本發(fā)明涉及中藥領域，特別涉及一種烏骨藤提取物及其用途。
背景技術：
：白血病是一類造血干細胞惡性克隆性疾病?？寺⌒园籽〖毎驗樵鲋呈Э?、分化障礙、凋亡受阻等機制在骨髓和其他造血組織中大量增殖累積，并浸潤其他組織和器官，同時正常造血受抑制。臨床可見不同程度的貧血、出血、感染發(fā)熱以及肝、脾、淋巴結腫大和骨骼疼痛。我國白血病的發(fā)病率在各種腫瘤中占第六位。其中急性淋巴細胞白血病(ALL)屬于淋巴組織惡性腫瘤，根據免疫表型將急性淋巴細胞白血病分為B細胞型、T細胞型及T/B混合型，其中T細胞型ALL(T-ALL)是以T細胞增殖失控，大量分化障礙的T細胞惡性克隆性增生、積聚，從而大量T細胞浸潤組織為特征的血液系統(tǒng)惡性疾病，占ALL的15％-25％。T-ALL患者預后差，特別是一些患兒。醫(yī)學發(fā)展到今天，多種抗腫瘤藥物聯(lián)合的化療方案及大劑量化療的臨床應用，使得T-ALL的預后相比過去有了較大改善，但總體緩解率仍是所有白血病類型中最低的，因此T-ALL的治療仍是目前白血病治療的難點和重點。由于腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多基因互相調控的過程，白血病的分子病理學機制研究也已從過往的單基因的研究逐漸轉移到多基因的信號通路調控及其信號網絡調控的研究中。烏骨藤為蘿藦科牛奶菜屬植物通光藤的藤莖，其化學成分主要有甾體酯苷、多糖、樹脂、色素、有機酸以及生物堿等，藥理作用廣泛，有抗癌、平喘、降壓、免疫調節(jié)、止痛、保肝利尿等，烏骨藤提取物在肝癌、胃癌、食管癌等消化系統(tǒng)腫瘤已有較好療效，但烏骨藤提取物在血液病中的研究仍然缺乏，療效不明確。技術實現要素：為克服現有技術的缺陷，本發(fā)明提供一種治療白血病效果良好、副作用小的烏骨藤提取物、其制備方法和用途。為解決上述技術問題，本發(fā)明一方面提供：一種含有烏骨藤提取物的藥物組合物，所述烏骨藤提取物的提取方法為：取烏骨藤干燥藤莖，粉碎，用體積比為50-95％乙醇浸提2-4次，將浸提液合并減壓蒸餾，濃縮并回收乙醇，得到烏骨藤粗提物浸膏，將浸膏加入蒸餾水制成混懸液后加入乙酸乙酯和/或丙酮萃取，重復萃取1-3次，有機相減壓濃縮，即得烏骨藤提取物。在優(yōu)選的實施方式中，所述藥物組合物還含有其他活性成分。在優(yōu)選的實施方式中，所述其他活性成分為雷公藤甲素、雷公藤乙素中的一種或多種。在優(yōu)選的實施方式中，所述藥物組合物還包含一種或多種藥學上可接受的輔料。在優(yōu)選的實施方式中，所述藥物組合物的劑型為片劑、膠囊劑、注射液、凍干粉針。本發(fā)明第二方面提供：一種烏骨藤提取物的制備方法：取烏骨藤干燥藤莖，粉碎，用體積比為50-95％乙醇浸提2-4次，將浸提液合并減壓蒸餾，濃縮并回收乙醇，得到烏骨藤粗提物浸膏，將浸膏加入蒸餾水制成混懸液后加入乙酸乙酯和/或丙酮萃取，重復萃取1-3次，有機相減壓濃縮，即得烏骨藤提取物。在優(yōu)選的實施方式中，所述萃取部分使用的有機溶劑為乙酸乙酯和丙酮的混合物。在優(yōu)選的實施方式中，所述有機溶劑為乙酸乙酯和丙酮體積比為1：1的混合物。在優(yōu)選的實施方式中，所述浸提使用的乙醇優(yōu)選體積比為75％的乙醇，浸提次數優(yōu)選為4次，每次5天。在優(yōu)選的實施方式中，所述萃取步驟中加入的蒸餾水與有機溶劑的體積比為5:1～1:1，優(yōu)選為4:1；重復萃取次數優(yōu)選為3次。本發(fā)明第三方面提供：上述含有烏骨藤提取物的藥物組合物在制備治療白血病藥物中的應用。在優(yōu)選的實施方式中，所述的白血病為急性淋巴細胞白血病。在優(yōu)選的實施方式中，所述的白血病與人早幼粒白血病細胞株HL-60相關。在優(yōu)選的實施方式中，所述的白血病與人髓性白血病細胞株K562相關。本發(fā)明取得的優(yōu)點和積極效果：1、本發(fā)明通過優(yōu)化烏骨藤的提取方法，最終確定先采用一定濃度乙醇提取，在使用乙酸乙酯和/或丙酮萃取的方法制備烏骨藤提取物。使用上述方法獲得的烏骨藤提取物對多種白血病細胞株均具有顯著的增殖抑制作用，為新型抗癌藥物的研發(fā)奠定了基礎。2、本發(fā)明意外發(fā)現，將烏骨藤提取物與雷公藤甲素/雷公藤乙素等其他抗癌活性成分聯(lián)合使用，治療白血病的效果更佳，證實烏骨藤提取物與其他抗癌活性成分能產生協(xié)同增效效果，對使用復合制劑臨床治療白血病具有一定的指導意義。具體實施方式下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明中所使用的原料，如無特殊說明，均為常規(guī)的市售產品；本發(fā)明中所使用的方法，如無特殊說明，均為本領域的常規(guī)方法。烏骨藤提取物的制備實施例1：取烏骨藤干燥藤莖10kg，粉碎，95％乙醇浸提4次，每次5天，將浸提液合并減壓蒸餾濃縮并回收乙醇，得到烏骨藤粗提物浸膏。浸膏加入2L蒸餾水制成混懸液后加入0.5L乙酸乙酯萃取，重復萃取3次，有機相減壓濃縮得到烏骨藤提取物A1。實施例2：取烏骨藤干燥藤莖10kg，粉碎，75％乙醇浸提4次，每次5天，將浸提液合并減壓蒸餾濃縮并回收乙醇，得到烏骨藤粗提物浸膏。浸膏加入2L蒸餾水制成混懸液后加入0.5L乙酸乙酯萃取，重復萃取3次，有機相減壓濃縮得到烏骨藤提取物A2。實施例3：取烏骨藤干燥藤莖10kg，粉碎，50％乙醇浸提4次，每次5天，將浸提液合并減壓蒸餾濃縮并回收乙醇，得到烏骨藤粗提物浸膏。浸膏加入2L蒸餾水制成混懸液后加入0.5L乙酸乙酯萃取，重復萃取3次，有機相減壓濃縮得到烏骨藤提取物A3。實施例4：取烏骨藤干燥藤莖10kg，粉碎，75％乙醇浸提4次，每次5天，將浸提液合并減壓蒸餾濃縮并回收乙醇，得到烏骨藤粗提物浸膏。浸膏加入2L蒸餾水制成混懸液后加入0.5L丙酮萃取，重復萃取3次，有機相減壓濃縮得到烏骨藤提取物A4。實施例5：取烏骨藤干燥藤莖10kg，粉碎，75％乙醇浸提4次，每次5天，將浸提液合并減壓蒸餾濃縮并回收乙醇，得到烏骨藤粗提物浸膏。浸膏加入2L蒸餾水制成混懸液后加入0.25L乙酸乙酯和0.25L丙酮的混合溶劑萃取，重復萃取3次，有機相減壓濃縮得到烏骨藤提取物A5。實施例6：取烏骨藤干燥藤莖10kg，粉碎，75％乙醇浸提4次，每次5天，將浸提液合并減壓蒸餾濃縮并回收乙醇，得到烏骨藤提取物A6。試驗例1：烏骨藤提取物治療白血病效果初篩為篩選烏骨藤提取物對人白血病細胞的抑制作用，分別選擇人早幼粒白血病細胞株HL-60和人髓性白血病細胞株K562進行試驗。一、人早幼粒白血病細胞株HL-60試驗當HL-60細胞長滿時，分別給予相同體積的實施例1-6制備的烏骨藤提取物A1-A6，濃度均為10μg/ml，未加烏骨藤提取物組作為空白對照組，各組孵育24小時后采用新型四氮唑鹽(MTS)還原法測定對烏骨藤提取物對HL-60細胞增殖的影響，記錄吸光度(OD)值，并計算各組烏骨藤提取物對HL-60細胞的抑制率。每組烏骨藤提取物均實驗重復3次，取3次實驗數據的平均值作為最終抑制率結果，具體結果見表1。表1烏骨藤提取物對HL-60細胞增殖抑制率實驗組HL-60細胞增殖抑制率A142.3％A250.7％A345.9％A455.8％A561.2％A621.8％試驗結果顯示，烏骨藤提取物A1-A5對HL-60細胞均有顯著的增殖抑制作用，而未采用有機溶劑萃取的烏骨藤提取物A6對HL-60細胞的增殖抑制作用較小，證實僅采用乙醇提取后的烏骨藤提取物藥理效果較弱。此外，與其他實驗組相比，A2、A4和A5組增殖抑制作用更加明顯，其中尤以A5組最佳，相比其他實驗組具有統(tǒng)計學顯著性差異，說明采用乙酸乙酯和丙酮混合物作為萃取溶劑的方法得到的烏骨藤提取物藥效最好。二、人髓性白血病細胞株K562試驗當K562細胞長滿時，分別給予相同體積的實施例1-6制備的烏骨藤提取物A1-A6，濃度均為10μg/ml，未加烏骨藤提取物組作為空白對照組，各組孵育24小時后采用新型四氮唑鹽(MTS)還原法測定對烏骨藤提取物對K562細胞增殖的影響，記錄吸光度(OD)值，并計算各組烏骨藤提取物對K562細胞的抑制率。每組烏骨藤提取物均實驗重復3次，取3次實驗數據的平均值作為最終抑制率結果，具體結果見表2。表2烏骨藤提取物對K562細胞增殖抑制率實驗組K562細胞增殖抑制率A138.7％A252.4％A343.6％A449.2％A559.9％A624.7％試驗結果顯示，烏骨藤提取物A1-A5對K562細胞均有顯著的增殖抑制作用，而未采用有機溶劑萃取的烏骨藤提取物A6對HL-60細胞的增殖抑制作用較小。此外，與其他實驗組相比，A2和A5組增殖抑制作用更加明顯，其中尤以A5組最佳，相比其他實驗組具有統(tǒng)計學顯著性差異，說明采用乙酸乙酯和丙酮混合物作為萃取溶劑的方法得到的烏骨藤提取物藥效最好。試驗例2：烏骨藤提取物與其他藥物聯(lián)用治療白血病效果為驗證烏骨藤提取物與其他抗癌藥物對人白血病細胞的聯(lián)合抑制作用，分別選擇人早幼粒白血病細胞株HL-60和人髓性白血病細胞株K562進行試驗。當HL-60和K562細胞長滿時，分別給予相同體積的10μg/ml烏骨藤提取物A5、10μg/ml雷公藤甲素、10μg/ml雷公藤乙素、5μg/ml烏骨藤提取物A5+5μg/ml雷公藤甲素、5μg/ml烏骨藤提取物A5+5μg/ml雷公藤乙素，未加藥物組作為空白對照組，各組孵育24小時后采用新型四氮唑鹽(MTS)還原法測定對烏骨藤提取物對HL-60和K562細胞增殖的影響，記錄吸光度(OD)值，并計算各組烏骨藤提取物對HL-60和K562細胞的抑制率。每組烏骨藤提取物均實驗重復3次，取3次實驗數據的平均值作為最終抑制率結果，具體結果見表3。表3烏骨藤提取物與其他藥物聯(lián)合對HL-60和K562細胞的增殖抑制率試驗結果顯示，各實驗組對HL-60和K562細胞均具有明顯的增殖抑制作用。此外，在給藥量相同的前提下，烏骨藤提取物A5與雷公藤甲素、雷公藤乙素聯(lián)合使用對白血病細胞的增殖抑制均產生了協(xié)同增效作用，細胞增殖抑制率均顯著高于單獨使用相同用量的烏骨藤提取物A5、雷公藤甲素或雷公藤乙素，產生了難以預料的優(yōu)異增殖抑制效果。試驗例3：烏骨藤提取物治療白血病患者臨床試驗效果采用本發(fā)明實施例5制備的烏骨藤提取物對白血病患者臨床治療效果如下：病歷1：何某某，男，16歲，浙江杭州人。一年前診斷為急性粒細胞白血病，實驗室檢查：紅細胞2.91*1012/L，血小板60*109/L，白細胞92.0*109/L，其中原粒細胞占43％。骨髓象：有核細胞顯著增生，原粒加早幼粒細胞為84％。經化療藥物和本發(fā)明藥物聯(lián)合治療，七個療程后，病情好轉，不再出血，體溫正常，食欲增加，臨床檢查無白細胞浸潤表現，復查血象：紅細胞4.2*1012/L，血小板210*109/L，白細胞1.6*109/L，其中原粒1％，早幼粒2％，晚幼粒3％，桿核7％，分葉核30％；骨髓象復查：有核細胞顯著增生，原粒加早幼粒5.5％?；颊咦允龇幒鬅o明顯不適。病歷2：段某某，男，44歲，一年前診斷為淋巴細胞性白血病，實驗室檢查：紅細胞1.2*1012/L，白細胞1.08*1010/L，血紅蛋白71g/L，血小板計數98*109/L。骨髓象：骨髓有核細胞增生活躍，粒系以成熟期細胞為主；紅系中晚幼紅常見；偶見幼稚巨細胞，血小板少見。經化療藥物和本發(fā)明藥物聯(lián)合治療，五個療程后，病情好轉，不再出血，體溫正常，食欲增加，復查血象：紅細胞3.2*1012/L，白細胞3.2*109/L，血紅蛋白115g/L，血小板計數110*109/L。骨髓象復查：骨髓有核細胞增生活躍，可見粒系各期，以中晚期幼細胞為主，紅系以中晚期幼紅居多，可見血小板成堆。病歷3：李某某，女，13歲，診斷為急性淋巴細胞白血病，實驗室檢查：紅細胞2.8*1012/L，白細胞2.5*109/L，血紅蛋白70g/L，血小板計數67*109/L。骨髓象：增生明顯活躍，淋巴系增生異常，原始及幼稚淋巴細胞76％，血小板散在可見。確診后經化療藥物(VDLDEX)和本發(fā)明藥物聯(lián)合治療，七個療程后，骨髓象完全緩解。試驗結論：本發(fā)明制備的烏骨藤提取物能對臨床急性白血病患者的淋巴細胞、人早幼粒白血病細胞株HL-60、人髓性白血病細胞株K562等均起到穩(wěn)定、顯著的抑制增殖，促進凋亡等作用；同時對正常人淋巴細胞安全，毒性小，適合作為白血病的治療藥物。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。當前第1頁1 2 3