本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是異長春花苷內(nèi)酰胺作為制備治療藥物的新用途。

背景技術(shù)：

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種。 原發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血是由于腦表面和腦底的血管破裂出血，血液直接流入蛛網(wǎng)膜下腔所致，又稱自發(fā)性SAH。而腦實質(zhì)或腦室出血、外傷性硬膜下或硬膜外出血流入蛛網(wǎng)膜下腔定義為繼發(fā)性SAH。 原發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血最常見的病因是先天性顱內(nèi)動脈瘤和血管畸形，死亡率高達32％-67％，其中動脈瘤性SAH占85％以上。當SAH發(fā)生后，患者表現(xiàn)顱內(nèi)壓增高，腦血流量減少，腦灌注壓降低，出現(xiàn)腦水腫、血腦屏障破壞，神經(jīng)元細胞死亡，并繼發(fā)腦血管痙攣等癥狀。盡管目前臨床對這類疾病已經(jīng)形成一系列規(guī)范化診療，但預(yù)后仍不理想，致死、致殘率較高，約50％的患者在發(fā)生SAH后30天內(nèi)死亡。

目前除手術(shù)治療外，針對蛛網(wǎng)膜下腔出血臨床常規(guī)藥物治療包括：

(1)頭痛時可用止痛藥，保持便通可用緩瀉劑。適量給予生理鹽水保證正常血容量和足夠腦灌注，低鈉血癥常見，可口服NaCl或3%生理鹽水靜脈滴注，不限制液體。避免使用損傷血小板功能藥物如阿司匹林。

(2)SAH引起顱內(nèi)壓升高，用20%甘露醇、呋塞米(速尿)和人血白蛋白(白蛋白)等脫水降顱壓治療。

(3)預(yù)防再出血：抗纖溶藥可抑制纖溶酶形成，推遲血塊溶解和防止再出血。常用氨基己酸(6-氨基己酸)4～6g加于0.9%生理鹽水100ml靜脈滴注，15～30min內(nèi)滴完，再以1g/h劑量靜滴12～24h;之后24g/d，持續(xù)3～7天，逐漸減量至8g/d，維持2～3周;腎功能障礙者慎用，副作用為深靜脈血栓形成。氨甲苯酸(止血芳酸)0.4g緩慢靜注，2次/d，或促凝血藥(立止血)、維生素K3等，但止血藥應(yīng)用仍有爭論。高血壓伴癲癇發(fā)作可增加動脈瘤破裂風(fēng)險，常規(guī)推薦預(yù)防性應(yīng)用抗癲癇藥如苯妥英(苯妥英鈉)300mg/d。 (4)預(yù)防性應(yīng)用鈣通道拮抗藥(calciumchannelantagonist)：尼莫地平(nimodipine)40mg口服，4～6次/d，連用21天;尼莫地平(硝苯吡酯)10mg/d，6h內(nèi)緩慢靜脈滴注，7～14天為一療程。可減少動脈瘤破裂后遲發(fā)性血管痙攣導(dǎo)致缺血合并癥。用去氧腎上腺素(苯腎上腺素)或多巴胺使血壓升高可治療血管痙攣，確定動脈瘤手術(shù)治療后用此方法較安全。

研究顯示，針對SAH的病理機制使用有效的藥物干預(yù)，能夠阻止或減輕各類蛛網(wǎng)膜下腔出血導(dǎo)致的腦損傷，提高患者的預(yù)后，降低致殘致死率，減輕國家和家庭的經(jīng)濟負擔，提高個人的生活質(zhì)量。但是目前的常規(guī)藥物治療仍然不能顯著提高患者的預(yù)后，因此尋找新的有效的SAH干預(yù)藥物是亟待解決并非常有臨床意義的。

異長春花苷內(nèi)酰胺是從植物中提取或合成的一種吲哚類生物堿糖苷，在常規(guī)醫(yī)療藥物治療中具有抗菌、抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛、止咳平喘、抗腫瘤和殺瘧原蟲以及抗色素沉著的作用。在用其作為藥效成分制成的藥品和試劑的文獻及報道中，未見有作為治療制備蛛網(wǎng)膜下腔出血藥物應(yīng)用的記載。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供異長春花苷內(nèi)酰胺在制備藥物中的新應(yīng)用，解決了常規(guī)治療蛛網(wǎng)膜下腔出血藥物不足的問題，該應(yīng)用使異長春花苷內(nèi)酰胺具有了作為制備治療蛛網(wǎng)膜下腔出血藥物有效成分的新用途。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：異長春花苷內(nèi)酰胺的應(yīng)用，技術(shù)要點是：異長春花苷內(nèi)酰胺在制備治療蛛網(wǎng)膜下腔出血藥物中的應(yīng)用。

所述的異長春花苷內(nèi)酰胺，是從含有該成分的植物、中藥材或者中藥飲片中提取得到，或采用化學(xué)合成的產(chǎn)品。

所述植物和中藥材包括烏檀、鉤藤、長春花、蛇根木、短小蛇根草、黃長春花、風(fēng)箱樹、雞仔木、蛇根木。

所述的異長春花苷內(nèi)酰胺是從茜草科烏檀屬植物的枝、干、皮或葉中提取得到。

所述的異長春花苷內(nèi)酰胺作為藥效成分單獨或與制藥可接受的賦形劑結(jié)合使用，制成肌肉注射給藥或靜脈給藥劑型的藥物制劑。

所述的異長春花苷內(nèi)酰胺是純的異長春花苷內(nèi)酰胺化合物單體或異長春花苷內(nèi)酰胺單體含量在95%以上的異長春花苷內(nèi)酰胺提取物。

所述的蛛網(wǎng)膜下腔出血包括先天性顱內(nèi)動脈瘤和腦血管動靜脈畸形引發(fā)的蛛網(wǎng)膜下腔出血，還包括外傷、高血壓、腦動脈硬化、顱內(nèi)腫瘤、血液病、腦底異常血管網(wǎng)癥、動脈炎、腦炎、抗凝治療并發(fā)癥和/或腦膜炎誘發(fā)的蛛網(wǎng)膜下腔出血。

本發(fā)明具有的優(yōu)點及積極效果是：

1.顯著減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血導(dǎo)致的腦水腫程度；

2.減少蛛網(wǎng)膜下腔殘留血液的量；

3.降低血腦屏障的破壞程度；

4.減輕腦基底動脈血管痙攣程度；

5.提高神經(jīng)功能評分等。

通過改善上述幾種臨床指標進而提高患者的預(yù)后，對蛛網(wǎng)膜下腔出血有顯著的治療作用。

附圖說明

圖1為sham組、SAH組、STR(3)治療組和STR(6)治療組的四組腦水腫程度比較圖；

圖2為腦表面出血量分區(qū)評分示例圖；

圖3為sham組、SAH組、STR(3)治療組和STR(6)治療組的四組大鼠蛛網(wǎng)膜下腔殘留血量比較及評分圖；

圖4為sham組、SAH組、STR(3)治療組和STR(6)治療組的四組神經(jīng)功能評分圖；

圖5為 sham組、SAH組、STR(3)治療組和STR(6)治療組的各組腦組織血腦屏障完整性含量測定圖；

圖6為sham組、SAH組、STR(3)治療組和STR(6)治療組的各組腦基底動脈血管痙攣程度評估圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種異長春花苷內(nèi)酰胺的新用途，即作為制備治療蛛網(wǎng)膜下腔出血藥物應(yīng)用，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但并不意味著本發(fā)明僅限于此，實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法，實施例中所用的材料、試劑、藥品等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

使用的異長春花苷內(nèi)酰胺可以是從含有該成分的植物、中藥材或者中藥飲片中提取得到，或采用化學(xué)合成的產(chǎn)品，可以通過現(xiàn)有技術(shù)中公開的方法獲得，也可以采用常規(guī)中藥提取方法獲得，所述植物和中藥材包括烏檀、鉤藤、長春花、蛇根木、短小蛇根草、黃長春花、風(fēng)箱樹、雞仔木、蛇根木。其中優(yōu)選為從茜草科烏檀屬植物的枝、干、皮或葉中提取得到。異長春花苷內(nèi)酰胺可以作為藥效成分單獨或與制藥可接受的賦形劑結(jié)合使用，可以制成肌肉注射給藥或靜脈給藥劑型的藥物制劑。異長春花苷內(nèi)酰胺可以是純的異長春花苷內(nèi)酰胺化合物單體，也可以是異長春花苷內(nèi)酰胺單體含量在90%以上的異長春花苷內(nèi)酰胺提取物，優(yōu)選95%以上，可采用高效液相色譜法測得。本申請人例舉了采用異長春花苷內(nèi)酰胺含量為95%開展了相關(guān)藥效作用實驗。

采用SD大鼠作為蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，并使用異長春花苷內(nèi)酰胺作為制備治療藥物應(yīng)用實驗，首先將SD大鼠隨機分成四組，分別為sham組、SAH組、STR (3)治療組和STR (6)治療組，每組18只，其中sham組為假手術(shù)組；SAH組為蛛網(wǎng)膜下腔出血模型組；STR(3)治療組為異長春花苷內(nèi)酰胺3mg /kg給藥組；STR(6)治療組為異長春花苷內(nèi)酰胺6mg /kg給藥組。

實施例1.蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠模型的制作及給藥方案

采用頸內(nèi)動脈穿刺法建立大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，取清潔級、健康成年雄性SD大鼠，體重為250-300g。用10% 水合氯醛 (3.5ml/kg) 腹腔注射麻醉后仰臥固定。固定頭部及四肢，頸前部備皮、消毒，取頸部正中切口，鈍性分離暴露右側(cè)頸總動脈(common carotid artery,CCA)、頸外動脈(externalcarotidartery,ECA)和頸內(nèi)動脈(internal carotid artery,ICA)結(jié)扎切斷ECA和ICA之間的吻合支，將ECA結(jié)扎并切斷拉直，使其與ICA成一直線。取3-0單股尼龍線（直徑0.261mm）將頭端銳化，于線端20mm和22mm處作標記，將尼龍線從頸外動脈置入頸內(nèi)動脈的顱內(nèi)段，插入深度為20mm左右，當感覺有阻力時再前進2mm刺破血管，造成蛛網(wǎng)膜下腔出血，大約10秒后迅速將尼龍線拔出，用絲線結(jié)扎頸外動脈殘端，恢復(fù)血流，縫合頸部切口。術(shù)中維持體溫37℃。除sham組（假手術(shù)組）不刺破血管壁外，其余各組操作均與SAH組（模型組）一致。麻醉未清醒前給予電熱毯保暖，術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng)，注意保暖。

然后采用異長春花苷內(nèi)酰胺（Strictosamide, STR）（純度95.3%，中檢所標準品）在對大鼠進行蛛網(wǎng)膜下腔出血造模后0.5h和24h進行尾靜脈注射給藥，使用劑量分別為STR 3mg/kg組（STR (3)治療組）和STR 6mg/kg組（STR (6)治療組）。sham組和SAH組給予等量生理鹽水。

實施例2.對腦水腫程度檢測

按照實施例1中模型制備方法及給藥方案治療，各組大鼠于造模后48h用10 %水合氯醛麻醉，開顱取全腦，切取全腦迅速放入預(yù)先稱好重量的錫箔上稱重，此重量減去錫箔重量即為濕重W1，隨后放入烤箱中在110℃條件下烘72h后再次稱重，此重量減去錫箔重量即為干重W2，腦水腫指數(shù)即可用下述公式求得。腦水腫指數(shù)=[(W1-W2)/ W1]×100%。

實驗結(jié)果如圖1所示，四組腦水腫程度（Brain water content）平均值±標準差比較，右半腦（R.H.）即患側(cè)的SAH組與sham組相比，腦組織含水量存在顯著差異，（**P<0.01）；STR(3)治療組和STR(6)治療組分別與SAH組比較，腦組織含水量均存在顯著差異（##P<0.01）。左半腦（L.H.）和小腦（C）的SAH組與sham組相比腦水腫變化程度不顯著但STR(3)治療組和STR(6)治療組與SAH組比較存在顯著差異（*P<0.05）。說明異長春花苷內(nèi)酰胺能夠顯著減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦水腫的程度。

實施例3.各組蛛網(wǎng)膜下腔殘留血量比較

按照實施例1中模型制備方法及給藥方案治療，各組大鼠于造模后48 h用10 %水合氯醛麻醉，開顱取全腦拍照，如圖2所示，對腦表面Willis環(huán)及基底動脈等各分區(qū)出血量進行觀察，進行評分?；壮乇环譃榱鶄€部分，如圖2的A部，各部分根據(jù)出血量從0-3分進行評分—0分：下腔未出血；1分：下腔有少量血；2分：在可以辨別的血管上有中等量的血；3分：在整個血管上覆蓋著大量的血(如圖2的B和C部)?；壮貎?nèi)主動脈的評分制度：對基底動脈 (BA)和Willis環(huán)構(gòu)成的大腦前動脈 (ACA)，頸內(nèi)動脈 (ICA)，從ICA到后交通動脈的近后端腦動脈 (PCA)以及后交通動脈(PcomA)進行評分。大腦中動脈 (MCA)，PCA末梢和小腦上動脈 (SCA)不在評分的范圍內(nèi)。只對基底池上的血管進行評分以保證重現(xiàn)性和一致性。血管的6個部分總評分從0分到18分。依據(jù)動物的最終得分將其分為三類：0-7分：輕微SAH；8-12分：中等SAH；13-18分：嚴重SAH。實驗采用雙盲法。假手術(shù)組動物未見出血，總得分為0分。

實驗結(jié)果如圖3所示，圖3左部為造模后48h各組蛛網(wǎng)膜下腔殘留血量直觀圖；圖3右部為各組蛛網(wǎng)膜下腔殘留血量（SAH Grade）的評分結(jié)果：SAH組與sham組相比，蛛網(wǎng)膜下腔血量存在顯著差異（***P<0.001）; STR(3)治療組與SAH組相比，蛛網(wǎng)膜下腔血量顯著減少，存在顯著差異（###P<0.001）；STR(6)治療組與SAH組比較，蛛網(wǎng)膜下腔血量顯著減少，也存在顯著差異（###P<0.001）。說明異長春花苷內(nèi)酰胺能夠減少蛛網(wǎng)膜下腔出血殘留血量，從而減少血紅蛋白等對腦組織的炎癥刺激等不良的相關(guān)反應(yīng)。

實例4.大鼠行為學(xué)-神經(jīng)功能評分

按照實施例1中模型制備方法及給藥方案治療，如圖4所示，參照Sugawara標準于術(shù)后24h對各組動物進行行為學(xué)神經(jīng)功能評分(Neurological score)，最低分：3分，最高分：18分。分值越低則說明動物的神經(jīng)功能缺陷越嚴重。

(1)自發(fā)性活動：大鼠置于籠中觀察5分鐘，根據(jù)對籠子四壁的接觸評分。3分：可以自由的運動，能觸到籠子至少3側(cè)面；2分：能觸及籠子側(cè)壁，但不到3個側(cè)面；1分：僅僅

可以移動位置；0分：不能運動。

(2)四肢運動對稱：將大鼠提尾置于空中觀測其四肢的運動對稱性。3分：四肢對稱，與蛛網(wǎng)膜出血前無明顯差異；2分：肢體無力或運動遲緩；1分：肢體極度無力，僅僅有輕微活動；0分：肢體不能運動。

(3)前腳伸展：將大鼠提尾至桌子的邊緣，讓其靠前肢前行，觀測當接近桌面時前肢的伸展情況。3分：雙前肢伸展同蛛網(wǎng)膜下腔出血前；2分：前腿伸展較正常差；1分：前腿僅僅有輕度的伸展；0分：前腿無動作。

(4)攀登：將大鼠置于豎直的10cm×100cm金屬網(wǎng)上，正常時大鼠四肢上爬，提尾使大鼠離開籠子，觀測大鼠四肢力量。3分：爬行容易，緊抓金屬網(wǎng)有力；2分：攀爬困難；1分：不能攀爬。

(5)對雙側(cè)軀干的觸碰反應(yīng)：用鈍頭木棒刺激大鼠一側(cè)身體，觀測其對刺激的反應(yīng)。3分：大鼠迅速轉(zhuǎn)頭，雙側(cè)對稱；2分：僅僅有輕微的反應(yīng)；1分：對軀干的觸碰無反應(yīng)。

(6)觸須反應(yīng)：鈍頭木棒刺激一側(cè)胡須，木棒從背后觸及胡須避免大鼠看見木棒。3分：雙側(cè)對稱反應(yīng)；2分：輕微反應(yīng)；1分：無反應(yīng)。

結(jié)果如圖4所示，SAH組與sham相比，行為學(xué)神經(jīng)功能評分存在顯著差異（**P<0.01）; STR(3)治療組和STR(6)治療組分別與SAH組比較，行為學(xué)評分均顯著提高，都存在顯著差異（#P<0.05和##P<0.01）。說明異長春花苷內(nèi)酰胺能夠顯著提高蛛網(wǎng)膜下腔出血后動物的行為能力，減少神經(jīng)功能的損傷。

實例5.血腦屏障通透性測定

按照實施例1中模型制備方法及給藥方案治療，然后按照下列步驟對血腦屏障通透性進行檢測（EB content）如圖5所示：

1） 建立標準曲線：配制0.1 mg/ml EB溶液為初始濃度液體，進行倍比稀釋，形成梯度

溶液0.1、0.05、0.025、0.0125、0.0063的EB標準濃度，應(yīng)用紫外分光光度儀620nm進行比色，甲酰胺溶液做空白，進行回歸分析求得標準曲線。

（2）大鼠麻醉后經(jīng)股靜脈注射 2% EB (5 ml/kg)，1h 后處死，為了清除血液中染料，向左心室灌注生理鹽水直至右心室流出透明液體為止，斷頭后取腦，分為左腦、右腦及小腦三個部分，稱重后按10ml/g浸入甲酰胺溶液中，在60℃恒溫水浴箱中孵育24h，甲酰胺溶液呈現(xiàn)深淺不同的藍色，腦組織呈現(xiàn)無色透明狀，然后應(yīng)用紫外分光光度儀進行比色，波長設(shè)定 620nm。根據(jù)標準曲線計算出 EB 含量。

如圖5所示，在L.H(左半腦)、R.H(右半腦)和C(小腦)三個不同腦區(qū)中，SAH組與sham組相比，腦組織中EB含量顯著高于sham組（**P<0.01）；STR(3)治療組和STR(6)治療組分別與SAH組比較，腦組織中EB含量顯著低于SAH組（#P<0.05和##P<0.01）。這些實驗數(shù)據(jù)說明，異長春花苷內(nèi)酰胺能夠顯著降低血腦屏障的破壞，保護血腦屏障的完整性，對腦組織起到保護作用。

實例6.大鼠腦血管痙攣的檢測

按照實施例1中模型制備方法及給藥方案治療，然后按照下列方法進行實驗：

一、取材：實驗大鼠經(jīng)左側(cè)開胸，剪開心包膜暴露心臟，在膈肌上胸腔內(nèi)夾閉胸主動脈及下腔靜脈，以27G留置針于心尖處穿刺，并將留置針置升主動脈，然后剪開右心耳，先以含肝素（20 U/ml）的生理鹽水沖洗，量約150-200ml，排除血管內(nèi)血液，然后而以 4%多聚甲醛心臟灌注，速度先快后慢，灌注時間約 10min～15min，量約250-300ml，此過程中可發(fā)現(xiàn)，大鼠頸部逐漸變硬，大鼠雙上肢或四肢抽搐。灌注結(jié)束后，開顱取腦，觀察腦基底池及Willis 動脈環(huán)周圍積血情況，然后將組織標本浸泡于4% 多聚甲醛中過夜。

二、 HE染色：主要顯示基底動脈的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)。

染色步驟如下：

（1）石蠟切片入二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各10 min；

（2）無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各3 min，梯度酒精95%、90%、85%、80%、70%各5s，蒸餾水洗；

（3）蘇木素染色 4 min；

（4）1%鹽酸酒精分色 2s，顯微鏡下觀察掌握分色程度；

（5）自來水洗20min，藍化；

（5）浸入伊紅染色液 (0.5%) 1分鐘；

（8）梯度酒精90%、95%各 1min，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各 5min；

（9）二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各 5min；

（10）中性樹膠封片。

三、測量：取每只大鼠基底動脈HE染色切片，Nikon光學(xué)顯微鏡下拍照，參照文獻法[3]通過測量基底動脈管腔面積確定血管痙攣程度。采用Image Pro Plus圖像分析系

統(tǒng)計算管腔面積和總面積比，最后應(yīng)用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析。

實驗結(jié)果如圖6所示，圖6A部：各組基底動脈形態(tài)變化（HE，200）；圖6B部：各組血管痙

攣程度統(tǒng)計比較： SAH組與sham組比較，血管痙攣程度存在極顯著差異（***P<0.0001）； STR(3)治療組和STR(6)治療組分別與SAH組比較，血管痙攣程度均顯著低于SAH組（###P<0.001）。實驗結(jié)果說明，異長春花苷內(nèi)酰胺能夠有效的預(yù)防腦基底動脈血管痙攣的發(fā)生。

綜上所述，本發(fā)明通過大量的動物體內(nèi)實驗證實，異長春花苷內(nèi)酰胺能夠有效改善蛛網(wǎng)膜下腔出血后多項生理指標，在蛛網(wǎng)膜下腔出血的早期腦損傷的治療中有確切的治療效果。