本發(fā)明屬于中藥化合物新用途領(lǐng)域，特別是蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿中的一種或幾種作為glut4活性促進(jìn)劑的用途。

背景技術(shù)：

蓮子心系睡蓮科植物蓮nelumbonuciferagaertn.的成熟種子中的干燥幼葉及胚根。其味苦、寒，歸心、腎經(jīng)，具有清心安神、交通心腎、澀精止血的功能，古代主要用于熱入心包、神昏譫語、心腎不交，失眠遺精，血熱吐血。蓮子心的主要成分為蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿等生物堿及木犀黃酮苷、金絲桃苷、蕓香苷等黃酮類。

下式為蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

現(xiàn)代藥理研究表明，其具有降血壓、抗心律失常、抑制血小板聚集、抗氧化及清除活性自由基、抗心肌缺血、松弛平滑肌、強心、抗癌、對腦缺血損傷的保護(hù)、改善急性肺損傷及肺纖維化、中樞抑制、降血糖等藥理作用。

甲基蓮心堿可分別調(diào)節(jié)哺乳動物包括人的m8和v1亞型瞬變受體電位離子通道(簡稱trpm8和trpv1)(中國專利公開號101862331a)。甲基蓮心堿及其類似物或它們藥學(xué)上可接受的鹽可與g-四鏈體dna結(jié)合，增加g-四鏈體的穩(wěn)定性，從而競爭性抑制端粒酶與端粒的結(jié)合，抑制端粒酶的活性，減弱細(xì)胞的增殖能力，抑制端粒延伸，促進(jìn)細(xì)胞凋亡(中國專利公開號101371838)。蓮子心及其提取物、蓮子心總生物堿、雙芐基異喹啉-(7-0-11’)-單醚鍵生物堿衍生物或類似物對5α-還原酶有抑制作用(中國專利公開號101862374a)；甲基蓮心堿和異蓮心堿對5α-還原酶有抑制作用(“甲基蓮心堿和異蓮心堿對5α-還原酶抑制作用的研究”，楊小青等，中國藥師，2016年03期)。蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿對乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶具有濃度依賴性抑制作用(異蓮心堿、蓮心堿和甲基蓮心堿的抗癡呆作用，張志新，華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文，2010年12月)。

蓮子心提取物生物堿的其他用途有待進(jìn)一步開發(fā)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿中的一種或幾種化合物的新用途。

本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿中的一種或幾種可以用于制備glut4活性促進(jìn)劑。

glut4即葡萄糖轉(zhuǎn)運體-4(glucosetransportertype4)，分子含有509個氨基酸殘基，是目前已知的14種促進(jìn)跨膜己糖轉(zhuǎn)運體葡萄糖轉(zhuǎn)運體(glut)家族成員之一。每一種glut對于特定的己糖都有自己獨特的親和力和特異性，同時也有各自獨特的組織分布、細(xì)胞內(nèi)定位和生理功能。蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿，均能夠有效促進(jìn)glut4的活性，而對glut家族的其他成員不起作用，而且這種活性是通過ampk信號通路來介導(dǎo)的。

本發(fā)明還保護(hù)異蓮心堿在制備ampk激活劑中的用途。

本發(fā)明還保護(hù)蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿中的一種或幾種在制備glut4蛋白表達(dá)促進(jìn)劑中的用途。研究發(fā)現(xiàn)蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿能夠上調(diào)glut4蛋白的表達(dá)。

本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明通過研究，發(fā)現(xiàn)了蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿均具有良好的促glut4上膜的活性，且異蓮心堿活性最強。但是這三種化合物的活性均能被ampk抑制劑compondc完全抑制，說明蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿通過ampk信號通路來發(fā)揮其活性作用。發(fā)現(xiàn)了異蓮心堿可以激活ampk代謝通路。還發(fā)現(xiàn)了蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿均能上調(diào)glut4蛋白的表達(dá)。本發(fā)明為glut4和ampk信號通路的基礎(chǔ)研究工作提供了新的靶標(biāo)，將更有助于細(xì)致深入地對細(xì)胞的生理活性進(jìn)行研究。

附圖說明

圖1：蓮心堿，異蓮心堿，甲基蓮心堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖；

圖2：蓮心堿，異蓮心堿，甲基蓮心堿促l6細(xì)胞glut4上膜活性實驗結(jié)果；

圖3：蓮心堿，異蓮心堿，甲基蓮心堿促l6細(xì)胞葡萄糖攝取活性實驗結(jié)果；

圖4：異蓮心堿對kk-ay小鼠骨骼肌中g(shù)lut4，p-ampk表達(dá)的影響；

圖5：異蓮心堿對kk-ay小鼠肝臟中p-ampk表達(dá)的影響；

以上圖中，normalcontrol表示正常組，vehiclecontrol表示模組，metformin表示鹽酸二甲雙胍陽性藥物組，insulin表示胰島素給藥組，liensinine表示蓮心堿給藥組，isolie表示異蓮心堿給藥組，nerferine表示甲基蓮心堿給藥組。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好地理解本發(fā)明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發(fā)明的限定。

一、蓮心堿，異蓮心堿，甲基蓮心堿的分離制備

蓮子的胚芽(蓮子心)于2013年7月從安徽亳州藥材市場購買，由中南民族大學(xué)藥學(xué)院萬定榮教授鑒定為蓮(nelumbonucifera)的胚芽，標(biāo)本(sc0005)儲藏于中南民族大學(xué)藥學(xué)院標(biāo)本館。自然干燥的蓮心3公斤粉碎成粉末，采用95％乙醇回流提取4次，每次4小時，溶劑5.0升?；亓鹘Y(jié)束后，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)濃縮提取液，得1200毫升流浸膏，加蒸餾水稀釋成2500毫升混懸液。混懸液采用5％的稀鹽酸調(diào)成ph2左右，震搖均勻，加入約2000毫升石油醚與酸水層進(jìn)行萃取，石油醚萃取操作重復(fù)4次。余下的酸水層用濃氨水調(diào)成ph9-10，加入約2000毫升氯仿與堿水層進(jìn)行萃取，氯仿萃取操作重復(fù)4次，合并氯仿萃取液，回收濃縮干燥得50克總生物堿。45克總生物堿采用中壓硅膠柱層析(300-400目硅膠h)進(jìn)行制備分離，選擇二氯甲烷：甲醇：二乙胺(100:5:2)混合溶劑作為洗脫劑等梯度洗脫，薄層層析檢測，合并相同的流分得到8個部位f1-8(f1，2.2升洗脫劑；f2，2.7升洗脫劑；f3，3.2升洗脫劑；f4，2.5升洗脫劑；f5，3.8升洗脫劑；f6，3.7升洗脫劑；f7，4.6升洗脫劑；f8，6.2升洗脫劑)。

f3部位減壓濃縮干燥得到4.2克淡黃色粉末，溶解于100毫升干燥丙酮，然后溶液中加入10％高氯酸調(diào)ph到2-3；酸性f3溶液保持在4℃結(jié)晶過濾干燥得4.8克甲基蓮心堿高氯酸鹽；4.8克甲基蓮心堿高氯酸鹽溶解于70毫升的蒸餾水中，溶液中加入濃氨水調(diào)整ph9-10，用50毫升氯仿萃取3次得到游離甲基蓮心堿3.7克。f5部位減壓濃縮干燥得到3.1克淡黃色粉末，溶解于60毫升干燥丙酮，然后溶液中加入10％高氯酸調(diào)ph到2-3；酸性f5溶液保持在4℃結(jié)晶過濾干燥得3.7克異蓮心堿高氯酸鹽；3.7克異蓮心堿高氯酸鹽溶解于50毫升的蒸餾水中，溶液中加入濃氨水調(diào)整ph9-10，用40毫升氯仿萃取3次得到游離異蓮心堿2.5克。f7部位減壓濃縮干燥得到7.4克淡黃色粉末，溶解于150毫升干燥丙酮，然后溶液中加入10％高氯酸調(diào)ph到2-3；酸性f7溶液保持在4℃結(jié)晶過濾干燥得8.1克蓮心堿高氯酸鹽；8.1克蓮心堿高氯酸鹽溶解于100毫升的蒸餾水中，溶液中加入濃氨水調(diào)整ph9-10，用80毫升氯仿萃取3次干燥濃縮得到游離蓮心堿6.3克。

二、藥效學(xué)實驗

實驗一、測試蓮心堿，異蓮心堿，甲基蓮心堿對l6細(xì)胞glut4轉(zhuǎn)膜與葡萄糖攝取的影響

1.實驗試劑與材料

蓮心堿，異蓮心堿，甲基蓮心堿為從蓮子芯中分離所得，α-mem培養(yǎng)基、無糖mem培養(yǎng)基、胎牛血清(lifetechnologiescorporation)，胰蛋白酶(美國gibco公司)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96-孔板、6-孔板(nest公司)，2-nbdg葡萄糖試劑盒(cayman公司)，compoudc(sigma公司)，激光共聚焦顯微鏡(caerlzeissjena公司)，水浴鍋(北京醫(yī)療設(shè)備廠)，熒光酶標(biāo)儀(thermofisher公司)。

2.測試蓮心堿，異蓮心堿，甲基蓮心堿對l6細(xì)胞glut4轉(zhuǎn)膜活性的影響

研究表明，胰島素調(diào)節(jié)的氨肽酶(irap)和glut4共同存在于gsv囊泡內(nèi)，且具有高度的共定位現(xiàn)象，因此可以通過觀察irap的轉(zhuǎn)運能夠直接反應(yīng)glut4的運動(“directquantificationoffusionraterevealsadistalroleforas160ininsulin-stimulatedfusionofglut4storagevesicles”，jiangl.，fanj.，bail.，等，j.biol.chem.，2008年，283卷)。將用熒光標(biāo)記irap-morange且穩(wěn)定表達(dá)的l6細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，加入含10％胎牛血清的mem-α培養(yǎng)基，37℃、5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

實驗開始前，將穩(wěn)定表達(dá)irap-morange的l6細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到100％時，棄培養(yǎng)基，加入無血清培養(yǎng)基饑餓2小時，pbs洗三次。加入各測試物溶液(蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿三者均以10μm給藥，胰島素作為陽性對照藥物給藥濃度為100nm)，用激光掃描共聚焦顯微鏡來監(jiān)測加入藥物后irap-morange轉(zhuǎn)運的動態(tài)變化，觀察細(xì)胞內(nèi)熒光強度變化，以此來反應(yīng)glut4上膜情況。

3.測試蓮心堿，異蓮心堿，甲基蓮心堿對l6細(xì)胞葡萄糖攝取的影響

l6細(xì)胞接種于96孔板中，37℃、5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待其100％鋪滿孔底，換用無糖、無血清培養(yǎng)基饑餓2h。2-nbdg用無糖培養(yǎng)稀釋，使其終濃度為150μg/ml，將各組藥物溶解于含2-nbdg培養(yǎng)基中，配制成相應(yīng)濃度(蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿三者均以10μm給藥，胰島素作為陽性對照給藥濃度為100nm)備用。l6細(xì)胞饑餓完成后，將每孔中培養(yǎng)基吸出，換用含藥物培養(yǎng)基，每孔加入100μl配制好的給藥培養(yǎng)基，孵育過夜。隨后按照試劑盒說明方法，使用熒光酶標(biāo)儀測定各給藥組的熒光強度。

4.測試阻斷劑compoundc對蓮心堿，異蓮心堿，甲基蓮心堿促l6細(xì)胞葡萄糖攝取的影響

目前研究表明，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)glut4上膜的主要信號通路有兩條，一條是胰島素信號通路(insulinsignalpathway)；另一條是一磷酸腺苷酸活化蛋白激酶ampk(adenosine5'-monophosphate(amp)-activatedproteinkinase)信號通路(ampksignalpathway)。compoudc是ampk阻斷劑，能夠通過抑制ampk信號通路，抑制glut4轉(zhuǎn)膜，從而抑制細(xì)胞葡萄糖攝取。在本實驗中，為進(jìn)一步確定蓮心堿，異蓮心堿，甲基蓮心堿的促l6細(xì)胞葡萄糖吸收的分子機制，我們在加入待測藥物的同時加入compoudc(10nm)，按照上述測試葡萄糖攝取實驗步驟，測定加入compoundc前后l6細(xì)胞葡萄糖攝取量。通過對比來判斷蓮心堿，異蓮心堿，甲基蓮心堿的促l6細(xì)胞葡萄糖吸收的分子機制。

5.實驗結(jié)果

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(x±se)表示，組間顯著性差異檢驗用t檢驗及相關(guān)分析。

5.1蓮心堿，異蓮心堿，甲基蓮心堿對l6細(xì)胞glut4轉(zhuǎn)膜活性的影響

實驗結(jié)果如圖2所示，從圖中可以看出，加入胰島素后，熒光強度明顯增強。加入待測化合物后l6細(xì)胞熒光強度均有不同程度上升，其中以異蓮心堿熒光強度增強最為明顯，熒光強度是未給藥之前的2.3倍；蓮心堿和甲基蓮心堿給藥后也有所增強，熒光強度分別為給藥前的1.5倍和1.3倍。該結(jié)果表明，蓮心堿，異蓮心堿，甲基蓮心堿均具有促進(jìn)l6細(xì)胞glut4上膜的活性，其中以異蓮心堿活性最佳。

5.2蓮心堿，異蓮心堿，甲基蓮心堿對l6細(xì)胞葡萄糖攝取的影響

在測試蓮心堿，異蓮心堿，甲基蓮心堿促glut4上膜活性之后，我們測試了這三種化合物的促l6細(xì)胞葡萄糖攝取活性。實驗結(jié)果與促glut4實驗結(jié)果保持一致，見圖3，當(dāng)加入三種化合物孵育l6細(xì)胞之后，其葡萄糖攝取量明顯高于對照組，并存在顯著性差異。之后，我們又加入ampk阻斷劑來研究三種化合物的作用機制，結(jié)果表明，當(dāng)加入阻斷劑后，三種化合物的促l6細(xì)胞葡萄糖攝取活性完全被抑制，這就提示蓮心堿，異蓮心堿，甲基蓮心堿可能是通過ampk信號通路來促進(jìn)glut4上膜，從而促進(jìn)l6細(xì)胞的葡萄糖攝取。

實驗三、測試異蓮心堿(isolie)對糖尿病小鼠骨骼肌中g(shù)lut4，p-ampk蛋白表達(dá)的影響

1.材料與儀器

1.1實驗動物

kk-ay小鼠，spf級，8周齡，雄性；c57bl/6j小鼠，spf級，8周齡，雄性。均由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證編號:scxk(京)2009-0004。鼠料均經(jīng)滅菌，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，c57小鼠維持飼料，kk-ay小鼠喂kk鼠料(高脂飼料)，許可證編號:scxk(京)2009-0008。

本研究所選擇的kk-ay小鼠是一種多基因自發(fā)性遺傳動物模型，是在kk小鼠的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)入突變毛色基因(ay)而成，ay基因不僅影響小鼠的毛色而且可引起代謝紊亂，出現(xiàn)高血糖、高胰島素血癥、胰島素抵抗、肥胖、脂質(zhì)代謝紊亂等病理特征，是理想的自發(fā)性胰島素抵抗糖尿病動物模型和自發(fā)性遺傳肥胖動物模型。c57bl/6j與kk-ay小鼠具有基因同源性，作為正常對照組。

1.2藥品與試劑

異蓮心堿為從蓮子心中分離所得，并通過hplc與標(biāo)準(zhǔn)品對照，純度為99.5％。小鼠血清胰島素elisa試劑盒(華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)，葡萄糖(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，鹽酸二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司),ripa細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)有限公司)，pmsf(碧云天生物技術(shù)有限公司)，bca蛋白濃度試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)，glut4、p-ampk、ampk、β-actin、二抗等抗體(cellsignalingtechnology)。

2.實驗方法

2.1實驗?zāi)Ｐ偷慕?/p>

10只c57bl/6j小鼠作為正常對照組。55只kk-ay小鼠高脂飼料喂養(yǎng)一月，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高血糖，尾部取血測定小鼠的空腹血糖濃度，血糖濃度大于11.1mol/l為合格模型小鼠，可用于下一步實驗。按空腹血糖值隨機分為模型對照組、陽性對照組(鹽酸二甲雙胍200mg/kg)和異蓮心堿兩個劑量組(30mg/kg、60mg/kg)4組，每組10只。各組采用等體積不等濃度灌胃給藥(正常對照組和模型對照組給予等體積生理鹽水)，每日定時給藥一次，灌胃體積均為0.1ml/10g，連續(xù)灌胃四周。

2.2實驗數(shù)據(jù)采集

分別于給藥前、給藥后、給藥第7d、15d、21d和28d于尾靜脈取血測定小鼠血糖值。小鼠體重分別于給藥前、給藥后、給藥間隔每兩天測定一次。末次給藥后小鼠禁食12小時，測定小鼠血糖濃度作為0h的血糖值，以2.0g/kg灌胃葡萄糖，分別測定0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h的小鼠血糖含量，觀察各組小鼠血糖值的變化，比較各組之間是否存在差異。

血糖指標(biāo)測定結(jié)束后采用摘取眼球取血，以轉(zhuǎn)速3000rpm離心15min分離血清。使用全自動生化分析儀分別測定小鼠血清中tg、tc、hdlc、ldlc的含量；用elisa試劑盒測定血清胰島素含量。

2.3小鼠骨骼肌和肝臟中相關(guān)蛋白的westernblot分析

小鼠采血結(jié)束后，脫頸椎處理，解剖分離出骨骼肌和肝臟，凍存于-80℃冰箱中備用。

2.3.1細(xì)胞總蛋白的提取

將冷凍的骨骼肌和肝臟分別剪成碎塊，加入適量ripa蛋白裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonylfluoride，pmsf)，使其終濃度為1mmol/l。按照每20mg組織加入100-200μl裂解液，在冰上用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解；14000g×15min，吸取上清即可；用bca蛋白濃度試劑盒測定總蛋白濃度，確定每孔上樣量蛋白含量相等。

2.3.2免疫印跡檢測

取各組樣品50μg蛋白質(zhì)，進(jìn)行sds-page膠分離蛋白。并將蛋白電轉(zhuǎn)移至pvdf膜上。再用含0.5％脫脂奶粉的tbst封閉1h；按不同目的蛋白加入稀釋好的不同抗體4℃過夜；洗膜后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔igg(1∶5000稀釋)，室溫輕搖1h，充分洗滌后加入ecl顯色液，使用凝膠成像系統(tǒng)(aplegen，inc，usa)進(jìn)行成像分析。

3.實驗結(jié)果

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(x±se)表示，組間顯著性差異檢驗用t檢驗及相關(guān)分析。

3.1異蓮心堿對糖尿病小鼠骨骼肌中g(shù)lut4，p-ampk蛋白表達(dá)的影響

糖尿病小鼠體內(nèi)glut4的表達(dá)會較正常小鼠體內(nèi)含量低，為了驗證異蓮心堿對糖尿病小鼠骨骼肌中g(shù)lut4表達(dá)的影響，我們使用westernblot檢測總蛋白中g(shù)lut4的含量，實驗結(jié)果如圖4所示。糖尿病模型小鼠體內(nèi)glut4含量大大的減少，在二甲雙胍和異蓮心堿給藥四周后，小鼠體內(nèi)glut4表達(dá)均有所上升，其中二甲雙胍組glut4表達(dá)量上升最為明顯，異蓮心堿給藥組中，高劑量組比低劑量組glut4含量提高要更明顯。

同時，我們還檢測了調(diào)節(jié)glut4上膜的蛋白ampk的表達(dá)活性，實驗結(jié)果表明在給藥后，異蓮心堿組中ampk磷酸化含量明顯高于模型組，且存在劑量依耐關(guān)系。

3.2異蓮心堿對糖尿病小鼠肝臟中p-ampk蛋白表達(dá)的影響

肝臟中ampk的激活控制著許多重要生化反應(yīng)，與能量代謝密切相關(guān)，我們檢測了給藥四周后kk-ay小鼠肝臟中p-ampk的含量，結(jié)果如圖5所示。從圖中我們可以看出，在給藥四周之后，小鼠肝臟中異蓮心堿組的p-ampk含量明顯高于模型組，但是并沒有達(dá)到正常水平。該實驗結(jié)果表明異蓮心堿可以激活ampk代謝通路，從而提高肝臟脂質(zhì)代謝作用，達(dá)到改善糖尿病小鼠糖脂代謝紊亂效果。

實驗結(jié)論

通過以上實驗，我們可以得出以下結(jié)論：

體外實驗研究表明，蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿均具有良好的促l6細(xì)胞glut4上膜的活性，且異蓮心堿活性最強。但是這三種化合物的活性均能被ampk抑制劑compondc完全抑制，這就提示蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿可能是通過ampk信號通路來發(fā)揮其活性作用。

ampk是調(diào)控細(xì)胞和全身能量代謝的重要蛋白。作為細(xì)胞能量的調(diào)控者，ampk在糖脂代謝和調(diào)控代謝異常(如糖尿病，肥胖和癌癥)中都起著重要的作用，因此ampk是治療代謝疾病的重要靶標(biāo)。激活ampk通路可以增加脂肪酸氧化，抑制脂質(zhì)合成。研究顯示ampk調(diào)控著大量不同的代謝通路，它也是glut4的調(diào)控蛋白之一。在細(xì)胞實驗中，我們通過加入compoundc初步證明了異蓮心堿通過ampk通路來促進(jìn)glut4上膜活性。

體內(nèi)實驗中westernblot檢測骨骼肌和肝臟中相關(guān)蛋白進(jìn)一步驗證了異蓮心堿通過ampk信號通路來調(diào)節(jié)和改善二型糖尿病小鼠相關(guān)癥狀。在異蓮心堿給藥四周后，小鼠肝臟和肌肉中p-ampk表達(dá)較模型組小鼠明顯增加。這就表明異蓮心堿具有促進(jìn)ampk磷酸化的作用，從而激活ampk信號通路增加細(xì)胞葡萄糖攝取和降低小鼠血糖水平的功效。

以上所述實施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳的實施例，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。