本發(fā)明具體涉及新材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種殼聚糖包覆的熱還原納米銀多層膜長(zhǎng)效抗菌涂層的制備方法。

背景技術(shù)：

醫(yī)用生物材料的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，在提高醫(yī)療水平的同時(shí)，我們也不得不面對(duì)其帶來(lái)的一系列問(wèn)題，其中最迫切需要解決的就是生物材料感染的問(wèn)題?？梢詫⑸锊牧细腥镜倪^(guò)程簡(jiǎn)單描述為：微生物在生物材料表面吸附，隨后定植形成菌落，繼而形成致密的生物膜，釋放浮游菌體和毒素，最終導(dǎo)致感染的發(fā)生。自然界超過(guò)95%的細(xì)菌均能通過(guò)以上方式形成生物膜。在美國(guó)每年有超過(guò)十萬(wàn)人是死于生物材料相關(guān)的感染。因此在不破壞其性能的條件下，通過(guò)對(duì)生物醫(yī)療裝置表面進(jìn)行修飾，從而達(dá)到抗細(xì)菌粘附和生物膜形成已經(jīng)迫在眉睫?？梢詫⒛壳吧镝t(yī)療裝置表面修飾分為抗細(xì)菌粘附型和殺菌型。殺菌型雖然可以有效的殺死細(xì)菌，但也面臨著殘留細(xì)菌“尸體”可能會(huì)引發(fā)再次感染，故研發(fā)一種既可以有效殺菌也可以及時(shí)釋放細(xì)菌“尸體”的表面修飾方法十分重要。

層層自組裝技術(shù)具有簡(jiǎn)單、易于操作的特點(diǎn)，并且使膜層具有其組分的復(fù)合功能，有望得到兼具殺菌和及時(shí)釋放死細(xì)菌的性能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)的缺陷及不足。本發(fā)明提供了一種殼聚糖包覆的熱還原納米銀多層膜長(zhǎng)效抗菌涂層的制備方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)解決方案是：一種殼聚糖包覆的熱還原納米銀多層膜長(zhǎng)效抗菌涂層的制備方法，包括以下步驟：

（1）基材的表面預(yù)處理：將洗凈的基材置于5mg/ml的聚乙烯亞胺（PEI）水溶液中，浸泡，獲得表面胺基化的基材；

（2）制備殼聚糖-銀（CHI-Ag⁺）溶液；

（3）采用聚丙烯酸（PAA）和CHI-Ag⁺溶液，通過(guò)層層自組裝的涂層方法制備得到多層膜結(jié)構(gòu)；

（4）將制備得到的多層膜加熱0.5-2h,熱還原銀離子形成納米銀；

（5）在涂層表面均勻的涂抹上一層1-5mg/ml殼聚糖溶液，至此完成整個(gè)殼聚糖包覆的多層膜涂層的制備。

所述的基材為玻璃、石英、硅片、不銹鋼、聚酯膜、硅膠中的一種。

所述的步驟（2）中殼聚糖-銀（CHI-Ag⁺）溶液制備方法如下：配制硝酸銀溶解的殼聚糖溶液中磁力攪拌調(diào)節(jié)pH值，即得殼聚糖-銀（CHI-Ag⁺）溶液。

所述的步驟（3）中層層自組裝的涂層方法如下：將表面胺基化的基材放入0.5-5mg/ml的聚丙烯酸 水溶液中浸泡6-8分鐘，然后用相同pH值的洗液清洗2-3分鐘，用氮?dú)獯蹈?，放入含?.05-2.0mg/mL硝酸銀的1-5mg/ml 的殼聚糖-銀（CHI-Ag⁺）溶液中浸泡6-8min，用相同pH值的洗液清洗2-3分鐘，氮?dú)獯蹈桑链送瓿梢粋€(gè)雙層膜的制備，重復(fù)以上操作，直到完成整個(gè)多層膜涂層的制備。

所述的步驟（4）中熱還原的納米銀粒徑為5-50nm。

所述的步驟（1）中洗凈的基材置于5mg/ml的聚乙烯亞胺（PEI）水溶液中浸泡0.5-12小時(shí)。

所述的步驟（4）中多層膜加熱還原溫度為120-150℃。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種殼聚糖包覆的熱還原納米銀多層膜長(zhǎng)效抗菌涂層的制備方法，本發(fā)明涂層制備簡(jiǎn)單、易行，可采用浸涂、噴涂等可工業(yè)實(shí)現(xiàn)的方式，適用范圍廣，涂層具有高效和長(zhǎng)效的抗菌性能，能夠?qū)哂袕?fù)雜體型結(jié)構(gòu)的生物醫(yī)用裝置進(jìn)行涂層修飾；涂層可改善醫(yī)用裝置表面的生物相容性，具有降低細(xì)胞毒性；涂層材料化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，耐疲勞、剪切，能適應(yīng)人體的內(nèi)環(huán)境；涂層能夠?qū)崿F(xiàn)廣譜的多功能抗菌的能力。

具體實(shí)施方式

為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明。

基材表面預(yù)處理：

將各基材（玻璃、石英、硅片、不銹鋼、聚酯膜、硅膠等）經(jīng)刀片或玻璃刀裁剪成1×2 cm²大小，然后依次用前經(jīng)乙醇和超純水分別超聲2-3min清洗，N₂吹干。清洗過(guò)的基材將洗凈的基材置于將洗凈的基材置于1-5mg/ml的PEI水溶液中，浸泡1-12h，獲得表面胺基化的基材。下列實(shí)施例中所用的基材均為通過(guò)上述表面與處理過(guò)后的基材。

實(shí)施例1：

配制0.5mg/mL的PAA溶液，測(cè)定pH值為4.35。取50ml超純水于50ml離心管中，調(diào)節(jié)pH為4.38，標(biāo)為洗液1。

配制0.1mg/mL的硝酸銀溶解于50ml 的1 mg/ml的CHI中磁力攪拌，測(cè)定pH為3.97。取50ml超純水于50ml離心管中調(diào)節(jié)pH值為4.04，標(biāo)為洗液2。

將經(jīng)過(guò)預(yù)處理以后的基材加入PAA溶液中浸泡6-8min,取出，放入洗液1清洗2-3min，取出，用N₂吹干。再將其放入CHI-Ag⁺溶液中浸泡6-8min，取出，放入洗液2中清洗2-3min，取出，用N₂吹干,至此完成一個(gè)雙層的制備，制備10個(gè)雙層的多層膜涂層。

將制備得到的涂層在120℃下加熱0.5h后，裁剪大小為2x8cm并在表面均勻涂抹 1ml 5mg/ml CHI水溶液，在37℃烘箱中烘干。

靜態(tài)接觸角研究發(fā)現(xiàn)涂膜后親水性顯著增加，和單純的基材相比，由67.25±1.43°減到2±0.22°，透射電鏡下觀察膜層中納米銀的分布，發(fā)現(xiàn)納米銀均勻分布在4.0nm、9.8nm、15.6nm、23.1nm和23.6nm左右。通過(guò)抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑菌環(huán)分別為4.3mm、7.0mm、15.9mm、17.1mm和16.6mm，其抗菌效果明顯增加。測(cè)定對(duì)成纖維細(xì)胞和人晶狀體上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性較低，細(xì)胞存活率達(dá)到73%以上。

實(shí)施例 2：

配制1mg/mL的dopa溶液，測(cè)定pH值為4.36。取50ml超純水于50ml離心管中，調(diào)節(jié)pH為4.34，標(biāo)為洗液1。

配制0.5mg/mL的硝酸銀溶解于50ml 的2 mg/ml的CHI中磁力攪拌，測(cè)定pH為4.0。取50ml超純水于50ml離心管中調(diào)節(jié)pH值為4.20，標(biāo)為洗液2。

將經(jīng)過(guò)預(yù)處理以后的基材加入PAA溶液中浸泡6-8min,取出，放入洗液1清洗2-3min，取出，用N₂吹干。再將其放入CHI-Ag⁺溶液中浸泡6-8min，取出，放入洗液2中清洗2-3min，取出，用N₂吹干。至此完成一個(gè)雙層的制備。分別制備3、6、9、12、15雙層。

將制備得到的涂層在130℃下加熱1h后，裁剪大小為2x8cm并在表面均勻涂抹 2ml 5mg/ml CHI水溶液，在37℃烘箱中烘干。

利用抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)涂層的抗菌性能，結(jié)果測(cè)得五種涂層對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌環(huán)分別為3.3mm、9.8mm、19.9mm、20.6mm和23.4mm，并均能在15min內(nèi)殺滅99.99%的濃度為10⁶CFU/mL的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。五種涂層對(duì)成纖維細(xì)胞和人晶狀體上皮細(xì)胞毒性較低，細(xì)胞存活率超過(guò)79%，具有良好的生物相容性。

實(shí)施例 3：

配制2mg/mL的dopa溶液，測(cè)定pH值為3.96。取50ml超純水于50ml離心管中，調(diào)節(jié)pH為4.0，標(biāo)為洗液1。

配制1mg/mL的硝酸銀溶解于50ml 的2.5mg/ml的CHI中磁力攪拌，測(cè)定pH為4.96。取50ml超純水于50ml離心管中調(diào)節(jié)pH值為4.93，標(biāo)為洗液2。

將經(jīng)過(guò)預(yù)處理以后的基材加入PAA溶液中浸泡6-8min,取出，放入洗液1清洗2-3min，取出，用N₂吹干。再將其放入CHI-Ag⁺溶液中浸泡6-8min，取出，放入洗液2中清洗2-3min，取出，用N₂吹干。至此完成一個(gè)雙層的制備。分別制備3、6、9、12雙層。

將制備得到的涂層在140℃下加熱1h后，裁剪大小為2x8cm并在表面均勻涂抹 3ml 5mg/ml CHI水溶液，在37℃烘箱中烘干。

測(cè)得四種涂層對(duì)大腸桿菌的抑菌環(huán)分別為7.9mm、13.2mm、19.7mm和31.4mm，均能在10min內(nèi)殺滅99.99%的濃度為10⁸ CFU/mL的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。通過(guò)細(xì)菌死活染色觀察到在涂層表面，99.9%以上的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌被殺死（紅色），因此可以看出涂層具有高效的殺菌作用。四種涂層對(duì)成纖維細(xì)胞和人晶狀體上皮細(xì)胞毒性較低，細(xì)胞活性超過(guò)TCPS的78%，因此具有良好的細(xì)胞相容性。

實(shí)施例 4：

配配制3mg/mL的dopa溶液，測(cè)定pH值為3.87。取50ml超純水于50ml離心管中，調(diào)節(jié)pH為3.92，標(biāo)為洗液1。

配制2mg/mL的硝酸銀溶解于50ml 的3 mg/ml的CHI中磁力攪拌，測(cè)定pH為4.09。取50ml超純水于50ml離心管中調(diào)節(jié)pH值為4.12，標(biāo)為洗液2。

將經(jīng)過(guò)預(yù)處理以后的基材加入PAA溶液中浸泡6-8min,取出，放入洗液1清洗2-3min，取出，用N₂吹干。再將其放入CHI-Ag⁺溶液中浸泡6-8min，取出，放入洗液2中清洗2-3min，取出，用N₂吹干。至此完成一個(gè)雙層的制備。分別制備6、9、12、15雙層。

將制備得到的涂層在140℃下加熱1.5h后，裁剪大小為2x8cm并在表面均勻涂抹 3.5ml 5mg/ml CHI水溶液，在37℃烘箱中烘干。

利用透射電鏡觀察涂層中納米銀的分布，結(jié)果顯示納米銀分布較為均勻，分別分布在17.8nm、25.6nm、31.9nm、和45.7nm左右。測(cè)得四種涂層對(duì)大腸桿菌的抑菌環(huán)分別為18.7mm、29.5mm、40.6mm和45.2mm，均能在10min內(nèi)殺滅99.99%的濃度為10⁶CFU/mL的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。通過(guò)細(xì)菌死活染色觀察到在涂層表面，99.9%以上的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌被殺死（紅色），因此可以看出涂層具有高效的殺菌作用。四種涂層對(duì)成纖維細(xì)胞和人晶狀體上皮細(xì)胞毒性較低，細(xì)胞活性超過(guò)TCPS的83%，因此具有較好的細(xì)胞相容性。

實(shí)施例5

配制4mg/mL的dopa溶液，測(cè)定pH值為5.01。取50ml超純水于50ml離心管中，調(diào)節(jié)pH為5.12，標(biāo)為洗液1。

配制2mg/mL的硝酸銀溶解于50ml 的3 mg/ml的PEI中磁力攪拌，測(cè)定pH為4.01。取50ml超純水于50ml離心管中調(diào)節(jié)pH值為4.21，標(biāo)為洗液2。

將經(jīng)過(guò)預(yù)處理以后的基材加入PAA溶液中浸泡6-8min,取出，放入洗液1清洗2-3min，取出，用N₂吹干。再將其放入CHI-Ag⁺溶液中浸泡6-8min，取出，放入洗液2中清洗2-3min，取出，用N₂吹干。至此完成一個(gè)雙層的制備。分別制備6、9、12雙層。

將制備得到的涂層在150℃下加熱1.5h后，裁剪大小為2x8cm并在表面均勻涂抹 3.5ml 5mg/ml CHI水溶液，在37℃烘箱中烘干。

利用透射電鏡觀察涂層中納米銀的分布，結(jié)果顯示納米銀分布較為均勻，分別分布在13.4nm、20.6nm和30.5nm左右。測(cè)得三種涂層對(duì)大腸桿菌的抑菌環(huán)分別為14.7mm、29.3mm和35.7mm，均能在10min內(nèi)殺滅99.9%的濃度為10⁷ CFU/mL的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。通過(guò)細(xì)菌死活染色觀察到在涂層表面，99.9%以上的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌被殺死（紅色），因此可以看出涂層具有高效的殺菌作用。三種涂層對(duì)成纖維細(xì)胞和人晶狀體上皮細(xì)胞毒性較低，細(xì)胞活性超過(guò)TCPS的89%，因此具有較好的細(xì)胞相容性。

實(shí)施例6

配制5mg/mL的dopa溶液，測(cè)定pH值為4.45。取50ml超純水于50ml離心管中，調(diào)節(jié)pH為4.64，標(biāo)為洗液1。

配制3mg/mL的硝酸銀溶解于50ml 的4mg/ml的CHI中磁力攪拌，測(cè)定pH為5.27。取50ml超純水于50ml離心管中調(diào)節(jié)pH值為5.18，標(biāo)為洗液2。

將經(jīng)過(guò)預(yù)處理以后的基材加入PAA溶液中浸泡6-8min,取出，放入洗液1清洗2-3min，取出，用N₂吹干。再將其放入CHI-Ag⁺溶液中浸泡6-8min，取出，放入洗液2中清洗2-3min，取出，用N₂吹干。至此完成一個(gè)雙層的制備。分別制備6、9、12雙層。

將制備得到的涂層在150℃下加熱2h后，裁剪大小為2x8cm并在表面均勻涂抹 5ml 5mg/ml CHI水溶液，在37℃烘箱中烘干。

靜態(tài)接觸角研究發(fā)現(xiàn)涂膜后親水性顯著增加，和單純的基材相比，由78.35±1.83°減到2±1.62°。利用透射電鏡觀察涂層中納米銀的分布，結(jié)果顯示納米銀分布較為均勻，分別分布在12.1nm、18.7nm和26.4nm左右。測(cè)得三種涂層對(duì)大腸桿菌的抑菌環(huán)分別為19.8mm、28.7mm和39.4mm，均能在10min內(nèi)殺滅99.99%的濃度為10⁷ CFU/mL的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。三種涂層對(duì)成纖維細(xì)胞和人晶狀體上皮細(xì)胞毒性較低，細(xì)胞活性超過(guò)TCPS的95%，因此具有較好的細(xì)胞相容性。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅局限于上述實(shí)施例，凡屬于本發(fā)明思路下的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理前提下的若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅局限于上述實(shí)施例，凡屬于本發(fā)明思路下的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理前提下的若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。