殼聚糖作為胰脂肪酶抑制劑的用途的制作方法

文檔序號：11090843閱讀：984來源：國知局

本發(fā)明涉及海洋生物技術領域，具體涉及一種殼聚糖作為胰脂肪酶抑制劑的用途。

背景技術：

肥胖是由機體能量代謝失衡導致的一種慢性營養(yǎng)性疾病，全球肥胖人群人數(shù)逐年攀升。研究表明肥胖是引起非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、Ⅱ型糖尿病、動脈粥樣硬化(AS)、腫瘤、睡眠障礙、骨關節(jié)炎等多種疾病的重要因素。胰脂肪酶是水解膳食脂肪最重要的酶，能夠?qū)⑷梭w攝入的脂肪逐步水解轉化為甘油和游離的脂肪酸，對人體脂肪堆積、肥胖形成具有重要意義，因此通過抑制胰脂肪酶的活性可以控制高脂飲食引起的肥胖。殼聚糖是一種天然的堿性多糖，由氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵連接而成。由于殼聚糖來源豐富，生理活性廣泛，安全無毒，且具有良好的生物兼容性，在食品醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、材料科學等領域具有很大的應用潛力。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，平均分子量300kDa-1800kDa，最優(yōu)選1200kDa±3kDa的殼聚糖可以有效抑制胰脂肪酶活性，這一發(fā)現(xiàn)，不僅拓寬了殼聚糖的應用范圍，也為篩選具胰脂肪酶活性抑制功能的天然活性物質(zhì)開辟新途徑。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種殼聚糖作為胰脂肪酶抑制劑的用途。

本發(fā)明實現(xiàn)目的的方案如下：

殼聚糖作為胰脂肪酶抑制劑的用途，所述殼聚糖的結構式如式Ⅰ所示，式中n＝1800-11200。

優(yōu)選的；所述殼聚糖的平均分子量為1200kDa±3kDa。

殼聚糖抑制胰脂肪酶活性的實驗方法為：將殼聚糖用50mM Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液溶解并稀釋，得到殼聚糖溶液。然后向胰脂肪酶溶液中加入殼聚糖溶液，使殼聚糖與胰脂肪酶的質(zhì)量比大于或等于2:1，37℃預處理15min后，向以上混合物中加入底物4-硝基苯基丁酸酯(PNPB)啟動反應，37℃恒溫振蕩15min。反應結束后，立即沸水浴終止實驗，冷卻后用酶標儀測量A_405nm。根據(jù)對硝基苯酚濃度吸光度(A_405nm)標準曲線，得到反應結束后體系中對硝基苯酚濃度，根據(jù)以下公式計算胰脂肪酶活性及殼聚糖對胰脂肪酶的抑制率：

式中：酶活力，U；對硝基苯酚濃度，μmol/L；反應終體積，mL；反應時間，min；酶液用量，mL。

本發(fā)明的優(yōu)點：

1)本發(fā)明利用平均分子量300kDa-1800kDa，最優(yōu)選1200kDa±3kDa的殼聚糖抑制胰脂肪酶活性，指出殼聚糖可作為胰脂肪酶抑制劑使用，擴展了殼聚糖的應用范圍。

2)本發(fā)明明確了殼聚糖平均分子量與胰脂肪酶活性之間的關系，為篩選具胰脂肪酶活性抑制功能的天然活性物質(zhì)開辟新途徑。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中使用的平均分子量為1800kDa的殼聚糖樣品的高效液相色譜圖譜；

圖2為本發(fā)明中使用的平均分子量為1500kDa的殼聚糖樣品的高效液相色譜圖譜；

圖3為本發(fā)明中使用的平均分子量為1200kDa的殼聚糖樣品的高效液相色譜圖譜；

圖4為本發(fā)明中使用的平均分子量為900kDa的殼聚糖樣品的高效液相色譜圖譜；

圖5為本發(fā)明中使用的平均分子量為600kDa的殼聚糖樣品的高效液相色譜圖譜；

圖6為本發(fā)明中使用的平均分子量為300kDa的殼聚糖樣品的高效液相色譜圖譜；

圖7為本發(fā)明實施例提供的平均分子量300kDa-1800kDa的殼聚糖與胰脂肪酶在不同質(zhì)量比條件下，殼聚糖抑制胰脂肪酶活力圖。

具體實施方式

以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。

不同平均分子量殼聚糖的制備方法：將高分子量殼聚糖(平均分子量為1800kDa，脫乙酰度為98.73％，記作CTS1)10g溶解于300mL 2％(體積分數(shù))鹽酸得殼聚糖溶液，向殼聚糖溶液中加入300ml 2％(體積分數(shù))雙氧水，60℃水浴分別反應10min、15min、25min、40min、50min，將反應后溶液用堿液中和至中性后，醇沉，離心后收集沉淀，冷凍干燥后即可得到平均分子量分別為1500kDa、1200kDa、900kDa、600kDa、300kDa的殼聚糖，分別記作CTS2-6。平均分子量的測定采用高效液相色譜法，如圖1至圖6所示，以平均分子量64650，80000，135350，300600，2000000，2100000Da的右旋糖酐標準品作為標準。

100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的CTS1溶液的制備方法：稱取100mg CTS1，用100mL 50mMTris-HCl緩沖液(pH 8.0)溶解，配制成濃度為1000μg/mL的CTS1溶液；再分別量取適量1000μg/mL的CTS1溶液，分別用50mMTris-HCl緩沖液(pH 8.0)稀釋，配制成100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL的CTS1溶液。

100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的CTS2-6溶液的制備方法同上述CTS1溶液的制備方法。

50μg/mL胰脂肪酶液的配制方法：稱取10mg胰脂肪酶酶粉(15-30units/mg)，用200mL 50mMTris-HCl緩沖液(pH 8.0)溶解，配制成濃度50μg/mL的胰脂肪酶液，置于冰箱中備用。

0.01mol/LPNPB溶液配制方法：精確稱取209mg PNPB，用100mL二甲基亞砜(DMSO)溶解，配制成濃度0.01mol/L的PNPB溶液，置于4℃冰箱中備用。

對硝基苯酚濃度吸光度(A_405nm)標準曲線的繪制：稱取適量對硝基苯酚，用50mMTris-HCl緩沖液(pH 8.0)溶解，并配制一系列具有一定濃度梯度的對硝基苯酚溶液，用未加對硝基苯酚的空白溶液作為參比，分別用酶標儀測量A_405nm，以對硝基苯酚濃度為橫坐標，A_405nm為縱坐標作圖，即得到對硝基苯酚濃度吸光度(A_405nm)標準曲線(參考：江慧芳,王雅琴,劉春國,三種脂肪酶活力測定方法的比較及改進.化學與生物工程2007,24(8),72-75)。

胰脂肪酶活性的測定采用對硝基苯酚法(參考：江慧芳,王雅琴,劉春國,三種脂肪酶活力測定方法的比較及改進.化學與生物工程2007,24(8),72-75)，以對硝基苯酚作為標準。殼聚糖抑制胰脂肪酶活性的實驗方法為：將殼聚糖用50mM Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液溶解并稀釋，得到殼聚糖溶液。然后向胰脂肪酶溶液中加入殼聚糖溶液，使殼聚糖與胰脂肪酶的質(zhì)量比大于或等于2:1，37℃預處理15min后，向以上混合物中加入底物PNPB啟動反應，37℃恒溫振蕩15min。反應結束后，立即沸水浴終止實驗，冷卻后用酶標儀測量A_405nm。根據(jù)對硝基苯酚濃度吸光度(A_405nm)標準曲線，得到反應結束后體系中對硝基苯酚濃度，根據(jù)以下公式計算胰脂肪酶活性及殼聚糖對胰脂肪酶的抑制率：

式中：酶活力，U；對硝基苯酚濃度，μmol/L；反應終體積，mL；反應時間，min；酶液用量，mL。

實施例1

分別取100μL各濃度的CTS1溶液(100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL)或100μL 50mM Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液(空白對照)與100μL胰脂肪酶酶液(50μg/mL)、700μL 50mM Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液在37℃下預處理15min，充分混勻，CTS1與胰脂肪酶的質(zhì)量比分別為2:1、5:1、10:1、20:1，然后分別向以上混合物中加入100μL 0.01mol/L PNPB溶液啟動反應。將以上反應混合物置于37℃下恒溫振蕩15min。反應結束后，立即沸水浴終止實驗，冷卻后用酶標儀測量A_405nm，反應設置三個平行。根據(jù)對硝基苯酚濃度吸光度(A_405nm)標準曲線，可得到反應結束后體系中對硝基苯酚濃度，根據(jù)以下公式計算胰脂肪酶活性及CTS1對胰脂肪酶的抑制率：