本發(fā)明涉及骨質(zhì)疏松動物模型領(lǐng)域，具體而言，涉及一種制備斑馬魚骨質(zhì)疏松模型的方法及其茜素紅染色方法。
背景技術(shù)：
：骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少、骨組織顯微結(jié)構(gòu)異常和骨折危險性增加為特征的一類病癥。該病癥是老年人常見病、多發(fā)病，隨著人口老齡化進程的加快，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率越來越高。因此，構(gòu)建有效的骨質(zhì)疏松篩藥模型，對骨質(zhì)疏松癥的藥物治療和發(fā)現(xiàn)安全有效的新藥具有重要意義。目前，用于制備骨質(zhì)疏松模型的動物主要有大鼠、小鼠和斑馬魚；由于個體小、生長周期快、飼養(yǎng)和維護成本低，相對于大鼠和小鼠而言，斑馬魚作為骨質(zhì)疏松模型更具有優(yōu)勢?，F(xiàn)階段，構(gòu)建斑馬魚骨質(zhì)疏松模型時主要使用的藥物是潑尼松龍和地塞米松，但上述兩種藥物屬于糖皮質(zhì)激素類藥物，在造模時極易因為劑量把握不準(zhǔn)而使免疫抑制過強導(dǎo)致斑馬魚胚胎致畸、致死率高。目前還有研究發(fā)現(xiàn)，去鐵銨或鐵調(diào)素可修復(fù)高鐵造成的斑馬魚骨骼發(fā)育缺陷，但高鐵誘導(dǎo)的幼魚骨質(zhì)疏松模型是否能夠用于篩選鐵螯合劑以外的其他治療骨質(zhì)疏松的藥物尚未可知。另外，現(xiàn)階段用于制模的斑馬魚一般選擇幼魚階段的斑馬魚，與骨質(zhì)疏松癥發(fā)病時患者所處的生理階段(骨質(zhì)疏松癥主要發(fā)生在成年尤其是中老年階段)差異大，不能很好地模擬骨質(zhì)疏松癥。因此，本領(lǐng)域亟待提出一種制備骨質(zhì)疏松模型的方法，能夠快速、高效地制備用于廣泛評價和篩選不同種類的治療骨質(zhì)疏松藥物的模型。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一目的在于提供一種制備斑馬魚骨質(zhì)疏松模型的方法，由該方法制備的模型能夠用于廣譜地篩選各種治療骨質(zhì)疏松的藥物。本發(fā)明的第二目的在于提供一種對上述斑馬魚骨質(zhì)疏松模型進行茜素紅染色的方法，該方法能夠穩(wěn)定、高效地對斑馬魚幼魚進行染色。本發(fā)明的第三目的在于提供一種對上述斑馬魚骨質(zhì)疏松模型進行茜素紅染色的方法，該方法能夠穩(wěn)定、高效地對斑馬魚成魚進行染色。為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：本發(fā)明涉及一種制備斑馬魚骨質(zhì)疏松模型的方法，所述方法包括用Fe3+溶液處理斑馬魚的步驟，其中，所述溶液中Fe3+的摩爾濃度大于0.8mmol/L。在上述制備方法中，本發(fā)明使用Fe3+溶液處理斑馬魚。與潑尼松龍和地塞米松的高致畸率和高致死率不同，F(xiàn)e3+溶液相對溫和，用Fe3+溶液、甚至是高濃度的Fe3+溶液處理斑馬魚也基本不會導(dǎo)致斑馬魚致畸或致死。其次，阿侖膦酸鈉(不屬于鐵螯合劑，用于治療骨質(zhì)疏松，但作用機制尚不清楚)能夠修復(fù)由本發(fā)明上述方法制備而成的骨質(zhì)疏松模型，表明本發(fā)明上述方法制備的模型雖然是利用高鐵沉積制備而成，但鐵螯合劑以外的其他治療骨質(zhì)疏松癥的陽性藥物也能修復(fù)該模型，因此，該模型能夠廣譜地用于篩選各種不同的治療骨質(zhì)疏松癥的藥物。本發(fā)明上述方法使用高濃度的Fe3+溶液處理斑馬魚，不但顯著降低斑馬魚骨骼礦化面積，誘使斑馬魚骨密度顯著降低，還引發(fā)軟骨發(fā)育缺陷，降低骨骼調(diào)控相關(guān)基因Bgp、Sox9b、col1a2和col10ala的表達。因此，與一般骨質(zhì)疏松模型相比，本發(fā)明上述方法制備的斑馬魚模型的總骨量損失更多，所具備的骨質(zhì)疏松的特征更突出、明顯。在一些實施方式中，所述溶液中Fe3+的摩爾濃度為0.8～1.2mmol/L，優(yōu)選1mmol/L。本發(fā)明上述方法對溶液中Fe3+濃度做出進一步優(yōu)選，采用該優(yōu)選的Fe3+溶液能夠進一步降低斑馬魚骨骼的硬骨礦化面積、軟骨面積以及骨骼調(diào)控相關(guān)基因Bgp、Sox9b、col1a2和col10ala的表達，使斑馬魚所具備的骨質(zhì)疏松癥狀更突出。在一些實施方式中，所述Fe3+溶液包括選自枸櫞酸鐵銨溶液、FeCl3溶液、硫酸鐵銨溶液中的一種或多種，優(yōu)選地，所述Fe3+溶液為枸櫞酸鐵銨溶液。在一些實施方式中，所述Fe3+溶液為枸櫞酸鐵銨溶液，所述枸櫞酸鐵銨溶液的濃度大于400μg·ml-1，優(yōu)選為400～600μg·ml-1，特別優(yōu)選500μg·ml-1。在一些實施方式中，所述斑馬魚為幼魚。在一些實施方式中，所述斑馬魚為成魚。本發(fā)明上述方法選擇斑馬魚成魚為枸櫞酸鐵銨的處理對象，由于成魚在進行藥物處理時已經(jīng)發(fā)育完全，且活力和抵抗力也高于幼魚，因此，以成魚為制模對象能夠進一步降低制模過程中斑馬魚的致畸率和致死率。更重要地是，該模型是在骨骼發(fā)育完成之后的成年階段誘導(dǎo)出現(xiàn)骨質(zhì)疏松的癥狀，與骨質(zhì)疏松病癥發(fā)病時所處的階段和骨骼狀態(tài)更為接近，因此，與幼魚模型相比，本發(fā)明上述方法制備的成魚模型能夠更好地模擬骨質(zhì)疏松癥，在進行藥物篩選時獲得更好的篩藥效果。在一些實施方式中，所述斑馬魚為三月齡斑馬魚成魚。在一些實施方式中，所述方法具體包括以下步驟：將受精后24～72h的幼魚暴露在Fe3+溶液中培養(yǎng)3～5d；或者，將成魚暴露在Fe3+溶液中培養(yǎng)10～20d。在一些實施方式中，所述方法具體包括以下步驟：將受精后48h的幼魚暴露在Fe3+溶液中培養(yǎng)4d；或者，將成魚暴露在Fe3+溶液中培養(yǎng)15d，優(yōu)選地，所述成魚為三月齡斑馬魚。在一些實施方式中，在將幼魚暴露在Fe3+溶液中培養(yǎng)的期間，每隔10～14h重新更換Fe3+溶液，優(yōu)選每隔12h重新更換Fe3+溶液；或者，在將成魚暴露在Fe3+溶液中培養(yǎng)的期間，每隔18～36h重新更換Fe3+溶液，優(yōu)選每隔24h重新更換Fe3+溶液。本發(fā)明還涉及對上述斑馬魚骨質(zhì)疏松模型進行茜素紅染色的方法，所述方法包括以下步驟：(1)用脫色素液脫去斑馬魚骨質(zhì)疏松模型的色素，所述斑馬魚為斑馬魚幼魚；(2)用染色工作液對幼魚進行染色，所述工作液的組分包括茜素紅、氫氧化鉀、乙醇和水；優(yōu)選地，所述工作液中茜素紅的質(zhì)量分數(shù)為0.003～0.005％，進一步優(yōu)選為0.004％；氫氧化鉀的質(zhì)量分數(shù)為0.5～0.8％，進一步優(yōu)選0.7％，乙醇的體積分數(shù)為0.6～0.8％，進一步優(yōu)選為0.75％。本發(fā)明上述茜素紅染色方法對傳統(tǒng)的斑馬魚幼魚染色方法進行改進，在染色之前先脫去斑馬魚體內(nèi)的黑色素和黃色素，使斑馬魚透明化，從而令染色背景更干凈；并且本發(fā)明所述方法用于染色的工作液中含有乙醇和KOH，能夠進一步地吸附色素。與傳統(tǒng)染色方法相比，本發(fā)明所述染色方法具備使染色背景更干凈、染色效果更穩(wěn)定的優(yōu)點。本發(fā)明上述染色方法還對茜素紅、KOH和乙醇的含量進行優(yōu)化，提高上述工作液對斑馬魚幼魚骨骼染色的穩(wěn)定性。在一些實施方式中，上述方法還包括在步驟(1)之后，步驟(2)之前還包括甲醇梯度脫水的操作；優(yōu)選地，所述甲醇梯度脫水包括將斑馬魚依次置于溶液1、溶液2和溶液3中，其中，溶液1中包括甲醇和含吐溫的緩沖液，甲醇的體積分數(shù)為20～30％，優(yōu)選25％，含吐溫的緩沖液的體積分數(shù)是70～80％，優(yōu)選75％，所述含吐溫的緩沖液優(yōu)選為PBST或TBST；溶液2中包括甲醇和含吐溫的緩沖液，甲醇的體積分數(shù)為45～55％，優(yōu)選50％，含吐溫的緩沖液的體積分數(shù)是45～55％，優(yōu)選50％，所述含吐溫的緩沖液優(yōu)選為PBST或TBST；溶液3為100％甲醇溶液。在一些實施方式中，所述方法還包括在甲醇梯度脫水后將斑馬魚幼魚置于含DMSO和甲醇的溶液中，其中，DMSO的體積分數(shù)為15～25％，優(yōu)選20％，甲醇的體積分數(shù)為75～85％，優(yōu)選85％。在本發(fā)明的上述方法中，使用含吐溫的甲醇溶液進行梯度脫水，并將脫水后的幼魚置于含DMSO的甲醇溶液中，其中PBST和DMSO都能夠增強組織的通透性，提交染料與組織的結(jié)合度，從而提高染色效果。在一些實施方式中，上述脫色素液的組分包括KOH和H2O2，優(yōu)選地，KOH在脫色素液中的質(zhì)量分數(shù)為0.4～0.6％，優(yōu)選0.5％，H2O2在脫色素液中的質(zhì)量分數(shù)為2～4％，優(yōu)選3％。本發(fā)明還涉及一種對上述斑馬魚骨質(zhì)疏松模型進行茜素紅染色的方法，所述方法包括以下步驟：(1)固定斑馬魚骨質(zhì)疏松模型，其中所述斑馬魚骨質(zhì)疏松模型為斑馬魚成魚；(2)梯度脫水；(3)將成魚腹部剪開，用茜素紅染色液染色；(4)胰蛋白酶消化；(5)KOH溶液處理。現(xiàn)階段，本領(lǐng)域一般選取幼魚進行斑馬魚的茜素紅染色，盡管成魚所處的生理階段以及骨骼狀態(tài)更接近真實的骨質(zhì)疏松癥，但由于難以染色或染色效果不好，成魚在構(gòu)建骨質(zhì)疏松模型時通常被棄用。而本發(fā)明上述方法創(chuàng)造性地選擇斑馬魚成魚作為染色對象，并特別針對斑馬魚成魚染色效果差的技術(shù)問題，在染色過程中將成魚樣本的腹部剪開促進染料在成魚樣本中的滲透，并進一步用胰蛋白酶和KOH溶液處理樣本，極大增加樣本的透明度，從而成功實現(xiàn)斑馬魚成魚的茜素紅染色，使得斑馬魚成魚能夠成功地用于制備骨質(zhì)疏松模型。在一些實施方式中，所述步驟(3)具體包括以下步驟：將成魚置于茜素紅染色液中染色18～30h，優(yōu)選室溫下染色，染色時間優(yōu)選為24h，所述茜素紅溶液中茜素紅的質(zhì)量分數(shù)為0.4～0.6％，優(yōu)選為0.5％，pH值為7.5～8.5。在一些實施方式，所述步驟(4)具體包括將樣本置于胰蛋白酶溶液中處理2～4d，優(yōu)選在室溫下處理3d，所述胰蛋白酶溶液中胰蛋白酶的質(zhì)量分數(shù)為0.7～1.5％，優(yōu)選1％。在一些實施方式中，所述步驟(5)具體包括將樣本置于KOH溶液中處理4～6d，優(yōu)選在室溫下處理5d，所述KOH溶液中KOH的質(zhì)量分數(shù)為0.7～1.5％，優(yōu)選1％。本發(fā)明上述方法對斑馬魚成魚的茜素紅染色所涉及的關(guān)鍵參數(shù)和染色條件進行優(yōu)化，進一步提高了斑馬魚成魚的茜素紅染色效果。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：1)、本發(fā)明上述制模方法使用Fe3+溶液處理斑馬魚，與使用潑尼松龍和地塞米松的常規(guī)制模方法相比，本發(fā)明所述方法可以顯著降低斑馬魚的致畸率和致死率。2)、本發(fā)明上述方法采用高濃度Fe3+溶液處理斑馬魚，由此制備而成的斑馬魚模型不但出現(xiàn)硬骨損傷，同時軟骨也出現(xiàn)嚴重損傷，總骨量損傷增加，骨骼調(diào)控相關(guān)基因的表達量也顯著下降。因此，與常規(guī)斑馬魚模型相比，本發(fā)明所制模型的骨質(zhì)疏松特征更明顯、突出。3)、本發(fā)明上述方法制備的模型能夠篩選鐵螯合劑以外的其他治療骨質(zhì)疏松癥的藥物，該模型的應(yīng)用范圍廣，能夠用于廣譜地篩選各種治療骨質(zhì)疏松癥的藥物。4)本發(fā)明所述方法選取斑馬魚成魚制備骨質(zhì)疏松模型，進一步降低制模過程中斑馬魚的致畸率和致死率；更重要的是，與幼魚模型相比，該成魚模型所處的生理階段和骨骼狀態(tài)與真實的骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病階段和骨骼狀態(tài)更為接近，能夠更好地模擬骨質(zhì)疏松癥。5)本發(fā)明提供一種優(yōu)化后的斑馬魚幼魚茜素紅染色方法，能夠脫去黑色素和黃色素，降低染色背景，并進一步優(yōu)化染色工作液的配比，提高斑馬魚幼魚染色效果的穩(wěn)定性。6)本發(fā)明提供一種斑馬魚成魚染色方法，該染色方法克服斑馬魚成魚茜素紅染色難、染色效果不佳的缺陷，通過促進染料的滲透、增加樣本透明度以及優(yōu)化染色液配比的方式改善染色效果，成功對斑馬魚成魚進行茜素紅染色，使得斑馬魚成魚用于制備骨質(zhì)疏松模型成為可能。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1為不同濃度枸櫞酸鐵銨溶液處理后斑馬魚幼魚的茜素紅染色結(jié)果圖；圖2為不同濃度枸櫞酸鐵銨溶液處理后斑馬魚幼魚的鈣黃綠素染色結(jié)果圖；圖3為不同濃度枸櫞酸鐵銨溶液處理后斑馬魚幼魚的阿爾新藍染色結(jié)果圖；圖4為不同枸櫞酸鐵銨溶液處理后斑馬魚幼魚的骨骼標(biāo)記基因的mRNA水平表達差異；圖5為阿侖膦酸鈉對斑馬魚幼魚骨質(zhì)疏松模型的治療效果圖；圖6為枸櫞酸鐵銨溶液處理后斑馬魚成魚的茜素紅染色結(jié)果圖；圖7為阿侖膦酸鈉對斑馬魚成魚骨質(zhì)疏松模型的治療效果圖。具體實施方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例11、建立斑馬魚幼魚茜素紅染色方法：(1)配制染色所需試劑：a)茜素紅溶液：稱0.5g的茜素紅粉末溶于100ml的95％乙醇中，終濃度為0.5％；b)0.7％KOH溶液：稱取0.7gKOH固體溶解于100ml的蒸餾水中，配置成0.7％的KOH溶液。(2)茜素紅染色的具體步驟：a)樣品收集及固定：收集受精后第6天的幼魚，將幼魚置于1.5ml的EP管中，于4％PF中4℃固定過夜，不宜超過一星期；b)脫色素：吸走4％PF,用PBST洗3遍，每次5min；加入脫色素液(0.5％KOH/3％H2O2)直到黑色素及黃色素肉眼觀察不可見，中間根據(jù)需要置換1～2次溶液，整個過程需要30min～1h，為防止脫色過程中因反應(yīng)膨脹爆管，脫色素液不宜加滿整管；脫色完成后，吸走脫色素液，用PBST快速洗3遍，后加入4％PF再次4℃固定過夜；c)脫水：吸走4％PF，用PBST洗3次，每次5min；依次用25％甲醇/75％PBST、50％甲醇/50％PBST、100％甲醇溶液進行梯度洗脫，每次5min；最后置于20％DMSO/80％甲醇溶液中，保存于-20℃；d)復(fù)水和染色：將脫水過的幼魚取出，依次置換成75％、50％、25％甲醇的PBST溶液中，每次5min，最后置換成100％PBST溶液，重復(fù)2次，每次5min；吸走PBST溶液，加入工作液，即：0.5％茜素紅溶液與0.7％KOH溶液按照1:125配制而成的染色液，置于搖床上，室溫避光染12h以上；e)染色終止：吸走染色液，用PBST洗3次，每次5min；吸走PBST溶液，將幼魚置于在80％的甘油溶液中避光保存，并觀察拍照。2、建立斑馬魚成魚茜素紅染色方法：(1)配制染色所需試劑：a)茜素紅染色液：稱取5.0g茜素紅粉末，加入1L的0.5％的KOH溶液中，調(diào)pH到7.5～8.5，現(xiàn)配現(xiàn)用。b)胰蛋白酶溶液：稱取0.5g的胰蛋白酶(Trypsin)粉末溶于50ml的30％飽和硼酸鈉溶液中，再用蒸餾水補至100ml。(2)茜素紅染色的具體步驟：a)將三月齡成魚麻醉后，放入60mm的培養(yǎng)皿中，加入4％PF，4℃固定2天；b)吸走4％PF，置換成75％乙醇，室溫脫水2天，中間更換一次75％乙醇；此時，可以將腹部剪開，小心不要剪到腹鰭，以增加染色劑的滲透性；c)將脫水后的魚放入0.5％茜素紅染色液中，室溫染色24h，可放在搖床上輕微搖動；d)回收染色液，將魚用清水迅速清洗，之后浸泡在胰蛋白酶溶液中，于室溫中浸泡3天，期間胰蛋白酶溶液要置換1～2次(此步不可搖動，以防止骨骼脫落)；e)將胰蛋白酶去除干凈，加入1％KOH溶液，浸泡5天，期間要更換新鮮的1％KOH溶液，經(jīng)過此步驟，魚鱗可以用鑷子輕輕刮除；f)先保存在甘油：1％KOH為7:3的溶液中2天，最后換成100％甘油永久保存，并觀察拍照。3、設(shè)置對比例：參照公開號為CN102980981A的發(fā)明專利申請所記載的茜素紅染色方法分別對受精后第6天的斑馬魚幼魚進行染色。4、染色結(jié)果評價(1)幼魚茜素紅染色效果評價：將本發(fā)明建立的幼魚染色方法的檢測結(jié)果與對比例的染色結(jié)果進行比較，結(jié)果表明，本發(fā)明所述幼魚染色方法能夠?qū)⒂佐~色素去除完全，背景干凈，染色效果佳，而對比例的幼魚染色方法不能將色素完全去除，背景深，影響染色結(jié)果。(2)成魚茜素紅染色效果評價：本發(fā)明所述成魚染色方法能夠成功地對成魚骨骼進行茜素紅染色，成魚骨骼著色深，染色成功率高，染色效果好。實施例21、枸櫞酸鐵銨誘導(dǎo)建立斑馬魚幼魚骨質(zhì)疏松模型參照以下方法建立枸櫞酸鐵銨誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚骨質(zhì)疏松模型：以枸櫞酸鐵銨(FAC)為造模用藥，選用受精后48h的幼魚暴露于不同濃度的FAC溶液中，F(xiàn)AC濃度分別為50、100、200、500μg·ml-1，同時設(shè)普通培養(yǎng)液(HolfreterH20)為對照組，28.5℃下在6孔板中培養(yǎng)4d，至斑馬魚顱骨形成，期間每隔12h換藥。2、斑馬魚幼魚骨質(zhì)疏松模型的評價(1)致畸率和致死量統(tǒng)計：造模結(jié)束后統(tǒng)計斑馬魚幼魚的致畸率和致死率，結(jié)果參見表1。由此可見，使用枸櫞酸鐵銨進行造模時，斑馬魚幼魚的致畸率為0，其致死率也極低。表1斑馬魚幼魚致畸率和致死率FAC濃度(μg·ml-1)050100200500致畸率00000致死率5％5％5％10％12％(2)茜素紅染色：對培養(yǎng)至6d的斑馬魚骨骼進行茜素紅染色，以顯微檢測和數(shù)碼成像方法對骨骼染色區(qū)域進行定量分析，觀察其骨骼鈣化程度并進行統(tǒng)計分析，具體檢測結(jié)果參見圖1。根據(jù)圖1所示結(jié)果可知，斑馬魚幼魚用茜素紅染色后，頭骨礦化骨骼部分如脊索(NC)、孔蓋(OP)、副蝶骨(PS)、角鰓骨(CB)、角舌骨(CH)和舌骨下頷弓(Hm)呈紅色，而非骨組織耳石(Otolith，OT)部分呈棕黑色。經(jīng)過不同濃度的FAC處理后，斑馬魚頭部的染色較淺，如副蝶骨(ps)、孔蓋(op)、角舌骨(ch)和脊索(NC)等部位；與對照組相比，隨著FAC處理濃度的增加，斑馬魚頭部的染色區(qū)域逐漸減小，尤其在500μg·ml-1FAC處理組，只可見脊索，且染色面積及程度都大大減弱(圖1a)。采用專業(yè)圖像軟件計算斑馬魚的染色面積(骨礦化面積)。如圖1b所示，與對照組相比，50μg·ml-1和100μg·ml-1的FAC對斑馬魚骨骼的礦化面積影響并不顯著。但隨著FAC處理濃度的增加，斑馬魚骨骼的礦化面積是呈降低趨勢的。與對照組相比，當(dāng)FAC處理濃度為200μg·ml-1時，其骨骼的礦化面積減少明顯，具有顯著差異(p<0.01)。當(dāng)FAC處理濃度為500μg·ml-1時，其骨骼礦化面積的減少為對照組的三分之一左右，差異最為顯著(p<0.001)。由此可見，濃度為200～500μg·ml-1的FAC可誘導(dǎo)斑馬魚骨骼礦化量顯著減少，并呈濃度依賴性。采用同款軟件計算累積光密度(IOD，圖1c)，用不同濃度FAC處理，對IOD的影響與其對骨礦化面積的影響相似，且隨著FAC濃度的增加，IOD值呈現(xiàn)降低趨勢且呈現(xiàn)梯度依賴性。當(dāng)濃度提高至200～500μg·ml-1時，IOD值顯著降低。結(jié)果進一步說明，F(xiàn)AC的處理濃度為200～500μg·ml-1時，可誘使斑馬魚骨密度顯著降低，且呈濃度依賴性。(3)鈣黃綠素染色：對斑馬魚幼魚進行鈣黃綠素染色，觀察骨骼鈣化程度并計算相對熒光強度以表征骨骼鈣化程度，具體結(jié)果參見圖2。鈣黃綠素染色結(jié)果也進一步表明：隨著FAC濃度的增加，其骨骼礦化程度減弱，其鈣黃綠素染色的部位逐漸減小且熒光的強度逐漸減弱，尤其在脊椎發(fā)育上差異更明顯，在對照組中第6節(jié)脊椎已經(jīng)開始鈣化，而FAC處理組中脊椎數(shù)量逐漸減少，在500μg·ml-1FAC組，其脊椎只有一節(jié)鈣化較為完整，整體鈣化嚴重受損(圖2a)；熒光強度計算結(jié)果表明：熒光強度的表達隨著FAC濃度的增加而逐漸減弱，在200～500μg·ml-1時，其差異非常顯著(圖2b)。(4)阿爾新藍染色：對斑馬魚幼魚進行阿爾新藍染色，觀察其頭部及顱面部軟骨的發(fā)育情況，進行統(tǒng)計分析，具體結(jié)果參見圖3。如圖3所示：與對照組相比，斑馬魚頭部的麥克耳軟骨(mk)、副蝶骨(ps)、角舌骨(ch)、腭方骨(pq)、角鰓骨(cb1-5)和舌骨下頜結(jié)合弓(hm)等部位發(fā)育存在明顯缺陷，且隨著濃度增加，缺陷越明顯，發(fā)育越不完全。甚至在500μg·ml-1FAC的處理下，斑馬魚頭部的骨骼染色幾乎無信號顯示(圖3a)，說明FAC對骨骼發(fā)育有抑制作用。此外，通過圖像軟件Imageproplus6.0對圖像進行分析，計算斑馬魚的染色面積，其染色面積的變化是逐漸減少的趨勢，且在100μg·ml-1時就有顯著性差異，濃度越高差異性越明顯，呈濃度梯度依賴性(圖3b)。由此可見，F(xiàn)AC不但影響骨密度，還引發(fā)軟骨發(fā)育的嚴重缺陷。(5)mRNA的檢測：檢測成骨細胞分化特異表達的基因以及調(diào)控軟骨發(fā)育相關(guān)基因的mRNA水平變化。骨鈣素(Bglap或Bgp)，是一種由造骨細胞合成的結(jié)構(gòu)蛋白，通過促進造骨細胞鈣化為成骨細胞而參與骨骼發(fā)育，而成骨細胞是骨形成的主要功能細胞，負責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化。Sox9b調(diào)控軟骨形成的重要轉(zhuǎn)錄因子，col1a2、col10a1a是軟骨標(biāo)記基因，參與骨膜內(nèi)成骨及軟骨內(nèi)成骨的調(diào)控過程。通過半定量檢測上述基因的mRNA表達，結(jié)果如圖4所示：隨著FAC處理濃度的增加，bgp基因電泳條帶的亮度逐漸減弱，尤其在500μg·ml-1FAC組減弱尤為明顯，說明其mRNA表達隨著FAC濃度提高而下調(diào)(圖4a)。對條帶進行定量分析，計算bgp的相對表達量。與對照組相比，在低濃度FAC處理組，上述幾個基因的mRNA表達量降低均沒有顯著差異。當(dāng)FAC處理濃度為500μg·ml-1時，sox9b和col10a1a的mRNA表達水平下降至對照組三分之一(圖4b,c)；BGP和col1a2的表達量下降為對照組的一半水平，差異都非常顯著(圖4d，e)。實施例3阿侖膦酸鈉能良好地修復(fù)FAC誘導(dǎo)的幼魚骨質(zhì)疏松癥幼魚修復(fù)：收集受精后48h的斑馬魚幼魚隨機分成4組，每組至少30枚，分別為：對照組即正常的養(yǎng)魚水培養(yǎng)至第10天；造模組即500μg·ml-1FAC處理至第10天；陰性藥對照組即FAC處理4天，再換成H2O培養(yǎng)4天；陽性藥修復(fù)組即FAC處理4天，再換成0.1％的陽性藥阿侖膦酸鈉培養(yǎng)4天。收集處理后即第10天的4組幼魚，進行茜素紅染色、鈣黃綠素染色以及阿爾新藍染色檢測硬骨及軟骨發(fā)育的修復(fù)情況，結(jié)果如圖5所示。實驗結(jié)果表明無論是從骨密度、礦化程度還是軟骨發(fā)育，阿侖膦酸鈉能夠極好地修復(fù)由FAC造成的骨鈣化減少及軟骨缺失。實施例4枸櫞酸鐵銨誘導(dǎo)建立斑馬魚成魚骨質(zhì)疏松模型成魚造模：選用三月齡的斑馬魚成魚，采用500μg·ml-1FAC浸泡處理15天，以正常培養(yǎng)液(HolfreterH2O)為對照，每組樣本量8條，每天換藥一次，喂食一次，15天后統(tǒng)計斑馬魚成魚的致畸率和致死率，并進行茜素紅染色，觀察鈣化及礦化程度。結(jié)果表明：(1)與幼魚相比，造模過程中斑馬魚成魚的致畸率為0，而致死率與斑馬魚幼魚相比進一步降低(統(tǒng)計結(jié)果參見表2)；(2)FAC處理后引發(fā)斑馬魚整骨礦化程度明顯下降，包括脊椎、腹鰭和尾鰭等部位(結(jié)果參見圖6b1-b3)。表2斑馬魚成魚致畸率和致死率FAC濃度(μg·ml-1)0500致畸率00致死率07％實施例5阿侖膦酸鈉對成魚骨質(zhì)疏松具有良好的治療效果成魚修復(fù)：選用三月齡的斑馬魚成魚，隨機分成4組，每組8條，分別為：對照組即正常的養(yǎng)魚水培養(yǎng)至第25天；造模組即500μg·ml-1FAC處理至第25天；陰性藥對照組即FAC處理15天，再換成H2O培養(yǎng)10天；陽性藥修復(fù)組即FAC處理15天，再換成0.1％的陽性藥阿侖膦酸鈉培養(yǎng)10天。每天換藥一次、喂食一次，收集處理后的4組成魚，進行茜素紅染色測硬骨骨密度修復(fù)情況。根據(jù)實驗方案所述方法進行分組處理，收集處理后的25天的成魚進行茜素紅染色，結(jié)果如圖7所示。實驗結(jié)果表明FAC處理后引發(fā)的斑馬魚整骨密度降低癥狀可由阿侖膦酸鈉極好地修復(fù)，包括脊椎、腹鰭和尾鰭等部位(圖7d1-d3)。最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3