本發(fā)明涉及天然物質(zhì)的提取技術(shù)領(lǐng)域，更具體而言，涉及一種具有多種生物活性的土木香葉提取物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

土木香(Inula helenium L.)為菊科(Compositae)旋覆花屬植物，多年生草本，根供藥用。菊科旋覆花屬(Inula L.)植物全世界約有100種，分布于歐洲、亞洲及非洲，以地中海地區(qū)為主，我國(guó)有20余種和多種變種。本屬多種植物常供藥用，倍半萜類化學(xué)成分是本屬植物的特征性成分，以桉烷型、吉馬烷型和愈創(chuàng)木烷型倍半萜為主。土木香在古方中常用于祛痰、鎮(zhèn)咳和抗菌。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)土木香化學(xué)成分及藥理活性研究發(fā)現(xiàn)倍半萜內(nèi)酯類成分有抗腫瘤細(xì)胞增殖作用和抗結(jié)核分支桿菌等作用。每年秋天，藥農(nóng)采收土木香根時(shí)，大量的土木香葉都被遺棄。土木香葉的濕重占土木香植株60％以上，為了充分利用土木香植物資源，對(duì)土木香葉活性進(jìn)行深入研究，具有巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了充分利用土木香葉資源，提供一種土木香葉提取物及其在抗癌、抗炎和抗微生物方面的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種土木香葉提取物，包含質(zhì)量百分比不低于10％的土木香內(nèi)酯和不低于5％的異土木香內(nèi)酯。

它是通過(guò)以下方法制備得到：取干燥的土木香葉，粉碎，有機(jī)溶媒提取，合并提取液，蒸去溶劑，得土木香葉提取物。

作為優(yōu)選，所述的有機(jī)溶媒包括有機(jī)溶劑：無(wú)水甲醇、含水體積比為1-30％的甲醇、無(wú)水乙醇、含水體積比為1-30％的乙醇、石油醚、環(huán)己烷中的任意一種，以及二氧化碳超臨界流體。

作為優(yōu)選，所述的提取方法包括浸漬法、滲漉法、煎煮法、回流提取法、連續(xù)回流提取法以及超臨界流體提取法中的任意一種。

作為優(yōu)選，本發(fā)明所述的制備土木香葉提取物的具體步驟為：取干燥的土木香葉，粉碎，加4-8倍量有機(jī)溶劑，提取2-5次，每次1-3小時(shí)，合并提取液，蒸去溶劑，得土木香葉提取物。

作為優(yōu)選，本發(fā)明所述的制備土木香葉提取物的具體步驟為：取干燥的土木香葉，粉碎，采用二氧化碳超臨界流體提取，得到土木香葉提取物；其中二氧化碳超臨界流體提取的條件為：提取壓力15-35Mpa，提取溫度35-65℃，提取時(shí)間15-90min。

本發(fā)明通過(guò)MTT法檢測(cè)土木香葉提取物對(duì)各種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用，驗(yàn)證了其具有抗腫瘤活性。

本發(fā)明通過(guò)檢測(cè)土木香葉提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞釋放NO的抑制作用，驗(yàn)證了其具有抗炎活性。

本發(fā)明通過(guò)檢測(cè)土木香葉提取物對(duì)細(xì)菌或真菌的最低抑菌濃度(MIC)及最低殺菌濃度(MBC)，驗(yàn)證了其具有抗微生物活性。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供所述的土木香葉提取物在制備抗腫瘤制劑中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供所述的土木香葉提取物在制備抗炎制劑中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供所述的土木香葉提取物在制備抗微生物制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種抗腫瘤制劑，由有效劑量的本發(fā)明所述的土木香葉提取物和藥學(xué)上可接受的輔料制成。

本發(fā)明還提供一種抗炎制劑，由有效劑量的本發(fā)明所述的土木香葉提取物和藥學(xué)上可接受的輔料制成。

本發(fā)明還提供一種抗微生物制劑，由有效劑量的本發(fā)明所述的土木香葉提取物和藥學(xué)上可接受的輔料制成。

優(yōu)選的，以上制劑為片劑、注射劑、膠囊劑、顆粒劑、栓劑、丸劑、軟膏劑、乳膏劑、噴霧劑、氣霧劑、凝膠劑、散劑、糖漿劑、搽劑、涂劑、涂膜劑、酊劑、貼劑、貼膏劑、口服溶液劑、口服混懸劑、口服乳劑、膜劑、洗劑、沖洗劑、煎膏劑、酒劑、膏藥、茶劑、流浸膏劑和浸膏劑中的任意一種。

本發(fā)明提供的土木香葉提取物具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明提供的土木香葉提取物，在充分利用中藥土木香植物資源基礎(chǔ)上，變廢為寶，開(kāi)發(fā)出土木香新的藥用資源，其抗癌、抗炎和抗微生物活性強(qiáng)，可開(kāi)發(fā)成為新的抗癌、抗炎和抗微生物的藥物，且本發(fā)明提供的土木香葉的提取物可以制備成多種劑型，方便使用。

附圖說(shuō)明

圖1為土木香內(nèi)酯對(duì)照品和異土木香內(nèi)酯對(duì)照品的GC圖譜；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1所述土木香葉提取物的GC圖譜；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2所述土木香葉提取物的GC圖譜；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例3所述土木香葉提取物的GC圖譜；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例4所述土木香葉提取物的GC圖譜；

具體實(shí)施方式

本發(fā)明實(shí)施例公開(kāi)了一種土木香葉提取物及其在抗腫瘤、抗炎、抗微生物中的應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改進(jìn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品和應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

【實(shí)施例1】土木香葉提取物

一種具有多種生物活性的土木香葉提取物，它是通過(guò)以下方法制備得到：取干燥的土木香葉，粉碎，加4倍量石油醚，回流提取2次，每次1小時(shí)，合并提取液，蒸去石油醚溶劑，得土木香葉提取物。

該土木香葉提取物中土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯含量測(cè)定：參照2015版《中國(guó)藥典》記載的氣相色譜法(通則0521)測(cè)定。

色譜條件：Agilent 6890N氣相色譜儀；聚乙二醇20000(PEG-20M)毛細(xì)管柱(柱長(zhǎng)為30m，內(nèi)徑為0.25mm，膜厚度為0.25μm)；載氣為氦氣；分流比為10:1；程序升溫：初始溫度190℃，保持30分鐘，以每分鐘120℃的速率升溫至240℃，保持5分鐘；進(jìn)樣口溫度為260℃；檢測(cè)器溫度為280℃。

對(duì)照品溶液的制備：取土木香內(nèi)酯對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)：110760-200507)和異土木香內(nèi)酯對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)：110761-200204)適量，精密稱定，加入二氯甲烷，制成每1mL各含1mg的混合溶液，即得。

供試品溶液的制備：精密稱定約50mg實(shí)施例1所得土木香葉提取物干燥粉末，精密加入二氯甲烷5mL，超聲處理(功率300W，頻率50kHz)30分鐘，放冷，再稱定重量，用二氯甲烷補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取濾液，即得。

測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各1μL，注入氣相色譜儀，測(cè)定，即得。

測(cè)得，該土木香葉提取物含16.42％土木香內(nèi)酯和13.91％異土木香內(nèi)酯。實(shí)施例1所得土木香葉提取物的GC圖譜見(jiàn)圖2；土木香內(nèi)酯對(duì)照品和異土木香內(nèi)酯對(duì)照品的GC圖譜見(jiàn)圖1。

【實(shí)施例2】土木香葉提取物

一種具有多種生物活性的土木香葉提取物，它是通過(guò)以下方法制備得到：取干燥的土木香葉，粉碎，加8倍量石油醚，回流提取5次，每次3小時(shí)，合并提取液，蒸去石油醚溶劑，得土木香葉提取物。

參照實(shí)施例1描述的土木香葉提取物中土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯的含量測(cè)定方法，測(cè)得，實(shí)施例2所得土木香葉提取物含20.26％土木香內(nèi)酯和17.57％異土木香內(nèi)酯。實(shí)施例2所得土木香葉提取物的GC圖譜見(jiàn)圖3。

【實(shí)施例3】土木香葉提取物

一種具有多種生物活性的土木香葉提取物，它是通過(guò)以下方法制備得到：取干燥的土木香葉，粉碎，采用二氧化碳超臨界流體提取，得到土木香葉提取物，其中，二氧化碳超臨界流體提取的條件為：提取壓力15Mpa，提取溫度35℃，提取時(shí)間15min。

參照實(shí)施例1描述的土木香葉提取物中土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯的含量測(cè)定方法，測(cè)得，實(shí)施例3所得土木香葉提取物含25.46％土木香內(nèi)酯和20.18％異土木香內(nèi)酯。實(shí)施例3所得土木香葉提取物的GC圖譜見(jiàn)圖4。

【實(shí)施例4】土木香葉提取物

一種具有多種生物活性的土木香葉提取物，它是通過(guò)以下方法制備得到：取干燥的土木香葉，粉碎，采用二氧化碳超臨界流體提取，得到土木香葉提取物，其中，二氧化碳超臨界流體提取的條件為：提取壓力35Mpa，提取溫度65℃，提取時(shí)間90min。

參照實(shí)施例1描述的土木香葉提取物中土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯的含量測(cè)定方法，測(cè)得，實(shí)施例4所得土木香葉提取物含28.76％土木香內(nèi)酯和22.67％異土木香內(nèi)酯。實(shí)施例4所得土木香葉提取物的GC圖譜見(jiàn)圖5。

【實(shí)施例5】將實(shí)施例1和3制備得到的土木香葉提取物進(jìn)行體外抗腫瘤活性驗(yàn)證。

實(shí)驗(yàn)方法：腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)于含10％小牛血清、青霉素和鏈霉素培養(yǎng)液中，置37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行增殖抑制實(shí)驗(yàn)。用MTT法檢測(cè)提取物對(duì)各種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用，其對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率實(shí)驗(yàn)結(jié)果：見(jiàn)表1。

表1：實(shí)施例1和3所得到的土木香葉提取物對(duì)上述5種腫瘤細(xì)胞的抑制率

【實(shí)施例6】將實(shí)施例1和3制備得到的土木香葉提取物進(jìn)行體外抗炎活性驗(yàn)證。

細(xì)胞株：RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)方法：按常規(guī)復(fù)蘇細(xì)胞并且傳代培養(yǎng)，使用DMEM，10％PBS，l％雙抗的完全培養(yǎng)基，接種細(xì)胞到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于5％CO₂培養(yǎng)箱于37℃培養(yǎng)48小時(shí)，加入LPS，誘導(dǎo)4小時(shí)，對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以確定提取物預(yù)處理對(duì)于LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是否具有抑制作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：見(jiàn)表2。

表2：實(shí)施例1和3所得到的提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞釋放NO的抑制作用。

【實(shí)施例7】將實(shí)施例1和3制備得到的土木香葉提取物進(jìn)行體外抗菌活性驗(yàn)證。

實(shí)驗(yàn)方法：將該提取物溶于PBS緩沖液制成儲(chǔ)備液，然后用二倍稀釋法接種試驗(yàn)細(xì)菌和真菌，細(xì)菌37℃恒溫培養(yǎng)24小時(shí)，真菌28℃恒溫培養(yǎng)48小時(shí)后，觀察結(jié)果，找出阻止細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度，即為最低抑菌濃度(MIC)。在MIC的基礎(chǔ)上，繼續(xù)將此菌液接種于無(wú)菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)，活菌計(jì)數(shù)法計(jì)算菌落數(shù)，平均菌落數(shù)小于5個(gè)的藥物濃度即為最低殺菌濃度(MBC)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：見(jiàn)表3。

表3：提取物對(duì)各菌株的MIC(μg/mL)和MBC(μg/mL)

本發(fā)明充分利用土木香資源，變廢為寶，通過(guò)對(duì)土木香葉提取物的生物活性實(shí)驗(yàn)篩選，去粗存精，制備得到具有生物活性的土木香葉的提取物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的土木香葉的提取物抗癌、抗炎和抗微生物活性強(qiáng)，具有重要的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。該提取物可與藥學(xué)上允許的輔料制備成包括但不僅限于片劑、注射劑、膠囊劑、顆粒劑、栓劑、丸劑、軟膏劑、乳膏劑、噴霧劑、氣霧劑、凝膠劑、散劑、糖漿劑、搽劑、涂劑、涂膜劑、酊劑、貼劑、貼膏劑、口服溶液劑、口服混懸劑、口服乳劑、膜劑、洗劑、沖洗劑、煎膏劑、酒劑、膏藥、茶劑、流浸膏劑和浸膏劑。

以上實(shí)施方式只為說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所做的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。