本發(fā)明涉及茯苓酸a的新應(yīng)用，具體涉及茯苓酸a用于治療慢性腎臟病藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
慢性腎臟病是影響人類健康的重大疾病之一。隨著高血壓和糖尿病患病率的增加，慢性腎臟病的發(fā)生率在持續(xù)上升。
慢性腎臟病(ckd)是指各種原因引起的慢性腎臟結(jié)構(gòu)和功能障礙(腎臟損害病史大于3個月)，包括腎腎小球?yàn)V過率正常和不正常的病理損傷、血液或尿液成分異常，及影像學(xué)檢查異常，或不明原因腎小球?yàn)V過率下降(<60ml/min·1.73m2)超過3個月。國際腎臟病協(xié)會統(tǒng)計結(jié)果顯示慢性腎臟病4期階段的慢性腎衰竭在自然人群中的年發(fā)病率為98-198/100萬，經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的日本和美國的發(fā)病率分別達(dá)996/100萬和802/100萬。
目前對于慢性腎臟病的治療常用內(nèi)科療法、透析療法、腎臟移植等。雖然這些療法可以改善臨床癥狀，減輕臨床患者的痛苦，但內(nèi)科療法尚難以徹底阻斷病理進(jìn)展，且副作用大；透析只能解決腎臟的部分代謝問題，尚不能較好改善腎臟的內(nèi)分泌功能；腎移植的腎源有限，且免疫排斥現(xiàn)象一時還難以解決。加之透析療法和腎臟移植費(fèi)用昂貴，使眾多患者望而卻步。
隨著各種疾病發(fā)病率的上升，藥物的使用越來越多，因藥物引起的腎損傷發(fā)生率逐漸上升。研究顯示藥物導(dǎo)致腎損傷的發(fā)生率高達(dá)18.3％，目前臨床常見的對腎損傷的藥物有抗感染類、免疫制劑、抗腫瘤藥物、甾體類抗炎藥等，其中抗生素腎損傷占藥物導(dǎo)致的腎損傷的36％。藥物性腎損傷位居與腎臟有關(guān)的疾病的首位，特別是引起醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。藥物性腎損傷也是新藥開發(fā)過程中的常見問題，它是導(dǎo)致藥物撤市的重要原因之一，消耗了大量的人力和財力。因此，如何有效防治慢性腎臟病一直是全球關(guān)注的難點(diǎn)和熱點(diǎn)之一，繼續(xù)堅(jiān)持不懈地研究和探尋治療慢性腎臟病新藥物仍是當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的一項(xiàng)艱巨任務(wù)。
目前，西藥藥用活性炭和中藥復(fù)方尿毒清顆粒、百令膠囊等是治療慢性腎臟病常用藥物。西藥雖然有一定的療效，但存在毒副作用大且復(fù)發(fā)率高等不足，如藥用活性炭在疾病的初期階段有效，但后期反而會使病情加重，不能改善增加血清肌酐和尿素，出現(xiàn)難以控制的癥狀，最終會發(fā)展為更嚴(yán)重的后果。雖然透析或腎移植是終末期腎病或尿毒癥患者生存的治療手段，但是在慢性腎臟病的早和中期階段，在治療原發(fā)病的基礎(chǔ)上，采用行之有效的藥物治療措施以有效地阻止或延緩慢性腎臟病進(jìn)展是一個較為理想的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服治療慢性腎臟病藥物的不足。
本發(fā)明提供了茯苓酸a用于制備治療慢性腎臟病藥物的應(yīng)用。
發(fā)明人的結(jié)果表明茯苓酸a對5/6腎切除(5/6nx)的大鼠模型有較好的治療效果，茯苓酸a可為臨床提供一種新的治療慢性腎臟病的候選藥物。
附圖說明
圖1為假手術(shù)組、5/6腎切除模型組、5/6腎切除模型組+茯苓酸a治療組和5/6腎切除模型組+馬來酸依那普利治療組大鼠第12周末腎組織he、pas和masson染色分析。
具體實(shí)施方式
茯苓為多孔菌科真菌茯苓(poriacocos)的干燥菌核。茯苓始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，茯苓性平，味甘、淡，歸心、肺、脾、腎經(jīng)。茯苓是一味常用的健脾和胃、利水滲濕、寧心安神的中藥；臨床使用分茯苓、茯神、赤茯苓等，茯苓自古以來就是一味藥食兩用、非常重要的中藥，有十藥九茯苓之說，將茯苓列為上品。茯苓的主要活性成分為茯苓多糖和四環(huán)三萜類化合物。茯苓中四環(huán)三萜類化合物具有抗癌、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、體內(nèi)拮抗醛固酮等活性。茯苓皮為茯苓菌核的外皮，茯苓加工時僅使用茯苓內(nèi)部菌核即白茯苓，加工白茯苓時茯苓外皮和切割下的殘塊都被當(dāng)成廢料處理，造成了茯苓的極大浪費(fèi)。研究表明茯苓皮中的四環(huán)三萜類化學(xué)成分含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于茯苓菌核內(nèi)部的白茯苓中的含量。茯苓皮四環(huán)三萜酸類化學(xué)成分種類眾多，羊毛甾烷型四環(huán)三萜類化合物包括去氫齒孔酸、3-表去氫土莫酸、齒孔酸、3-表去氫土莫酸、去氫土莫酸、去氫齒孔酮酸、茯苓酸等。3，4-裂環(huán)羊毛甾烷型四環(huán)三萜類化合物包括茯苓酸a、茯苓新酸a、茯苓新酸b、茯苓新酸c、茯苓新酸d、茯苓新酸e、茯苓新酸f等。
本發(fā)明用茯苓酸a治療慢性腎臟病藥物以常規(guī)藥用制劑的形式來使用；所述的常規(guī)藥物用制劑含作為活性組分在制劑中與藥學(xué)上可接受的載體，如適宜于腸胃內(nèi)和腸胃外給藥的有機(jī)或無機(jī)的固體或液體賦形劑混合，該藥用制劑可以是固體形式如膠囊劑、片劑、丸劑、散劑、顆粒劑等。上述制劑中可含有穩(wěn)定劑、潤濕劑、輔料和其它常用的添加劑，如玉米淀粉、硬脂酸、橄欖油、檸檬酸、乳糖、乙二醇、硬脂酸鎂、明膠、石膏粉、瓊脂、抗壞血酸等。上述的制劑可按照各種制劑常規(guī)的制備工藝制成。
為了確保本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)，發(fā)明人提供了一種茯苓酸a的制備方法，同時提供了所制備的茯苓酸a的結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果。
茯苓酸a的提取制備工藝：經(jīng)過干燥的茯苓皮藥材粉碎后，用5倍體積的乙酸乙酯浸泡2天，開始滲漉，濃縮提取物，回收乙酸乙酯，得棕色乙酸乙酯提取物。乙酸乙酯提取物用mci填料拌樣，上mci色譜柱，采用40:60-70:30甲醇-水梯度洗脫；洗脫液濃縮進(jìn)一步上200-300目的硅膠柱，石油醚-乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，合并濃縮，最后得茯苓酸a。
黃色粉末，c31h46o5,mw:498,ei-msm/z:497[m-h]－,479[m-h2o]－,423[m-ch2ch2co2h]－；1hnmr(pyridine-d5,800mhz)δ:0.963,0.971(2×3h,s,h3-26,27),1.007(3h,s,h3-19),1.111(3h,s,h3-18),1.476(3h,s,h3-30),1.725(3h,s,h3-29),1.802(1h,m,h-1),2.856(1h,dd,j＝11.11,5.73hz,h-17),2.929(1h,dt,j＝8.12,2.68hz,h-20),4.499(1h,dd,j＝7.18,6.83hz,h-16),4.809,4.823(2×1h,brs,h-28),4.837(1h,s,h-31),5.267(1h,brs,h-7),5.25(1h,brs,h-11)。13cnmr(pyridine-d5,200mhz)給出30個碳信號，根據(jù)dept譜推斷分別為7個甲基，8個亞甲基，7個次甲基(包括3個雙鍵碳δ121.21,116.65,124.92)，7個季碳(含3個雙鍵碳δ142.81,146.53,131.64和一個羧基碳δ178.72)。13cnmr(pyridine-d5,200mhz)給出31個碳信號，根據(jù)dept譜推斷分別為6個甲基δ:18.31(c-18),22.23(c-19),22.19(c-26),21.83(c-27),21.985(c-28),24.82(c-29)，7個亞甲基(含2個雙鍵碳δ112.14,c-28,107.07,c-31)，9個次甲基(包括2個雙鍵碳δ117.94,120.26和一個羥基碳δ76.38)，9個季碳(含4個雙鍵碳δ150.21,141.82,137.46,156.01和2個羧基碳δ176.58,178.59)。13cnmr(pyridine-d5,200mhz)δ:36.34(c-1),30.17(c-2),176.58(c-3),150.21(c-4),50.71(c-5),28.54(c-6),117.94(c-7),141.82(c-8),137.46(c-9),38.80(c-10),120.26(c-11),36.95(c-12),45.59(c-13),49.28(c-14),43.78(c-15),76.38(c-16),57.58(c-17),18.32(c-18),22.23(c-19),48.41(c-20),178.59(c-21),31.33(c-22),33.18(c-23),156.01(c-24),34.05(c-25),22.19(c-26),21.83(c-27),112.14(c-28),21.98(c-29),24.82(c-30),107.01(c-31)。根據(jù)以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對照，鑒定該化合物為：16α-羥基-3,4-裂環(huán)羊毛甾-4(28),7,9(11),24(31)-三烯-3,21-雙酸(16α-hyroxy-3,4-secolanosta-4(28),7,9(11),24(31)-tetraen-3,21-dioicacid)或者茯苓酸a(poricoicacida)。
(16α-hyroxy-3,4-secolanosta-4(28),7,9(11),24(31)-tetraen-3,21-dioicacid)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
為了說明茯苓酸a對慢性腎臟病治療的效果，發(fā)明人以生5/6腎切除大鼠模型對茯苓酸a進(jìn)行了慢性腎臟病活性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)藥物、動物、儀器、方法及結(jié)果如下：
1.實(shí)驗(yàn)藥物
馬來酸依那普利片：濟(jì)南利民制藥有限公司，批號1601426，生產(chǎn)日期20160124；茯苓酸a由茯苓皮通過乙醇提取和提取物色譜分離進(jìn)行制備，通過1hnmr、13cnmr、ms、uv和ir等波譜與光譜技術(shù)進(jìn)行鑒定結(jié)構(gòu)。
2.實(shí)驗(yàn)動物
體重180-220g的雄性sprague-dawley大鼠購買于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：scxk(陜)2012-003。
3.實(shí)驗(yàn)儀器
安徽淮北正華生物儀器有限公的zh-b6型大鼠代謝籠，td型電子天平，美特列-托利多十萬分子一分析天平，au5800全自動生化分析儀。
4.實(shí)驗(yàn)方法
1)茯苓酸a對5/6腎切除大鼠模型治療的實(shí)驗(yàn)方法及生物樣品的收集
32只雄性sd大鼠隨機(jī)分為4組(每組8只)：假手術(shù)組、5/6腎切除組、5/6腎切除+茯苓酸a治療組和5/6腎切除+依那普利治療組。假手術(shù)組僅打開腹腔，剝離腎包膜后關(guān)腹；5/6腎切除組和5/6腎切除后茯苓酸a治療組大鼠在10％水合氯醛麻醉下切除左腎上下極各1/3腎組織，1周后切除右腎；第10周開始，5/6腎切除+茯苓酸a治療組大鼠每天灌胃茯苓酸a20mg/kg，5/6腎切除+依那普利治療組大鼠每天灌胃依那普利1.67mg/kg，假手術(shù)組和5/6腎切除組大鼠同時給予等體積飲用水，第12周末結(jié)束后，麻醉處死所有大鼠，留取血和腎組織標(biāo)本。
2)實(shí)驗(yàn)動物生化指標(biāo)檢測方法
生化指標(biāo)的測定委托西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院完成。采用全自動生化分析儀測定各組大鼠血清肌酐尿、尿素、白蛋白、鈣、磷等慢性腎臟病的藥效評價指標(biāo)。
3)藥效計算與統(tǒng)計分析
結(jié)果均以平均值±sd表示，采用t檢驗(yàn)，計算t，p值，將5/6腎切除組與假手術(shù)組、茯苓酸a治療組與5/6腎切除模型組進(jìn)行組間差異性比較，t檢驗(yàn)，p<0.05為有顯著性差異；p<0.01為有非常顯著性差異，判斷藥物對慢性腎臟病的治療效果。
4)5/6腎切除大鼠模型及茯苓酸a對該模型治療的結(jié)果
(a)茯苓酸a治療組對5/6腎切除大鼠模型腎功能生化指標(biāo)的影響
表1是假手術(shù)、5/6腎切除大鼠模型、5/6腎切除大鼠模型+茯苓酸a和5/6腎切除大鼠模型+依那普利治療大鼠血清肌酐、尿素、尿酸、白蛋白、鈣和磷的生化指標(biāo)。與假手術(shù)組大鼠相比，5/6腎切除模型大鼠血清肌酐、尿素和尿酸升高和血清白蛋白降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與5/6腎切除模型大鼠比較，茯苓酸a治療組降低在模型組增加的血清肌酐、尿素和尿酸，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與5/6腎切除模型組大鼠比較，茯苓酸a治療組增加在模型組大鼠降低的血清白蛋白，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。依那普利組降低在模型組增加的血清肌酐、尿素和尿酸且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但對尿酸和白蛋白沒有影響，與假手術(shù)組大鼠相比，5/6腎切除模型大鼠血清鈣降低和磷升高，但僅磷升高的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與5/6腎切除模型組比較，茯苓酸a和依那普利治療組增加血清鈣和減低血清磷的含量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這些生化指標(biāo)的改變表明茯苓酸a不僅能促進(jìn)體內(nèi)的氮質(zhì)化合物的排出，且對紊亂的鈣和磷代謝也有較好的改善作用，表明茯苓酸a對5/6腎切除大鼠模型有較好治療作用。
表1茯苓酸a對5/6腎切除大鼠的血清生化指標(biāo)的影響
5/6腎切除模型組與假手術(shù)組比較：*p<0.05，**p<0.01；治療組與5/6腎切除模型組比較：
#p<0.05,##p<0.01
(b)he和pas染色組織形態(tài)觀察
假手術(shù)組大鼠腎臟組織形態(tài)未見明顯變化，均表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)豐富，腎小管之間背靠背，腎間質(zhì)中未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤；實(shí)驗(yàn)第12周結(jié)束后，5/6腎切除模型大鼠顯示腎間質(zhì)大量的炎性細(xì)胞浸潤、腎小管上皮細(xì)胞萎縮扁平，腎小管腔擴(kuò)張及間質(zhì)增寬，腎間質(zhì)中出現(xiàn)局灶莊纖維化。茯苓酸a治療組對5/6腎切除模型大鼠腎臟病理改變類似于模型組的改變，但各種病變程度都明顯輕于5/6腎切除模型組。陽性對照藥馬來酸依那普利對5/6腎切除模型大鼠也顯示較好的治療作用。由此可見，茯苓酸a對5/6腎切除大鼠具有較好的防治作用，茯苓酸a對腎臟間質(zhì)纖維化具有防治和促進(jìn)腎組織的修復(fù)作用，且茯苓酸a對5/6腎切除模型大鼠治療效果類似于馬來酸依那普利的效果(圖1)。
(c)masson染色
第12周的5/6腎切除大鼠的masson染色也同樣顯示嚴(yán)重的腎小管擴(kuò)張和腎皮質(zhì)區(qū)嚴(yán)重的腎小球周圍的纖維化(圖1)。masson染色顯示茯苓酸a治療組對5/6腎切除模型大鼠腎臟病理改變類似于模型組的改變，但各種病變程度都明顯輕于5/6腎切除模型組。陽性對照藥馬來酸依那普利對5/6腎切除模型大鼠也顯示較好的治療作用。由此可見，茯苓酸a對5/6腎切除大鼠具有較好的治療作用，茯苓酸a對腎臟間質(zhì)纖維化具有治療和減少腎損傷的作用，且茯苓酸a對5/6腎切除模型大鼠治療效果類似于馬來酸依那普利的效果(圖1)。
茯苓酸a在5/6腎切除所致慢性腎臟病的大鼠體內(nèi)進(jìn)行治療實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)表明茯苓酸a可以降低腎功能的生化指標(biāo)血尿素和血肌酐且存在統(tǒng)計學(xué)上非常顯著差異。茯苓酸a能改善腎功能、減少腎臟的病理性損害具有較好保護(hù)作用。此外，茯苓酸a對慢性腎臟病的鈣磷代謝的紊亂也有較好的改善作用，茯苓酸a不僅可以改善影響氮質(zhì)代謝產(chǎn)物的排泄，而且對鈣磷代謝有較好的改善作用，且茯苓酸a對5/6腎切除模型大鼠治療效果類似于馬來酸依那普利的效果，可為臨床提供一種新的類似于血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑馬來酸依那普利治療慢性腎臟病的藥物，具有廣闊的應(yīng)用前景。