技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的姜黃素透明質(zhì)酸納米膠束及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鞯穆匀碜陨砻庖咝约膊?，主要臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫痛，繼而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)僵直、畸形和功能障礙。世界上大約有1%的人患有這種疾病，每年有超過(guò)3000000的新病例被診斷。類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病因，目前仍不清楚，可能與細(xì)胞因子（IL-1、TNF-α、IL-6、IL-8）、細(xì)胞粘附分子、基質(zhì)金屬蛋白酶等有關(guān)。類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療主要集中在減輕關(guān)節(jié)疼痛和腫脹，減少骨畸形，恢復(fù)關(guān)節(jié)的正常生理功能。目前類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎主要通過(guò)非特異性緩解對(duì)癥療法進(jìn)行治療，包括持續(xù)使用非甾體類(lèi)抗炎藥（NSAIDs），糖皮質(zhì)激素，對(duì)癥治療的抗風(fēng)濕藥（DMARDs）和生物反應(yīng)修飾劑。盡管治療方法越來(lái)越多，但多數(shù)患者只有部分癥狀緩解，治療效果并不充分。而且，長(zhǎng)期應(yīng)用非甾體類(lèi)抗炎藥物、類(lèi)固醇甾體類(lèi)藥物會(huì)產(chǎn)生多種不良反應(yīng)及副作用，包括胃腸道損害，肝損傷、感染和心力衰竭等。此外，有研究應(yīng)用如腫瘤壞死因子（TNF-α）阻斷劑（英夫利昔單抗和阿達(dá)木單抗，依那西普）、IL-1（anakinra）和IL-6（tocilizumab）抑制劑治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，但昂貴的價(jià)格限制了它們的應(yīng)用。因此，有必要找到一種有效、低成本、安全的抗類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物。

姜黃素是從姜科類(lèi)植物的根中提取的一種多酚類(lèi)物質(zhì)，具有抗炎、抗菌及抗腫瘤等諸多特效，然而其在水中的溶解性低且具有光不穩(wěn)定性，降低了其生物利用率，影響了其臨床使用效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物治療效果不佳，易引起不良反應(yīng)及副作用的缺陷，提供了一種低成本、高效率、人性化的用于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的姜黃素透明質(zhì)酸納米膠束及其制備方法和應(yīng)用，該藥物具有良好的生物相容性及無(wú)體內(nèi)毒性，能夠較快的促進(jìn)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的愈合，同時(shí)能夠?qū)﹃P(guān)節(jié)起到潤(rùn)滑、保護(hù)的作用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：一種用于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的姜黃素透明質(zhì)酸納米膠束，是將姜黃素和透明質(zhì)酸溶液通過(guò)酯化反應(yīng)形成復(fù)合物，在水溶液中通過(guò)親疏水作用力自組裝形成納米膠束。

進(jìn)一步的，上述的一種用于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的姜黃素透明質(zhì)酸納米膠束，所述姜黃素透明質(zhì)酸納米膠束中，姜黃素與透明質(zhì)酸溶液的重量比為（0.18-0.72）:1。

進(jìn)一步的，上述的一種用于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的姜黃素透明質(zhì)酸納米膠束，是將4-二甲基氨基吡啶DMAP作為催化劑，二環(huán)己基碳二亞胺作為脫水劑，促使姜黃素和透明質(zhì)酸發(fā)生酯化反應(yīng)將姜黃素接枝到透明質(zhì)酸的表面，反應(yīng)時(shí)間為24小時(shí)到48小時(shí)。

進(jìn)一步的，上述的一種用于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的姜黃素透明質(zhì)酸納米膠束，所述4-二甲基氨基吡啶DMAP的用量為：4-二甲基氨基吡啶DMAP與姜黃素的摩爾比為（1-8）:1；所述二環(huán)己基碳二亞胺的用量為：二環(huán)己基碳二亞胺與4-二甲基氨基吡啶DMAP的質(zhì)量比為1:2。

進(jìn)一步的，上述的一種用于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的姜黃素透明質(zhì)酸納米膠束，所述透明質(zhì)酸溶液的溶劑為強(qiáng)極性溶劑甲酰胺、丙酮、二甲基甲酰胺或二甲基亞砜，溶解溫度為30-60℃，時(shí)間為24 h到48 h，透明質(zhì)酸溶液的終濃度為1-3mg/mL。

進(jìn)一步的，上述的一種用于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的姜黃素透明質(zhì)酸納米膠束，所述姜黃素透明質(zhì)酸納米膠束為淡黃色透明溶液，粒徑分布為141-220 nm，Zeta電位為-15～-30mV，包封率為90-95%，藥物釋放量為65-85%。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供了上述一種用于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的姜黃素透明質(zhì)酸納米膠束的制備方法，包括以下步驟：

1）將透明質(zhì)酸溶解于除水的強(qiáng)極性溶劑甲酰胺、丙酮、二甲基甲酰胺或二甲基亞砜溶液中，配成1-3mg/mL的透明質(zhì)酸溶液，然后加入10-25 mL二甲基亞砜溶液，在磁力攪拌下充分溶解，30-60℃恒溫水浴24-48 h；

2）將步驟1）得到的透明質(zhì)酸溶液在氮?dú)庀录兓?0分鐘，以去除溶液中氧氣；

3）將4-二甲基氨基吡啶DMAP和二環(huán)己基碳二亞胺，分別加入步驟2）得到的透明質(zhì)酸溶液中充分溶解；4-二甲基氨基吡啶DMAP的用量為：4-二甲基氨基吡啶DMAP與姜黃素的摩爾比為（1-8）:1；二環(huán)己基碳二亞胺的用量為：二環(huán)己基碳二亞胺與4-二甲基氨基吡啶DMAP的質(zhì)量比為1:2；

4）將18-72 mg姜黃素溶解于10 mL 二甲基亞砜溶液中，制備姜黃素溶液；

5）將步驟4）制備得到的姜黃素溶液在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，逐滴加入步驟3）得到的透明質(zhì)酸溶液中，攪拌24 h，得到含有接枝姜黃素的透明質(zhì)酸溶液；

6）應(yīng)用透析膜對(duì)步驟5）得到的含有接枝姜黃素的透明質(zhì)酸溶液進(jìn)行水透析，每天更換水溶液，并實(shí)時(shí)觀察溶液顏色的變化，當(dāng)溶液顏色由紅色（二甲基亞砜、甲酰胺為堿性溶劑,引起姜黃素顏色變?yōu)榧t色）變?yōu)榈S色（中性）時(shí)，表明未反應(yīng)的化合物和有機(jī)試劑完全去除；

7）將步驟6）制備出的姜黃素透明質(zhì)酸納米膠束溶液進(jìn)行冷凍干燥，得到姜黃素透明質(zhì)酸納米膠束粉末。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供了上述一種用于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的姜黃素透明質(zhì)酸納米膠束在制備用于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，上述的應(yīng)用，所述姜黃素透明質(zhì)酸納米膠束的有效濃度為21μg-336μg/mL，療程為2周。

1. 制備透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束的具體方案為：

（1）將一定量的透明質(zhì)酸溶解于除水的甲酰胺溶液中，配成1-3mg/mL的透明質(zhì)酸，然后加入10-25 mLDMSO溶液，在磁力攪拌下充分溶解，30-60℃恒溫水浴24-48 h。

（2）將得到的溶液在氮?dú)庀录兓?0分鐘，以去除溶液中氧氣。

（3）將一定量的4-二甲基氨基吡啶(DMAP)（DMAP/姜黃素摩爾比為1-8:1）和二環(huán)己基碳二亞胺（二環(huán)己基碳二亞胺與DMAP的質(zhì)量比為1:2），分別加入上述溶液中充分溶解。

（4）將18-72 mg姜黃素溶解于10 mL DMSO中，制備姜黃素溶液。

（5）將制備成的姜黃素溶液在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，逐滴加入上述溶液中，攪拌24 h，得到含有接枝姜黃素的透明質(zhì)酸溶液。

（6）應(yīng)用透析膜對(duì)上述（5）中得到的溶液進(jìn)行水透析，每天更換水溶液直到未反應(yīng)的化合物和有機(jī)試劑完全去除。

（7）制備出透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束溶液進(jìn)行冷凍干燥，得到納米膠束粉末。

2. 姜黃素透明質(zhì)酸納米膠束用于細(xì)胞毒性測(cè)試的具體方案：

（1）受試對(duì)象：

用酶消化法分離獲得的牛關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。

（2）試驗(yàn)方法：

將獲得的牛軟骨細(xì)胞接種于含DMEM/F-12添加10%胎牛血清進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。將培養(yǎng)的細(xì)胞稀釋成濃度為5×10³個(gè)/毫升，將100μL加入到96孔板，培養(yǎng)24 h。取100μL 的濃度分別為21μg/mL、42μg/mL、84μg/mL、168μg/mL、336μg/mL的透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束加入到96孔板，對(duì)照組只加培養(yǎng)液。分別培養(yǎng)24h、48h、72h后，將20μL MTT溶液加入到96孔板的孔內(nèi)，再培養(yǎng)4 h，丟棄上層溶液，加入20μL DMSO溶解。用酶標(biāo)儀記錄該溶液的吸光度。進(jìn)行三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，將數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3. 姜黃素透明質(zhì)酸納米膠束用于以下藥效學(xué)試驗(yàn)的具體方案：

（1）受試對(duì)象：

雌性近交系Wistar大鼠，6至8周齡，體重150至180g，購(gòu)于蘭州大學(xué)生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。應(yīng)用完全弗氏佐劑和Ⅱ型膠原誘導(dǎo)建立類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠動(dòng)物模型。

（2）試驗(yàn)方法：

將Wistar大鼠分組為正常對(duì)照組(8只)，將建立的的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠按治療方式分為姜黃素組(8只)、透明質(zhì)酸組(8只)、透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束組(8只)、生理鹽水組(8只)，其中姜黃素組、透明質(zhì)酸組、透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束組藥物濃度均為21-336μg/mL，治療兩周。

針對(duì)姜黃素生物利用率低的問(wèn)題，本發(fā)明采用納米膠束技術(shù)，利用納米膠束小的粒徑及高的載藥量的特性，以改善姜黃素存在的生物利用率低的問(wèn)題。本發(fā)明選用細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分—透明質(zhì)酸，作為姜黃素的藥物載體，構(gòu)建新型的抗類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的納米膠束。透明質(zhì)酸具有非常好的親水性和溶解率，作為藥物載體可以提高姜黃素的溶解率。除此之外，研究證實(shí)透明質(zhì)酸具有很好的潤(rùn)滑特性，能有效緩解由于軟骨破壞引起的摩擦力升高而造成的軟骨磨損問(wèn)題。

本發(fā)明開(kāi)發(fā)的治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的納米膠束，利用親疏水性自組裝成納米膠束，其制備方法簡(jiǎn)單，無(wú)需特殊設(shè)備，成本低。該膠束具有很好的生物相容性，且能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，對(duì)損傷軟骨具有一定的修復(fù)作用。該膠束對(duì)于類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療不同于傳統(tǒng)的抗炎方法，不僅具有抗炎作用，對(duì)關(guān)節(jié)還具有一定的潤(rùn)滑保護(hù)作用，因此該藥克服了傳統(tǒng)類(lèi)風(fēng)濕治療藥物存在的不足。

本發(fā)明提供的一種用于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的姜黃素透明質(zhì)酸納米膠束及其制備方法和應(yīng)用，其有益效果如下：

1、本發(fā)明應(yīng)用酯化反應(yīng)將透明質(zhì)酸和姜黃素進(jìn)行交聯(lián)，在水溶液中自組裝形成透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束，解決了姜黃素在水溶液中溶解度低，光不穩(wěn)定的問(wèn)題，提高了姜黃素的生物利用率；

2、本發(fā)明制備的納米膠束用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠動(dòng)物模型，給藥1周后即有治療效果，經(jīng)過(guò)2周的治療，便有效的降低了關(guān)節(jié)腫脹，緩解了關(guān)節(jié)功能障礙，治療周期短，采用本發(fā)明含有姜黃素的化合物用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎無(wú)毒副作用；

3、本發(fā)明的納米膠束中含有透明質(zhì)酸，是一種高分子粘多糖，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，性質(zhì)穩(wěn)定，具有潤(rùn)滑、抗摩擦及緩沖吸震的良好的作用，其潤(rùn)滑作用能減小關(guān)節(jié)間的摩擦，從而減輕類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)的骨質(zhì)破壞，亦可調(diào)節(jié)血管壁的通透性，減輕關(guān)節(jié)水腫，具有治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用；

4、本發(fā)明的納米膠束中含有姜黃素，具有良好的抗炎，抗水腫作用，并通過(guò)調(diào)節(jié)降低血清中TNF-α、IL-1和VEGF的表達(dá)，降低與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病進(jìn)展有關(guān)的激活核因子B(NF-κB)的基因轉(zhuǎn)錄活性，抑制前列腺素E2 (PGE2)、COX-2和MMP的表達(dá)，從而抑制炎癥反應(yīng)，減輕組織水腫，具有治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用；

5、本發(fā)明中的姜黃素和透明質(zhì)酸成分對(duì)于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有協(xié)同治療作用，能夠同時(shí)起到抗炎消腫和關(guān)節(jié)潤(rùn)滑保護(hù)的雙重作用。

附圖說(shuō)明

圖1為透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束制備的化學(xué)反應(yīng)方程式。

圖2為透明質(zhì)酸（HA)、姜黃素（Cur）、透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束（HA/Cur）的紅外光譜（圖2a)及透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束（HA/Cur)的紫外-可見(jiàn)吸收光譜（圖2b）。

圖3為透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束（HA/Cur）的透射電鏡照片（圖3a、圖3b)，圖3b插圖為局部放大的透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束（HA/Cur），圖3c為透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束（HA/Cur）水溶液粒徑和粒徑分布的動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量圖，圖3d為通過(guò)透射電鏡測(cè)量的透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束（HA/Cur）的粒徑分布圖。

圖4為透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束的MTT測(cè)試。

圖5為大鼠踝關(guān)節(jié)能譜CT平掃VR重建。a為正常對(duì)照組，b為類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型組，c為透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束組，d為透明質(zhì)酸組，e為姜黃素組，f為生理鹽水組。

圖6為應(yīng)用不同濃度的透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束（HA/Cur）治療前后，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠動(dòng)物模型大鼠踝關(guān)節(jié)的腫脹率。

圖7為藥物治療前和治療后姜黃素組（Cur）、透明質(zhì)酸組（HA)、透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束組（HA/Cur）和生理鹽水組（Normal Saline)大鼠踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)腫脹率圖表。

圖8為大鼠踝關(guān)節(jié)能譜CT平掃M(jìn)PR重建圖。a正常對(duì)照組，b類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型組，c透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束組，d姜黃素組，e透明質(zhì)酸組，f生理鹽水組。

圖9為大鼠踝關(guān)節(jié)病理圖片 (H&E×40)。a正常對(duì)照組，b類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型組，c透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束組，d姜黃素組，e透明質(zhì)酸組，f生理鹽水組。

圖10a為正常組（Normal）、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型組（RA）和透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束組(HA/Cur)的大鼠血清中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶（ALP）的活性(U/L)。圖10b，10c，10d為大鼠血清中TNF-α，IL-1，VEGF的測(cè)量值。

圖11a為四種摩擦介質(zhì)（透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束（HA/Cur）、透明質(zhì)酸（HA)、生理鹽水（Normal Saline)和姜黃素（Cur））的摩擦曲線和相應(yīng)的平均摩擦系數(shù)（圖11b)。

圖12為不同摩擦介質(zhì)下，摩擦表面磨痕的電鏡圖片（a）摩擦介質(zhì)為生理鹽水，（b）為透明質(zhì)酸，（c）為姜黃素，（d）透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：制備透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束：

（1）將100mg透明質(zhì)酸溶解于50mL甲酰胺溶液，然后加入25 mLDMSO溶液，在磁力攪拌下充分溶解，60℃恒溫水浴24 h。

（2）將得到的溶液在氮?dú)庀录兓?0分鐘，以去除溶液中氧氣。

（3）將203mg4-二甲基氨基吡啶(DMAP)和101.5 mg二環(huán)己基碳二亞胺，分別加入上述溶液中充分溶解。

（4）將72 mg姜黃素溶解于10 mL DMSO中，制備姜黃素溶液。

（5）將制備成的姜黃素溶液在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，逐滴加入上述溶液中，攪拌24 h，得到含有接枝姜黃素的透明質(zhì)酸溶液。

（6）應(yīng)用透析膜對(duì)上述（5）中得到的溶液進(jìn)行水透析，每天更換水溶液直到未反應(yīng)的化合物和有機(jī)試劑完全去除。

（7）制備出透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束溶液進(jìn)行冷凍干燥，得到納米膠束粉末。

實(shí)施例2：制備透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束：

（1）將100 mg透明質(zhì)酸溶解于50 mL甲酰胺溶液，然后加入25mL DMSO溶液，在磁力攪拌下充分溶解，60℃恒溫水浴24 h。

（2）將得到的溶液在氮?dú)庀录兓?0分鐘，以去除溶液中氧氣。

（3）將101.5mg4-二甲基氨基吡啶(DMAP)和50.75mg二環(huán)己基碳二亞胺，分別加入上述溶液中充分溶解。

（4）將36 mg姜黃素溶解于5 mL DMSO中，制備姜黃素溶液。

（5）將制備成的姜黃素溶液在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，逐滴加入上述溶液中，攪拌24 h，得到含有接枝姜黃素的透明質(zhì)酸溶液。

（6）應(yīng)用透析膜對(duì)上述（5）中得到的溶液進(jìn)行水透析，每天更換水溶液直到未反應(yīng)的化合物和有機(jī)試劑完全去除。

（7）制備出透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束溶液進(jìn)行冷凍干燥，得到納米膠束粉末。

實(shí)施例3：制備透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束：

（1）將100mg透明質(zhì)酸溶解于50 mL甲酰胺溶液，然后加入25 mLDMSO溶液，在磁力攪拌下充分溶解，60℃恒溫水浴24 h。

（2）將得到的溶液在氮?dú)庀录兓?0分鐘，以去除溶液中氧氣。

（3）將50.75mg4-二甲基氨基吡啶(DMAP)和25.38mg二環(huán)己基碳二亞胺，分別加入上述溶液中充分溶解。

（4）將18 mg姜黃素溶解于2.5 mL DMSO中，制備姜黃素溶液。

（5）將制備成的姜黃素溶液在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，逐滴加入上述溶液中，攪拌24 h，得到含有接枝姜黃素的透明質(zhì)酸溶液。

（6）應(yīng)用透析膜對(duì)上述（5）中得到的溶液進(jìn)行水透析，每天更換水溶液直到未反應(yīng)的化合物和有機(jī)試劑完全去除。

（7）制備出透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束溶液進(jìn)行冷凍干燥，得到納米膠束粉末。

實(shí)施例4：制備透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束：

（1）將100 mg透明質(zhì)酸溶解于100 mL甲酰胺溶液，然后加入25 mL DMSO溶液，在磁力攪拌下充分溶解，60℃恒溫水浴24 h。

（2）將得到的溶液在氮?dú)庀录兓?0分鐘，以去除溶液中氧氣。

（3）將203 mg 4-二甲基氨基吡啶(DMAP)和101.5 mg二環(huán)己基碳二亞胺，分別加入上述溶液中充分溶解。

（4）將72 mg姜黃素溶解于10 mL DMSO中，制備姜黃素溶液。

（5）將制備成的姜黃素溶液在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，逐滴加入上述溶液中，攪拌24 h，得到含有接枝姜黃素的透明質(zhì)酸溶液。

實(shí)施例5：制備透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束：

（1）將100 mg透明質(zhì)酸溶解于30 mL甲酰胺溶液，然后加入25 mL DMSO溶液，在磁力攪拌下充分溶解，60℃恒溫水浴24 h。

（2）將得到的溶液在氮?dú)庀录兓?0分鐘，以去除溶液中氧氣。

（3）將203 mg 4-二甲基氨基吡啶(DMAP)和101.5 mg二環(huán)己基碳二亞胺，分別加入上述溶液中充分溶解。

（4）將72 mg姜黃素溶解于10 mL DMSO中，制備姜黃素溶液。

（5）將制備成的姜黃素溶液在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，逐滴加入上述溶液中，攪拌24 h，得到含有接枝姜黃素的透明質(zhì)酸溶液。

結(jié)果：

1.由圖1可明確透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束化學(xué)反應(yīng)方程式。姜黃素上的羥基在反應(yīng)條件下與透明質(zhì)酸上的羧基可形成酯鍵。

2.圖2為透明質(zhì)酸（HA)、姜黃素（Cur）、透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束（HA/Cur）的紅外光譜。透明質(zhì)酸在1412 cm^-1的羧基峰消失，在1735 cm^-1處出現(xiàn)一個(gè)新的酯鍵的峰（圖2a)。透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束（HA/Cur)的紫外-可見(jiàn)吸收光譜，同姜黃素的吸收峰相比，復(fù)合物的峰發(fā)生了明顯的藍(lán)移。由圖2可知成功合成了透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束。

3.圖3為透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束（HA/Cur）的透射電鏡照片（圖3a、圖3b)，圖3b插圖為局部放大的透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束（HA/Cur）。圖3c為透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束（HA/Cur）水溶液粒徑和粒徑分布的動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量圖，圖3d為通過(guò)透射電鏡測(cè)量的透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束（HA/Cur）的粒徑分布圖。表明合成的復(fù)合物為納米膠束，其粒徑為164 nm。

實(shí)施例6：

本實(shí)施方式將姜黃素透明質(zhì)酸納米膠束用于細(xì)胞毒性測(cè)試：

（1）受試對(duì)象：

用酶消化法分離獲得的牛關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。

（2）試驗(yàn)方法：

將獲得的牛軟骨細(xì)胞接種于含DMEM/F-12添加10%胎牛血清進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。將培養(yǎng)的細(xì)胞稀釋成濃度為5×10³個(gè)/毫升，將100μL加入到96孔板，培養(yǎng)24 h。取100μL的濃度分別為21μg/mL、42μg/mL、84μg/mL、168μg/mL、336μg/mL的透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束加入到96孔板，對(duì)照組只加培養(yǎng)液。分別培養(yǎng)24h、48h、72h后，將20μL MTT溶液加入到96孔板的孔內(nèi)，再培養(yǎng)4 h，丟棄上層溶液，加入20μL DMSO溶解。用酶標(biāo)儀記錄該溶液的吸光度。進(jìn)行三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，將數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié)果：

由圖4可知，21μg/mL、42μg/mL、84μg/mL、168μg/mL、336μg/mL的透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束在第24h、48h、72h均可促進(jìn)牛軟骨細(xì)胞增殖生長(zhǎng)，表明透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束對(duì)牛軟骨細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性且具有一定的軟骨修復(fù)功能。

實(shí)施例7：

本實(shí)施方式將姜黃素透明質(zhì)酸納米膠束用于以下藥效學(xué)試驗(yàn)：

（1）受試對(duì)象：

雌性近交系Wistar大鼠，6至8周齡，體重150至180g，購(gòu)于蘭州大學(xué)生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。應(yīng)用完全弗氏佐劑和Ⅱ型膠原誘導(dǎo)建立類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠動(dòng)物模型。

（2）試驗(yàn)方法：

將Wistar大鼠分組為正常對(duì)照組(8只)，將建立的的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠按治療方式分為姜黃素組(8只)、透明質(zhì)酸組(8只)、透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束組(8只)、生理鹽水組組(8只)，其中姜黃素組、透明質(zhì)酸組、透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束組藥物濃度均為336μg/mL，治療兩周。

實(shí)施例8：

本實(shí)施方式將姜黃素透明質(zhì)酸納米膠束用于以下藥效學(xué)試驗(yàn)：

（1）受試對(duì)象：

雌性近交系Wistar大鼠，6至8周齡，體重150至180 g，購(gòu)于蘭州大學(xué)生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。應(yīng)用完全弗氏佐劑和Ⅱ型膠原誘導(dǎo)建立類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠動(dòng)物模型。

（2）試驗(yàn)方法：

將Wistar大鼠分組為正常對(duì)照組(8只)，將建立的的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠按治療方式分為姜黃素組(8只)、透明質(zhì)酸組(8只)、透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束組(8只)、生理鹽水組組(8只)，其中姜黃素組、透明質(zhì)酸組、透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束組藥物濃度均為64μg/mL，治療兩周。

結(jié)果：

1.透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束具有抗水腫作用：

由圖5可知透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束治療兩周后，大鼠關(guān)節(jié)腫脹明顯減輕，與正常對(duì)照組相似。

由圖6、圖7可知透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束治療兩周后，大鼠關(guān)節(jié)腫脹率減小，約為30%。表明透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束具有較好的抗水腫作用。

由圖8可知透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束治療兩周后，大鼠關(guān)節(jié)腫脹減輕，關(guān)節(jié)間隙變小，表明透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束具有較好的抗水腫作用。

2.透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束有抗炎癥的作用：

由圖9可知a正常對(duì)照組，顯示滑膜組織無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)纖維組織增生，關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，骨纖維整齊排列，關(guān)節(jié)間隙正常；b類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型組，可見(jiàn)滑膜組織大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，字母“S”下方為典型的血管翳，軟骨及骨破壞程度較重（箭頭）；c透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束組，滑膜組織少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)纖維組織增生，關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，關(guān)節(jié)間隙與正常組相似；關(guān)節(jié)囊無(wú)明顯腫脹，關(guān)節(jié)面略模糊；d姜黃素組、e透明質(zhì)酸組、f生理鹽水組，病理表現(xiàn)類(lèi)似，可見(jiàn)滑膜組織中淋巴細(xì)胞嚴(yán)重浸潤(rùn)，關(guān)節(jié)明顯腫脹，關(guān)節(jié)間隙增寬，關(guān)節(jié)表面毛糙，軟骨及骨破壞程度較重。病理切片表明，經(jīng)過(guò)透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束治療兩周后，大鼠踝關(guān)節(jié)中性粒細(xì)胞及炎性浸潤(rùn)細(xì)胞明顯減少，表明透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束有抗炎作用。

3. 透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束可降低血清中TNF-α、IL-1、VEGF含量。

由圖10可知，相比于姜黃素組、透明質(zhì)酸組、生理鹽水組，透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束組血清中TNF-α、IL-1和VEGF含量明顯降低。通過(guò)調(diào)節(jié)降低血清中TNF-α、IL-1和VEGF的表達(dá)，降低與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病進(jìn)展有關(guān)的激活核因子B(NF-κB)的基因轉(zhuǎn)錄活性，抑制前列腺素E2 (PGE2)、COX-2和MMP的表達(dá)，從而抑制炎癥反應(yīng)，減輕組織水腫，表明透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束具有治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用。

4. 透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束具有減小關(guān)節(jié)摩擦的作用。

由圖11、12的結(jié)果可知，透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束有較低的摩擦系數(shù)，在關(guān)節(jié)界面間有很好的潤(rùn)滑作用。同其它組相比，透明質(zhì)酸姜黃素納米膠束產(chǎn)生細(xì)小的磨痕及細(xì)小的顆粒狀的磨屑。

最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。