的多孔支架，所述中層支架的孔隙度為45％；所述中層支架經過第一脂肪干細胞懸液浸泡處理；所述第一脂肪干細胞懸液中脂肪干細胞的含量為5-7╳105個/mL；
外層支架，其為由可降解鎂合金材料制成，所述外層支架的孔隙度為20％；所述外層支架將第二脂肪干細胞懸液浸泡處理；所述第二脂肪干細胞懸液中脂肪干細胞的含量為8-10╳105個/mL。
優(yōu)選的是，所述內層支架通過將所述羥丙基殼聚糖溶解于去離子水中，攪拌后靜置使其充分溶解；然后加入脂肪干細胞攪拌均勻，通過靜電紡絲技術制備三維多孔支架；所述脂肪干細胞的含量為107-8×108個/mL。
優(yōu)選的是，所述第一脂肪干細胞懸液和第二脂肪干細胞懸液中所用脂肪干細胞均為傳代10次以上的脂肪干細胞。
優(yōu)選的是，所述脂肪干細胞為自體脂肪干細胞，其通過以下方法獲得：將脂肪組織依次進行消化處理和離心分離，得到脂肪干細胞；將所述脂肪干細胞與含15％胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液混合得到細胞懸液，所述細胞懸液置于37℃、CO2含量為5％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每4-5天后更換一次培養(yǎng)液，待細胞生長達到80％融合后，加0.25％胰酶-EDTA進行消化；然后加入含15％胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液終止消化；隨后離心后取細胞沉淀，加入含15％胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液，所述細胞懸液置于37℃、CO2含量為5％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按1:2-3傳代，獲得傳代培養(yǎng)10次以上的脂肪干細胞。
優(yōu)選的是，所述第一脂肪干細胞懸液由以下組分制成：脂肪干細胞5-7╳105個/mL、10mmol/Lβ-2磷酸甘油、1μmol/L地塞米松、50mg/L抗壞血酸磷酸鈉、100U/ml青霉素以及100U/ml鏈霉素。
優(yōu)選的是，所述第二脂肪干細胞懸液由以下組分制成：脂肪干細胞8-10╳105個/mL、10mmol/Lβ-2磷酸甘油、1μmol/L地塞米松、50mg/L抗壞血酸磷酸鈉、100U/ml青霉素以及100U/ml鏈霉素。
優(yōu)選的是，所述外層支架外層具有羥基磷灰石涂層。
優(yōu)選的是，所述內層支架厚度為：2-2.5mm；中層支架的厚度為：10-15mm；外層支架的厚度為：6-8mm。
本發(fā)明還提供了所述用于髕骨修復的組織工程骨支架的制備方法，其包括以下步驟：
步驟一，提取自體脂肪干細胞，具體為：將吸脂手術獲得的脂肪組織依次進行消化處理和離心分離，得到脂肪干細胞；將所述脂肪干細胞與含15％胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液混合得到細胞懸液，所述細胞懸液置于37℃、CO2含量為5％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每4-5天后更換一次培養(yǎng)液，待細胞生長達到80％融合，加0.25％胰酶-EDTA進行消化；加入含15％胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液終止消化；離心后取細胞沉淀，加入含15％胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液，所述細胞懸液置于37℃、CO2含量為5％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按1:2-3傳代，獲得傳代培養(yǎng)10次以上的脂肪干細胞；
步驟二，制備所述內層支架，取羥丙基殼聚糖溶解于去離子水中，攪拌后靜置使其充分溶解；然后加入脂肪干細胞攪拌均勻，通過靜電紡絲技術制備三維多孔支架；所述脂肪干細胞的含量為107-8×108個/mL；
步驟三，制備中層支架，利用粉末冶金技術制備鎂合金多孔支架，控制所述中層支架的孔隙率為45％；然后將所述中層支架與第一脂肪干細胞懸液中浸泡48-72h；取出備用；
步驟四，制備外層支架，利用粉末冶金技術制備鎂合金多孔支架，然后將鎂合金多孔支架浸泡于第二脂肪干細胞懸液中，保持48-72h；之后利用等離子體噴涂技術將羥基磷灰石涂層噴涂至所述外層支架上，備用；
步驟五，將所述內層支架、中層支架以及外層支架進行連接。
優(yōu)選的是，所述內層支架、中層支架以及外層支架通過鉚釘方式連接，所述鉚釘采用鎂合金材料制成。
本發(fā)明至少包括以下有益效果：本發(fā)明所述用于髕骨修復的組織工程骨支架，將自體脂肪干細胞充分填充至所述支架中，所述組織工程骨支架按照降解速度以及生物溶合性分層設置，內層支架選用羥丙基殼聚糖作為基材，其在植入關節(jié)后，在體溫作用下逐漸釋放傳代10次以上的脂肪干細胞，促進所述脂肪干細胞進行成骨分化，加快內層支架的軟骨快速形成，減少組織工程骨的磨損。所述中層支架采用可降解的鎂合金材料，利用粉末冶金技術控制其孔隙率在45％左右，同時利用第一脂肪干細胞懸液浸泡后，脂肪干細胞填充至所述中層支架的孔隙中，隨著中層支架的逐步降解，釋放第一脂肪干細胞懸液，所述第一脂肪干細胞懸液中的脂肪干細胞在其內培養(yǎng)液中，進行成骨分化，逐步形成髕骨組織。所述外層支架選用經過羥基磷灰石涂層的鎂合金多孔支架，適當減緩外層支架的降解速度，為中層支架和內層支架的髕骨組織形成提供充足的時間。同時所述外層支架的孔隙率設置為20％，使得外層支架具有足夠的強度，放置組織工程骨支架斷裂，提高手術成功率。
本發(fā)明的其它優(yōu)點、目標和特征將部分通過下面的說明體現，部分還將通過對本發(fā)明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。
應當理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術語并不排除一個或多個其它元件或其組合的存在或添加。
本發(fā)明提供一種用于髕骨修復的組織工程骨支架，其包括：
內層支架，其為由羥丙基殼聚糖制成三維多孔支架，所述三維多孔支架上負載脂肪干細胞后并置于生物反應器中進行傳代培養(yǎng)10次以上；所述內層支架厚度為：2-2.5mm；所述內層支架通過將所述羥丙基殼聚糖溶解于去離子水中，攪拌后靜置使其充分溶解；然后加入脂肪干細胞攪拌均勻，通過靜電紡絲技術制備三維多孔支架；所述脂肪干細胞的含量為107-8×108個/mL。利用靜電紡絲技術，在制備支架過程中，對脂肪干細胞施加適當的拉伸，促進其成骨分化，增加所述內層支架的孔隙率，便于脂肪干細胞快速成骨分化后并促進軟骨生長。同時內層支架選用羥丙基殼聚糖作為基材制備三維多孔支架，提高其生物溶合性，降低患者不適感。
中層支架，其為由可降解鎂合金材料制成的多孔支架，所述中層支架的孔隙度為45％；所述中層支架經過第一脂肪干細胞懸液浸泡處理；所述第一脂肪干細胞懸液中脂肪干細胞的含量為5-7╳105個/mL；所用脂肪干細胞均為傳代10次以上的脂肪干細胞。中層支架的厚度為：10-15mm。所述第一脂肪干細胞懸液由以下組分制成：脂肪干細胞5-7╳105個/mL、10mmol/Lβ-2磷酸甘油、1μmol/L地塞米松、50mg/L抗壞血酸磷酸鈉、100U/ml青霉素以及100U/ml鏈霉素。中層支架選用鎂合金可降解材料制備，適當縮小其孔隙率，保證中層支架在內層支架脂肪干細胞生長轉化過程中維持一定機械強度，防止手術恢復過程中，髕骨斷裂。所述第一脂肪干細胞懸液例如選用將一定量的脂肪干細胞懸浮于成骨誘導培養(yǎng)基中，隨著中層支架的降解，脂肪干細胞逐漸轉化成軟骨組織，提高手術成功率。
以及外層支架，其為由可降解鎂合金材料制成，所述外層支架的孔隙度為20％；所述外層支架將第二脂肪干細胞懸液浸泡處理；所述第二脂肪干細胞懸液中脂肪干細胞的含量為8-10╳105個/mL。所用脂肪干細胞均為傳代10次以上的脂肪干細胞。所述第二脂肪干細胞懸液由以下組分制成：脂肪干細胞8-10╳105個/mL、10mmol/Lβ-2磷酸甘油、1μmol/L地塞米松、50mg/L抗壞血酸磷酸鈉、100U/ml青霉素以及100U/ml鏈霉素。所述外層支架外層具有羥基磷灰石涂層。外層支架的厚度為：6-8mm。所述外層支架選用設置有羥基磷灰石涂層的鎂合金支架，目的是減緩外層支架的降解速度，為中層支架和內層支架脂肪干細胞的分化，生長提供足夠的時間。
其中，所述脂肪干細胞為自體脂肪干細胞，其通過以下方法獲得：將脂肪組織依次進行消化處理和離心分離，得到脂肪干細胞；將所述脂肪干細胞與含15％胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液混合得到細胞懸液，所述細胞懸液置于37℃、CO2含量為5％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每4-5天后更換一次培養(yǎng)液，待細胞生長達到80％融合后，加0.25％胰酶-EDTA進行消化；然后加入含15％胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液終止消化；隨后離心后取細胞沉淀，加入含15％胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液，所述細胞懸液置于37℃、CO2含量為5％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按1:2-3傳代，獲得傳代培養(yǎng)10次以上的脂肪干細胞。所述脂肪干細胞選用自體脂肪分離、培養(yǎng)、傳代而成，減少患者的排異反應，提高手術成功率。
實施例1
本發(fā)明提供一種用于髕骨修復的組織工程骨支架，其包括：
內層支架，其為由羥丙基殼聚糖制成三維多孔支架，所述三維多孔支架上負載脂肪干細胞后并置于生物反應器中進行傳代培養(yǎng)10次以上；所述內層支架厚度為：2.5mm；所述內層支架通過將所述羥丙基殼聚糖溶解于去離子水中，攪拌后靜置使其充分溶解；然后加入脂肪干細胞攪拌均勻，通過靜電紡絲技術制備三維多孔支架；所述脂肪干細胞的含量為107-8個/mL。其中所述靜電紡絲裝置例如選用高壓靜電發(fā)生器、噴頭和接收裝置，靜電紡絲時選用的電壓例如為45kV；噴頭孔徑例如為0.6mm，接收裝置與噴頭距離例如為20cm。經過多層纖維疊加形成三維多孔支架，其孔隙率例如為50％。
中層支架，其為由可降解鎂合金材料制成的多孔支架，所述中層支架的孔隙度為45％；所述中層支架經過第一脂肪干細胞懸液浸泡處理；所述第一脂肪干細胞懸液中脂肪干細胞的含量為5-7╳105個/mL；所用脂肪干細胞均為傳代10次以上的脂肪干細胞。中層支架的厚度為：15mm。所述第一脂肪干細胞懸液由以下組分制成：脂肪干細胞7╳105個/mL、10mmol/Lβ-2磷酸甘油、1μmol/L地塞米松、50mg/L抗壞血酸磷酸鈉、100U/ml青霉素以及100U/ml鏈霉素。
以及外層支架，其為由可降解鎂合金材料制成，所述外層支架的孔隙度為20％；所述外層支架將第二脂肪干細胞懸液浸泡處理；所述第二脂肪干細胞懸液中脂肪干細胞的含量為8-10╳105個/mL。所用脂肪干細胞均為傳代10次以上的脂肪干細胞。所述第二脂肪干細胞懸液由以下組分制成：脂肪干細胞8-10╳105個/mL、10mmol/Lβ-2磷酸甘油、1μmol/L地塞米松、50mg/L抗壞血酸磷酸鈉、100U/ml青霉素以及100U/ml鏈霉素。所述外層支架外層具有羥基磷灰石涂層。外層支架的厚度為：8mm。所述中層支架和外層支架均采用粉末合金進行特殊定制，控制其孔隙率。本發(fā)明所述中層支架和外層支架均是工廠定制。
實施例2
本發(fā)明提供一種用于髕骨修復的組織工程骨支架，其包括：
內層支架，其為由羥丙基殼聚糖制成三維多孔支架，所述三維多孔支架上負載脂肪干細胞后并置于生物反應器中進行傳代培養(yǎng)10次以上；所述內層支架厚度為：2.5mm；所述內層支架通過將所述羥丙基殼聚糖溶解于去離子水中，攪拌后靜置使其充分溶解；然后加入脂肪干細胞攪拌均勻，通過靜電紡絲技術制備三維多孔支架；所述脂肪干細胞的含量為107-8個/mL。其中所述靜電紡絲裝置例如選用高壓靜電發(fā)生器、噴頭和接收裝置，靜電紡絲時選用的電壓例如為45kV；噴頭孔徑例如為0.6mm，接收裝置與噴頭距離例如為20cm。經過多層纖維疊加形成三維多孔支架，其孔隙率例如為50％。
中層支架，其為由可降解鎂合金材料制成的多孔支架，所述中層支架的孔隙度為45％；所述中層支架經過第一脂肪干細胞懸液浸泡處理；所述第一脂肪干細胞懸液中脂肪干細胞的含量為5-7╳105個/mL；所用脂肪干細胞均為傳代10次以上的脂肪干細胞。中層支架的厚度為：15mm。所述第一脂肪干細胞懸液由以下組分制成：脂肪干細胞7╳105個/mL、10mmol/Lβ-2磷酸甘油、1μmol/L地塞米松、50mg/L抗壞血酸磷酸鈉、100U/ml青霉素以及100U/ml鏈霉素。
以及外層支架，其為由可降解鎂合金材料制成，所述外層支架的孔隙度為20％；所述外層支架將第二脂肪干細胞懸液浸泡處理；所述第二脂肪干細胞懸液中脂肪干細胞的含量為8-10╳105個/mL。所用脂肪干細胞均為傳代10次以上的脂肪干細胞。所述第二脂肪干細胞懸液由以下組分制成：脂肪干細胞8-10╳105個/mL、10mmol/Lβ-2磷酸甘油、1μmol/L地塞米松、50mg/L抗壞血酸磷酸鈉、100U/ml青霉素以及100U/ml鏈霉素。所述外層支架外層具有羥基磷灰石涂層。外層支架的厚度為：8mm。所述中層支架和外層支架均采用粉末合金進行特殊定制，控制其孔隙率。本發(fā)明所述中層支架和外層支架均是工廠定制。
對比例
關節(jié)置換手術中，選用常規(guī)的髕骨假體進行植入。
本發(fā)明一共選用60名患者進行關節(jié)置換手術，其中20名在關節(jié)置換手術中選用本發(fā)明實施例1所述用于髕骨修復的組織工程骨支架，其中20名在關節(jié)置換手術中選用本發(fā)明實施例2所述用于髕骨修復的組織工程骨支架，另外20名在關節(jié)置換手術中選用常規(guī)的髕骨假體進行植入。
手術三個月后檢查關節(jié)部位的髕骨完整度，發(fā)現選用實施例1和實施例2所述組織工程骨支架的患者，髕骨發(fā)育完整度良好，沒有出現中間斷裂，松動，甚至關節(jié)炎癥的情況。手術六個月后手術部分沒有發(fā)現支架材料，說明支架材料已經全部降解。而對比例中，3名患者出現髕骨斷裂導致手術失敗。5名患者出現了關節(jié)炎癥。
本發(fā)明還提供了所述用于髕骨修復的組織工程骨支架的制備方法，其包括以下步驟：
步驟一，提取自體脂肪干細胞，具體為：將吸脂手術獲得的脂肪組織依次進行消化處理和離心分離，得到脂肪干細胞；將所述脂肪干細胞與含15％胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液混合得到細胞懸液，所述細胞懸液置于37℃、CO2含量為5％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每4-5天后更換一次培養(yǎng)液，待細胞生長達到80％融合，加0.25％胰酶-EDTA進行消化；加入含15％胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液終止消化；離心后取細胞沉淀，加入含15％胎牛血清的高糖DMEM的培養(yǎng)液，所述細胞懸液置于37℃、CO2含量為5％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按1:2-3傳代，獲得傳代培養(yǎng)10次以上的脂肪干細胞；
步驟二，制備所述內層支架，取羥丙基殼聚糖溶解于去離子水中，攪拌后靜置使其充分溶解；然后加入脂肪干細胞攪拌均勻，通過靜電紡絲技術制備三維多孔支架；所述脂肪干細胞的含量為107-8×108個/mL；
步驟三，制備中層支架，利用粉末冶金技術制備鎂合金多孔支架，控制所述中層支架的孔隙率為45％；然后將所述中層支架與第一脂肪干細胞懸液中浸泡48-72h；取出備用；
步驟四，制備外層支架，利用粉末冶金技術制備鎂合金多孔支架，然后將鎂合金多孔支架浸泡于第二脂肪干細胞懸液中，保持48-72h；之后利用等離子體噴涂技術將羥基磷灰石涂層噴涂至所述外層支架上，備用；
步驟五，將所述內層支架、中層支架以及外層支架進行連接。所述內層支架、中層支架以及外層支架例如通過鉚釘方式連接，所述鉚釘采用鎂合金材料制成。三者也可以通過可降解的生物粘合劑進行粘合。所述生物粘合劑例如為：聚乙烯醇交聯(lián)生物粘合劑或者異氰酸酯基封端可降解粘合劑等。
盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的實施例。