本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及貝沙羅汀偶合物、藥物組合物及其在制備預(yù)防或治療皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌抗腫瘤藥物和阿爾茨海默病藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

貝沙羅汀(Bexarotene)是一種新型的維甲酸類X受體(RXR)選擇性激活劑，它可以選擇性地與RXR亞單位(RXRα，RXRβ，RXRγ)結(jié)合，可以抑制造血系統(tǒng)及鱗細(xì)胞惡性腫瘤細(xì)胞系的生長，誘導(dǎo)一些惡性腫瘤細(xì)胞系的程序化死亡等。貝沙羅汀抑制許多癌細(xì)胞的生長，比如前列腺癌、乳腺癌和肺癌細(xì)胞等，是一種高效的防癌和治療癌癥的藥物，并可降低臨床用藥的毒性。貝沙羅汀尤其對抑制非小細(xì)胞肺癌和治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤和淋巴瘤丘疹病有效。此外，貝沙羅汀在預(yù)防或治療阿爾茨海默病、代謝性疾病方面也有特別效果。但是，貝沙羅汀水溶性很差，口服后生物利用度低，毒副作用明顯，限制了該藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用。此外，貝沙羅汀可與血漿蛋白高度結(jié)合(99％)，導(dǎo)致在血液循環(huán)中的自由藥物含量極少，影響藥效的發(fā)揮。

因此，有必要通過結(jié)構(gòu)修飾，開發(fā)新的貝沙羅汀偶合物及其藥物組合物，降低與血漿蛋白的結(jié)合，提高藥效，拓展臨床應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問題：本發(fā)明提供一種貝沙羅汀偶合物，其藥物組合物及應(yīng)用。通過化學(xué)改性的貝沙羅汀偶合物改善貝沙羅汀分子的物化性能，如具有還原敏感降解性，具有更好的水溶性，更低的血漿蛋白結(jié)合率，以及在水溶液中組裝形成納米顆?；蛑|(zhì)體的特性，或者能夠與磷脂助劑形成納米顆?；蛑|(zhì)體的能力。同時該貝沙羅汀偶合物能有效提高貝沙羅汀的生物利用度以及藥效等。

技術(shù)方案：本發(fā)明的貝沙羅汀偶合物，是具有下列結(jié)構(gòu)式(1)或(2)的化合物或所述化合物藥學(xué)上可接受的鹽：

其中，X是(CH₂)_mOCO(CH₂)_n或(CH₂)_pSS(CH₂)_pOCO(CH₂)_q，m為2～6的正整數(shù)，n為1～4的正整數(shù)，p為2～4的正整數(shù)，q為1～4的正整數(shù)。

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，包括所述的貝沙羅汀偶合物。

進(jìn)一步的，本發(fā)明藥物組合物中，還包括藥效學(xué)上可接受的載體。

進(jìn)一步的，本發(fā)明藥物組合物是片劑、錠劑、丸劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、口服液、懸浮液、乳劑或注射劑、栓劑或貼劑。

進(jìn)一步的，本發(fā)明藥物組合物，所述的藥物組合物為粒徑10-1000納米的納米顆?；蛑|(zhì)體，該藥物組合物中還包括助劑。

進(jìn)一步的，本發(fā)明藥物組合物中，所述助劑是磷脂或膽固醇。

本發(fā)明所述的貝沙羅汀偶合物或與助劑一起在水中自組裝成納米粒，可直接注射或口服，也可經(jīng)凍干后加入不同的賦形劑，加工成任何一種劑型，包括片劑、錠劑、丸劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、口服液、懸浮液、乳劑或注射劑、栓劑、貼劑。

本發(fā)明還提供了所述貝沙羅汀偶合物在制備治療皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌抗腫瘤或頑固性手癬藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了所述貝沙羅汀偶合物在制備治療和/或預(yù)防阿爾茨海默病藥物、代謝性疾病藥物中的應(yīng)用。

有益效果：本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明的貝沙羅汀偶合物作為一種前藥，在水相中溶解度遠(yuǎn)高于貝沙羅汀。

本發(fā)明的貝沙羅汀偶合物易于降解。

本發(fā)明的貝沙羅汀偶合物是兩親性化合物，在水相中自組裝為納米粒子，生物相容性、穩(wěn)定性好。

本發(fā)明的貝沙羅汀偶合物在水相中自組裝或與磷脂共組裝形成納米脂質(zhì)體，貝沙羅汀含量最高達(dá)到76％(質(zhì)量)，生物相容性、穩(wěn)定性好。

本發(fā)明的貝沙羅汀偶合物及其藥物組合物具有還原敏感性，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)易于被高濃度的谷胱甘肽降解釋放出原藥，比貝沙羅汀有更強(qiáng)的抗腫瘤活性。

本發(fā)明的貝沙羅汀偶合物及其藥物組合物比貝沙羅汀有更強(qiáng)的抗腫瘤活性。

本發(fā)明的貝沙羅汀偶合物及其藥物組合物比貝沙羅汀有更好的治療和/或預(yù)防阿爾茨海默病(老年癡呆癥)作用。

本發(fā)明的貝沙羅汀偶合物及其自組裝或與磷脂共組裝形成的納米脂質(zhì)體與血漿蛋白的結(jié)合率遠(yuǎn)低于貝沙羅汀。

本發(fā)明的貝沙羅汀偶合物自組裝或與磷脂共組裝形成的納米脂質(zhì)體易于被腫瘤細(xì)胞攝取。

附圖說明

圖1為貝沙羅汀甘油磷脂酰膽堿的合成路線圖。

圖2為貝沙羅汀已二醇丁二酰甘油磷脂酰膽堿的合成路線圖。

圖3為貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰膽堿合成路線圖。

圖4為貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯二甘醇酰甘油磷脂酰膽堿合成路線圖。

圖5為貝沙羅汀乙二醇己二酰甘油磷脂酰膽堿合成路線圖。

圖6為貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰膽堿合成路線圖。

圖7貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰膽堿納米顆粒(a)動態(tài)光散射測量的粒徑分布圖和(b)透射電鏡照片。

圖8為貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰膽堿結(jié)構(gòu)圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和說明書附圖對本發(fā)明做更進(jìn)一步地解釋。下列實(shí)施例僅用于說明發(fā)明，但并不用來限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。

本發(fā)明的貝沙羅汀偶合物，是具有下列結(jié)構(gòu)式(1)或(2)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：

其中，X是(CH₂)_mOCO(CH₂)_n或(CH₂)_pSS(CH₂)_pOCO(CH₂)_q，m為2～6的正整數(shù)，n為1～4的正整數(shù)，p為2～4的正整數(shù)，q為1～4的正整數(shù)。

本發(fā)明的藥物組合物，是具有結(jié)構(gòu)式(1)或(2)的貝沙羅汀偶合物與藥效學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的藥物組合物是片劑、錠劑、丸劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、口服液、凝膠劑、懸浮液、乳劑或注射劑、栓劑、貼劑。藥物組合物是粒徑10-1000納米的納米顆?；蛑|(zhì)體，該藥物組合物中還包括助劑，所述的助劑是磷脂。

本發(fā)明的藥物組合物可以注射給藥、口服給藥、鼻腔給藥、肺部吸入給藥。

本發(fā)明的貝沙羅汀偶合物在制備治療皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、牛皮癬、卡波氏肉瘤、前列腺癌、頑固性手癬藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的貝沙羅汀偶合物在制備治療和/或預(yù)防阿爾茨海默病藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的貝沙羅汀偶合物能夠組裝為納米顆?；蚣{米脂質(zhì)體，具有優(yōu)良的生物相容性、儲存穩(wěn)定性及降解性。

本發(fā)明中提供合成貝沙羅汀-甘油磷脂酰膽堿化合物的方法，以貝沙羅汀或貝沙羅汀取代酯與甘油磷脂酰膽堿(GPC)為反應(yīng)原料，在催化劑和縛酸劑作用下，采用非質(zhì)子溶劑，制得維貝沙羅汀偶合物。

以下為制備過程中使用的部分試劑和方法的代號：

DCC N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺

DMAP 4-二甲氨基吡啶

CDI N,N'-羰基二咪唑

DMSO 二甲亞砜

GPC 磷甘油酰膽堿

DBU 1,5-二氮雜二環(huán)[5.4.0]十一-5-烯

Bex 貝沙羅汀

MS 質(zhì)譜法

TLC 簿層色譜法

藥物血漿蛋白結(jié)合率的測量方法(藥學(xué)學(xué)報，2010，45(3):343-346)：

平衡透析法將空白透析液浸泡后的透析袋一端折疊用線結(jié)扎，將空白血漿2mL加入透析袋，透析袋內(nèi)留一小空氣泡，將透析袋另一端扎緊,使其懸浮于盛有20mL透析外液的試管中，調(diào)整透析袋的高度，使其內(nèi)外液面保持同一水平，并避免透析袋貼壁。透析外液的藥物質(zhì)量濃度分別為2、5和10μg·mL^-1，將該試管于4℃放置至藥物擴(kuò)散平衡。透析結(jié)束后，用10％高氯酸溶液檢查透析外液是否有蛋白漏出，有漏出者該樣品作廢。

蛋白結(jié)合率測定分別測定透析袋內(nèi)藥物質(zhì)量濃度A(總質(zhì)量濃度)和透析外液藥物質(zhì)量濃度B(游離藥物質(zhì)量濃度)，根據(jù)公式F＝(A-B)/A計算血漿蛋白結(jié)合率。采用Agilent 1100高效液相色譜儀測量藥物濃度：Zorbax SB-C18色譜柱(150mm×4.6mm ID，5μm)，流動相為甲醇/水，97/3，流速為1.0ml min-1，柱溫25℃，紫外檢測波長254nm，柱溫為30℃，檢測波長為286nm，進(jìn)樣量為10μL。

對照例

貝沙羅汀血漿蛋白結(jié)合率的測量

采用如上平衡透析法測量貝沙羅汀的血漿蛋白結(jié)合率為98.5％。

實(shí)施例1：

貝沙羅汀甘油磷脂酰膽堿的合成(合成路線見圖1)

稱取2.9mmol貝沙羅汀于50ml單口燒瓶中，量入10ml三氯甲烷攪拌充分溶解。室溫下加入1.2mmol CDI混合均勻，反應(yīng)1～2h，TLC(薄層色譜法)檢測跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。加入1.2mmol GPC于反應(yīng)體系內(nèi)，滴加2.9mmol DBU，攪拌混合均勻。室溫下繼續(xù)反應(yīng)48h。TLC顯示反應(yīng)完成后，通過柱層析方法純化產(chǎn)物，制得貝沙羅汀甘油磷脂酰膽堿，為白色結(jié)晶固體，產(chǎn)率80％。

¹H NMR(Bruker DPX 500MHz,CD₃OH)δ7.96(4H,d,J＝0.40Hz),7.35(4H,t,J＝0.40Hz),7.14(4H,m,J＝0.40Hz),5.88(2H,dd,J＝0.40Hz),5.64(1H,m,J＝0.40Hz),5.27(2H,dd,J＝0.40Hz),4.75(1H,dd,J＝0.40Hz),4.62(1H,dd,J＝0.40Hz),4.26(4H,m),3.61(2H,t,J＝0.40Hz),3.20(9H,s),1.92(6H,s),1.74(8H,s),1.30ppm(24H,d,J＝0.40Hz).¹³C NMR(CD₃OD:CDCl₃ 1:1)δ166.37,149.09,146.4,144.35,142.26,137.93,132.54,129.74,128.32,127.96,127.86,126.55,116.71,71.83,66.35,63.70,63.18,59.01,53.89,35.07,33.81,31.60,19.48ppm。MS[M+H]⁺m/z，918.50(計算值918.20)。

采用平衡透析法測量貝沙羅汀甘油磷脂酰膽堿的血漿蛋白結(jié)合率為25.2％。

實(shí)施例2：

貝沙羅汀已二醇丁二酰甘油磷脂酰膽堿的合成(合成路線見圖2)

稱取1g(2.9mmol)貝沙羅汀于50ml單口燒瓶中，量入10ml三氯甲烷攪拌充分溶解。室溫下加入3mmol DCC混合均勻，反應(yīng)1～2h。加入2.5mmol己二醇于反應(yīng)體系內(nèi)，滴加2.9mmol DMAP，攪拌混合均勻。室溫下繼續(xù)反應(yīng)48h。通過柱層析方法純化產(chǎn)物，制得貝沙羅汀己二醇單酯，為白色結(jié)晶固體，產(chǎn)率82％。

稱取1.6mmol貝沙羅汀己二醇單酯于100mL圓底燒瓶中，加入20mL CH₂Cl₂攪拌使之完全溶解。將充分溶解于10mL CH₂Cl₂中10.0mmol丁二酸酐緩慢加入到貝沙羅汀酰己二醇單酯溶液中，攪拌使反應(yīng)物混合均勻。室溫下反應(yīng)3～4h，TLC檢測跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。TLC顯示反應(yīng)結(jié)束后，向圓底燒瓶內(nèi)加入1.5mmol CDI，室溫下反應(yīng)2h，活化結(jié)束。向體系內(nèi)加入0.4mmol GPC和1.00mmol DBU，繼續(xù)反應(yīng)48h。TLC顯示反應(yīng)結(jié)束后，通過柱層析方法純化產(chǎn)物，制得貝沙羅汀已二醇丁二酰甘油磷脂酰膽堿，為白色結(jié)晶固體，產(chǎn)率50％。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.96(4H,d,J＝0.40Hz),7.35(4H,t,J＝0.40Hz),7.14(4H,m,J＝0.40Hz),5.84(2H,m,J＝0.40Hz),5.35(2H,dd,J＝0.40Hz),5.27(1H,t,J＝0.40),4.73(1H,t,J＝0.40),4.42(2H,t,J＝0.40),4.33(4H,t,J＝0.40Hz),4.13(4H,t,J＝0.40Hz),4.06(1H,t,J＝0.40),3.86(2H,d,J＝0.40),3.51(2H,t,J＝0.40),3.41(9H,s),2.70(8H，dd，J＝0.40)，1.96(6H,s),1.80(4H,t,J＝0.40Hz),1.72(8H,s),1.62(4H,t,J＝0.40Hz)，1.57(8H,s)，1.48(2H，t,J＝0.40),1.30ppm(24H,d,J＝0.40Hz).¹³C NMR(500MHz,CDCl₃)δ172.34,171.90,166.45,149.18,145.50,144.31,142.29,138.02,132.66,129.57,129,23,128.00,126.52,116.67,71.42,66.85,64.74,64.70,63.38,63.30,61.49,59.02,54.36,34.92,33.96,31.90,28.91,28.22,25.69,19.87ppm。MS(ESI-MS,Agilent 1260-6224)[M+H]⁺m/z，1318.70(計算值1317.50)，[M+Na]⁺m/z，1340.68.

采用平衡透析法測量貝沙羅汀已二醇丁二酰甘油磷脂酰膽堿的血漿蛋白結(jié)合率為20.2％。

實(shí)施例3：

貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰膽堿的合成(合成路線見圖3)

稱取1g(2.9mmol)貝沙羅汀于50ml單口燒瓶中，量入10ml三氯甲烷攪拌充分溶解。室溫下加入3mmol DCC混合均勻，反應(yīng)1～2h。加入2.5mmol二硫代二乙二醇于反應(yīng)體系內(nèi)，滴加2.9mmol DMAP，攪拌混合均勻。室溫下繼續(xù)反應(yīng)48h。通過柱層析方法純化產(chǎn)物，制得貝沙羅汀己二醇單酯，為白色結(jié)晶固體，產(chǎn)率75％。

稱取1.5mmol貝沙羅汀二硫代二乙二醇單酯于100mL圓底燒瓶中，加入20mL CH2Cl2攪拌使之完全溶解。將充分溶解于10mL CH2Cl2中10.0mmol丁二酸酐緩慢加入到貝沙羅汀二硫代二乙二醇單酯溶液中，攪拌使反應(yīng)物混合均勻。室溫下反應(yīng)3～4h。向圓底燒瓶內(nèi)加入1.5mmol CDI，室溫下反應(yīng)2h，活化結(jié)束。向體系內(nèi)加入0.35mmol GPC和1.00mmol DBU，繼續(xù)反應(yīng)48h。通過柱層析方法純化產(chǎn)物，制得貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰膽堿，為白色結(jié)晶固體，產(chǎn)率58％。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.96(4H,d,J＝0.40Hz),7.36(4H,t,J＝0.40Hz),7.14(4H,m,J＝0.40Hz),5.85(2H,m,J＝0.40Hz),5.32(2H,dd,J＝0.40Hz),5.28(1H,t,J＝0.40),4.73(1H,t,J＝0.40),4.33(4H,t,J＝0.40Hz),4.13(4H,t,J＝0.40Hz),4.06(1H,t,J＝0.40),3.51(2H,t,J＝0.40),3.41(9H,s),2.71(8H，dd，J＝0.40)，1.96(6H,s),1.80(4H,t,J＝0.40Hz),1.72(8H,s),1.62(4H,t,J＝0.40Hz)，1.57(8H,s)，1.30ppm(24H,d,J＝0.40Hz).¹³C NMR(500MHz,CDCl₃)δ172.34,171.91,166.45,149.18,145.50,142.29,138.02,132.66,129.57,129,23,128.00,126.52,116.67,71.42,66.85,64.70,63.38,63.30,61.49,59.02,54.36,34.92,33.96,31.90,28.91,28.22,25.69,19.75ppm。MS(ESI-MS,Agilent 1260-6224)[M+H]⁺m/z，1391.90。

采用平衡透析法測量貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰膽堿的血漿蛋白結(jié)合率為18.4％。

實(shí)施例4：

貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯二甘醇酰甘油磷脂酰膽堿的合成(合成路線見圖4)

稱取2.0mmol貝沙羅汀二硫代二乙二醇單酯于100mL圓底燒瓶中，加入20mL CH2Cl2攪拌使之完全溶解。將充分溶解于10mL CH2Cl2中10.0mmol二甘醇酐緩慢加入到貝沙羅汀二硫代二乙二醇單酯溶液中，攪拌使反應(yīng)物混合均勻。室溫下反應(yīng)4h。向圓底燒瓶內(nèi)加入3mmol CDI，室溫下反應(yīng)2h，活化結(jié)束。向體系內(nèi)加入0.6mmol GPC和2.00mmol DBU，繼續(xù)反應(yīng)48h。通過柱層析方法純化產(chǎn)物，制得貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯二甘醇酰甘油磷脂酰膽堿，為白色結(jié)晶固體，產(chǎn)率52％。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.97(4H,d,J＝0.40Hz),7.36(4H,t,J＝0.40Hz),7.14(4H,m,J＝0.40Hz),5.82(2H,m,J＝0.40Hz),5.35(2H,dd,J＝0.40Hz),5.27(1H,t,J＝0.40),4.73(1H,t,J＝0.40),4.42(2H,t,J＝0.40),4.33(4H,t,J＝0.40Hz),4.13(4H,t,J＝0.40Hz),3.41(9H,s),2.70(8H，dd，J＝0.40)，1.96(6H,s),1.80(4H,t,J＝0.40Hz),1.72(8H,s),1.62(4H,t,J＝0.40Hz)，1.57(8H,s)，1.48(2H，t,J＝0.40),1.30ppm(24H,d,J＝0.40Hz)。¹³C NMR(500MHz,CDCl₃)δ172.34,171.90,166.45,149.18,145.50,144.31,142.29,138.02,129,23,128.00,126.52,116.67,71.42,66.85,64.74,64.70,63.38,63.30,61.49,59.02,54.36,34.92,33.96,31.90,28.91,28.22,25.80ppm。MS(ESI-MS,Agilent 1260-6224)[M+H]⁺m/z，1423.85。

采用平衡透析法測量貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯二甘醇酰甘油磷脂酰膽堿的血漿蛋白結(jié)合率為16.4％。

實(shí)施例5：

貝沙羅汀乙二醇己二酰甘油磷脂酰膽堿的合成(合成路線見圖5)

稱取1g(2.9mmol)貝沙羅汀于50ml單口燒瓶中，量入10ml三氯甲烷攪拌充分溶解。室溫下加入3mmol DCC混合均勻，反應(yīng)1～2h。加入2.5mmol乙二醇于反應(yīng)體系內(nèi)，滴加2.9mmol DMAP，攪拌混合均勻。室溫下繼續(xù)反應(yīng)48h。通過柱層析方法純化產(chǎn)物，制得貝沙羅汀乙二醇單酯，為白色結(jié)晶固體，產(chǎn)率65％。

稱取1.2mmol貝沙羅汀乙二醇單酯于100mL圓底燒瓶中，加入20mL CH2Cl2攪拌使之完全溶解。將充分溶解于10mL CH2Cl2中10.0mmol己二酸酐緩慢加入到貝沙羅汀酰乙二醇單酯溶液中，攪拌使反應(yīng)物混合均勻。室溫下反應(yīng)3～4h，TLC檢測跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。TLC顯示反應(yīng)結(jié)束后，向圓底燒瓶內(nèi)加入1.5mmol CDI，室溫下反應(yīng)3h，活化結(jié)束。向體系內(nèi)加入0.5mmol GPC和1.00mmol DBU，繼續(xù)反應(yīng)48h。TLC顯示反應(yīng)結(jié)束后，通過柱層析方法純化產(chǎn)物，制得貝沙羅汀乙二醇己二酰甘油磷脂酰膽堿，為白色結(jié)晶固體，產(chǎn)率46％。[M+H]⁺m/z，1264.75。

采用平衡透析法測量貝沙羅汀乙二醇己二酰甘油磷脂酰膽堿的血漿蛋白結(jié)合率為12.6％。

實(shí)施例6：

貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰膽堿的合成(合成路線見圖6)

稱取1.5mmol貝沙羅汀二硫代二乙二醇單酯于100mL圓底燒瓶中，加入20mL CH2Cl2攪拌使之完全溶解。將充分溶解于10mL CH2Cl2中10.0mmol己二酸酐緩慢加入到貝沙羅汀二硫代二乙二醇單酯溶液中，攪拌使反應(yīng)物混合均勻。室溫下反應(yīng)3～4h。向圓底燒瓶內(nèi)加入1mmol CDI，室溫下反應(yīng)2h，活化結(jié)束。向體系內(nèi)加入0.4mmol GPC和1.00mmol DBU，繼續(xù)反應(yīng)48h。通過柱層析方法純化產(chǎn)物，制得貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰膽堿，為白色結(jié)晶固體，產(chǎn)率60％。[M+H]⁺m/z，1447.92。

采用平衡透析法測量貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰膽堿的血漿蛋白結(jié)合率為16.8％。

實(shí)施例7：

貝沙羅汀甘油磷脂酰膽堿納米顆粒的制備

取實(shí)施例1的貝沙羅汀甘油磷脂酰膽堿化合物1mmol，加入三氯甲烷20ml，60℃旋蒸干溶劑；加入20ml PBS(pH＝7.4)60℃起膜，200nm濾膜過濾，得貝沙羅汀甘油磷脂酰膽堿納米顆粒溶液。動態(tài)光散射法測量粒徑138nm。采用平衡透析法測量納米顆粒的血漿蛋白結(jié)合率為8.5％。

實(shí)施例8：

貝沙羅汀已二醇丁二酰甘油磷脂酰膽堿納米顆粒的制備

取實(shí)施例2的貝沙羅汀已二醇丁二酰甘油磷脂酰膽堿化合物1mmol，加入三氯甲烷20ml，60℃旋蒸干溶劑；加入20ml PBS(pH＝7.4)60℃起膜，200nm濾膜過濾，得貝沙羅汀已二醇丁二酰甘油磷脂酰膽堿納米顆粒溶液。納米顆粒平均粒徑156nm。采用平衡透析法測量納米顆粒的血漿蛋白結(jié)合率為7.2％。

實(shí)施例9：

貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰膽堿納米顆粒的制備

取實(shí)施例3的貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰膽堿化合物1mmol，加入三氯甲烷20ml，60℃旋蒸干溶劑；加入20ml PBS(pH＝7.4)60℃起膜，200nm濾膜過濾，得貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰膽堿納米顆粒溶液。粒徑分析結(jié)果如下圖7(a)，平均粒徑140nm，透射電鏡測量納米顆粒的形態(tài)如圖7(b)

采用平衡透析法測量納米顆粒的血漿蛋白結(jié)合率為5.3％。

實(shí)施例10：

貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰膽堿納米顆粒的制備

取實(shí)施例6的貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰膽堿化合物1mmol，加入三氯甲烷20ml，60℃旋蒸干溶劑；加入20ml PBS(pH＝7.4)60℃起膜，200nm濾膜過濾，得貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰膽堿納米顆粒溶液。納米顆粒平均粒徑162nm。采用平衡透析法測量納米顆粒的血漿蛋白結(jié)合率為5.6％。

實(shí)施例11：

貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰膽堿納米顆粒B的制備

取實(shí)施例6的貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰膽堿化合物0.1mmol、二硬脂酰磷脂酰膽堿DSPC 0.4mmol溶于10mL三氯甲烷，60℃旋蒸干溶劑；加入10ml PBS(pH＝7.4)60℃起膜，200nm濾膜過濾，得貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰膽堿納米顆粒溶液B。采用平衡透析法測量納米顆粒B的血漿蛋白結(jié)合率為4.2％。

實(shí)施例12：

貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰膽堿納米顆粒C的制備

取實(shí)施例6的貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰膽堿化合物0.1mmol、二硬脂酰磷脂酰膽堿DSPC 0.3mmol，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇DSPE-PEG-葉酸(聚乙二醇分子量2000)0.1mmol，溶于10mL三氯甲烷，60℃旋蒸干溶劑；加入10ml PBS(pH＝7.4)60℃起膜，200nm濾膜過濾，得貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰膽堿納米顆粒溶液C。采用平衡透析法測量納米顆粒C的血漿蛋白結(jié)合率為2.2％。

實(shí)施例13：

貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰膽堿納米顆粒的制備

取實(shí)施例6的貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰膽堿化合物1mmol，加入三氯甲烷20ml，60℃旋蒸干溶劑；加入20ml PBS(pH＝7.4)60℃起膜，200nm濾膜過濾，得貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯己二酰甘油磷脂酰膽堿納米顆粒溶液。納米顆粒平均粒徑163nm。采用平衡透析法測量納米顆粒的血漿蛋白結(jié)合率為6.5％。

實(shí)施例14：

貝沙羅汀偶合物納米顆粒的還原敏感降解釋藥性能

將1ml濃度為0.1mg/mL的貝沙羅汀偶合物納米顆粒溶液(實(shí)施例9的貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰膽堿納米顆粒溶液、實(shí)施例8的貝沙羅汀已二醇丁二酰甘油磷脂酰膽堿納米顆粒溶液、實(shí)施例7的貝沙羅汀甘油磷脂酰膽堿納米顆粒溶液)分別加入到10ml的PBS(pH 7.4)溶液、PBS(pH 5.0)溶液、含有3％谷胱甘肽的PBS(pH 7.4)溶液中。放置于37℃的搖床中孵育，72h后用HPLC檢測剩余的貝沙羅汀偶合物(貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰膽堿、貝沙羅汀已二醇丁二酰甘油磷脂酰膽堿、貝沙羅汀甘油磷脂酰膽堿)的含量和釋放出的貝沙羅汀的含量，結(jié)果如下表1所示。(采用Agilent 1100高效液相色譜儀測量偶合物或原藥濃度：Zorbax SB-C18色譜柱(150mm×4.6mm ID,5μm)，流動相為甲醇/水，97/3，流速為1.0ml min-1，柱溫25℃，紫外檢測波長254nm，柱溫為30℃，檢測波長為286nm，進(jìn)樣量為10μL。)

顯然，貝沙羅汀甘油磷脂酰膽堿納米顆粒溶液在中性條件下偶合物降解很少，剩余偶合物為90.3％，釋放出的原藥貝沙羅汀僅為7.5％，只有在弱酸性條件下明顯降解，剩余偶合物為30.2％，釋放出的原藥達(dá)到65.2％。

貝沙羅汀已二醇丁二酰甘油磷脂酰膽堿納米顆粒溶液在中性條件偶合物降解比貝沙羅汀甘油磷脂酰膽堿降解快，剩余偶合物為87％，釋放出的原藥貝沙羅汀達(dá)到10.3％；在pH 5弱酸性條件下快速降解，剩余的偶合物僅為15％，釋放出的原藥達(dá)到81.2％。所以，貝沙羅汀已二醇丁二酰甘油磷脂酰膽堿比貝沙羅汀甘油磷脂酰膽堿更易于降解，更有利于在弱酸性的腫瘤細(xì)胞內(nèi)釋放原藥。

貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰膽堿納米顆粒溶液具有非常好的還原敏感性，在谷胱甘肽存在下囊泡解體，偶合物快速降解釋放出原藥，達(dá)到97.5％；在pH 5.0的PBS溶液中，該偶合物降解也很快，72小時后僅剩6.5％。在中性條件下，該偶合物比較穩(wěn)定。所以，貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰膽堿具有還原敏感性，更有利于谷胱甘肽濃度較高的腫瘤細(xì)胞內(nèi)降解釋放原藥。

表1.貝沙羅汀偶合物納米顆粒體外釋藥后剩余貝沙羅汀偶合物、釋放出的原藥含量與時間的關(guān)系

實(shí)施例15：

貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰膽堿納米顆粒的細(xì)胞攝取

MCF-7細(xì)胞分為兩組，分別和負(fù)載熒光染料Cy 5.5(10μg/ml)的實(shí)施例9的貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰膽堿納米顆粒溶液和游離的Cy 5.5飽和水溶液共培養(yǎng)3h。然后，用PBS溶液洗滌細(xì)胞兩次，用4％的多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和0.1％的聚乙二醇辛基苯基醚在37℃染色15min。用激光共聚焦對細(xì)胞進(jìn)行拍攝。

結(jié)果表明，與對照組相比，包裹Cy5.5的貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰膽堿納米顆粒實(shí)驗組具有明顯的紅色熒光。這說明包裹Cy 5.5的納米顆粒能很好地被MCF-7細(xì)胞攝取。

實(shí)施例16：

貝沙羅汀甘油磷脂酰膽堿納米顆粒的細(xì)胞毒性實(shí)驗：MTT法人癌細(xì)胞殺傷試驗

藥品及試劑：小牛血清為南京生興生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DMSO分析純；RPMI1640為GIBCO產(chǎn)品。

儀器：BIORAD 680型酶標(biāo)儀。

收集生長良好的腫瘤細(xì)胞，用含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基配制成1×104/mL細(xì)胞懸液，將MCF-7和A549細(xì)胞以2×103細(xì)胞/孔的密度鋪在96孔板中，孵育24h后，加入貝沙羅汀和各種貝沙羅汀偶合物納米顆粒溶液(見下表)，濃度按等量貝沙羅汀計算分別為1.25,6.25,12.5,18.75和25μM(n＝6)。培養(yǎng)36h和72h后，每孔加入20μL的MTT溶液(5mg/mL，RPMI1640配制)，37℃放置4h。然后棄去上清液，每孔加入150μL DMSO，15min后用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(570nm)OD值。同時，以PBS組為空白對照。數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±SD(n＝6)。

細(xì)胞抑制率＝(1-實(shí)驗組吸光度值/空白組吸光度值)×100％

結(jié)果計算：以藥物的不同濃度及對細(xì)胞的抑制率作圖可得到劑量反應(yīng)曲線，從中求出半數(shù)抑制濃度(IC50)。

本發(fā)明貝沙羅汀甘油磷脂酰膽堿納米顆粒對人腫瘤細(xì)胞株的抗腫瘤活性結(jié)果如下表2所示。顯然，貝沙羅汀甘油磷脂酰膽堿納米顆粒對腫瘤細(xì)胞MCF-7細(xì)胞和A549細(xì)胞具有殺傷性，優(yōu)于原藥貝沙羅汀。貝沙羅汀已二醇丁二酰甘油磷脂酰膽堿納米顆粒的IC50值小于貝沙羅汀甘油磷脂酰膽堿納米顆粒，顯示更好的殺傷腫瘤細(xì)胞作用。貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰膽堿納米顆粒的IC值遠(yuǎn)低于前者，更好的細(xì)胞毒性主要是由于貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰膽堿納米顆粒的二硫鍵在整理細(xì)胞內(nèi)快速斷裂，釋放出高濃度的貝沙羅汀，增強(qiáng)了殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。

表2.本發(fā)明化合物對人腫瘤細(xì)胞株的抗腫瘤活性結(jié)果

MCF-7：人乳腺癌細(xì)胞；A2780：人卵巢癌細(xì)胞；HCT-8：人結(jié)腸癌細(xì)胞；A549：人肺腺癌細(xì)胞。

實(shí)施例17

貝沙羅汀甘油磷脂酰膽堿納米顆粒對β-淀粉樣蛋白(Aβ)誘導(dǎo)的大鼠老年癡呆的抵抗作用

材料：雄性Wistar大鼠28只，體重～500g，由東南大學(xué)動物實(shí)驗中心提供，Aβ25-35，美國SIGMA公司。

方法：將28只大鼠隨機(jī)分為七組：正常組、模型組、假手術(shù)組、給藥組1(貝沙羅汀)、給藥組2(實(shí)施例7的貝沙羅汀甘油磷脂酰膽堿納米顆粒)、給藥組3(實(shí)施例8的貝沙羅汀已二醇丁二酰甘油磷脂酰膽堿納米顆粒)、給藥組4(實(shí)施例9的貝沙羅汀二硫代二乙二醇酯丁二酰甘油磷脂酰膽堿納米顆粒)，給藥組的劑量相當(dāng)于等量貝沙羅汀1mg/kg)，5只/組。

Aβ誘導(dǎo)的大鼠老年癡呆模型的建立：將1mg的Aβ25-35干粉溶于500μL無菌生理鹽水中，稀釋成2μg/μL溶液，置于CO2培養(yǎng)箱在37℃孵育72h，使其充分纖維化并聚集為聚集狀態(tài)的Aβ25-35，貯存于4℃?zhèn)溆谩Ｓ梦彀捅韧租c(40mg/kg)腹腔注射麻醉Wistar大鼠，用剃毛剪剃去大鼠頭頂?shù)拿９潭^部，常規(guī)消毒后剪開頭皮，暴露頂骨，參照大鼠腦立體定位圖譜，在頂骨上鉆兩個小孔以供注射。用微量注射器刺破硬膜，向雙側(cè)海馬區(qū)內(nèi)5min內(nèi)各緩慢注射5μL Aβ25-35(2μg/μL)，之后留針5min。注射結(jié)束后，緩慢將針拔出，封閉注射孔，最后縫合切口。假手術(shù)組注射等量的生理鹽水。術(shù)后連續(xù)肌肉注射青霉素三天，防止感染。

造模手術(shù)后第4天開始給藥，兩天一次，連續(xù)35天。給藥組按照上述劑量以靜脈注射注射方式給藥；正常組、假手術(shù)組和模型組給予等量的生理鹽水。

水迷宮試驗：采用Morris水迷宮試驗評價大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。從給藥后第31天開始，每天上午10點(diǎn)開始進(jìn)行Morris水迷宮試驗，共計4天，進(jìn)行定位航行試驗。

定位航行試驗：定位航行試驗持續(xù)四次。將平臺置于第二象限中心，大鼠依次從四個象限面向池壁入水，記錄大鼠在120s內(nèi)找到平臺所用的時間，即逃避潛伏期(EL)。所有登上平臺的大鼠應(yīng)在平臺上停留15s，使其認(rèn)知水下平臺為逃生點(diǎn)，并記憶平臺的空間位置。計算每組大鼠每天在四個象限的逃避潛伏期平均值，即平均逃避潛伏期。平均逃避潛伏期(AEL)的長短反映了大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，AEL越短說明大鼠水下平臺的空間位置學(xué)習(xí)認(rèn)知的越快。

實(shí)驗結(jié)果：水迷宮結(jié)果如下表3。正常組與假手術(shù)組無明顯差別。與正常組相比，模型組第2天至第4天的逃避潛伏期顯著延長。

與模型組相比，給藥組1的第3天和第4天的平均逃避潛伏期縮短，顯示貝沙羅汀有一定藥效；給藥組4的第3天和第4天的平均逃避潛伏期顯著縮短，與正常組相近，顯示最好的藥效。

表3貝沙羅汀甘油磷脂酰膽堿納米顆粒對Aβ25-35誘導(dǎo)的老年癡呆大鼠逃避潛伏期的影響

上述實(shí)施例僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出：對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和等同替換，這些對本發(fā)明權(quán)要求進(jìn)行改進(jìn)和等同替換后的技術(shù)方案，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。