本發(fā)明屬于中藥制劑領(lǐng)域，涉及益母草堿的藥用新用途，具體涉及益母草堿在制備治療或預(yù)防抑郁癥藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

抑郁癥是一種復(fù)雜的、持久的情感障礙類(lèi)疾病，又稱(chēng)之抑郁障礙，其主要臨床表現(xiàn)以顯著而持久的心境低落、興趣缺失、情緒的消沉、甚至悲觀(guān)厭世，企圖自殺等行為。據(jù)統(tǒng)計(jì)，自2004年起抑郁癥已經(jīng)成為人類(lèi)第三大頑癥，預(yù)計(jì)至2030年抑郁癥可能成為影響人類(lèi)生活的第一大疾病。

大量研究顯示，抑郁癥除社會(huì)環(huán)境諸多因素外，尚存在單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)缺乏，丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸亢進(jìn)，腦內(nèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子缺乏，神經(jīng)炎癥等病理假說(shuō)。臨床應(yīng)用的抗抑郁藥主要針對(duì)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)缺乏這一病理機(jī)制，包括單胺氧化酶抑制劑，選擇性5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)再攝取抑制劑、選擇性去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)再攝取抑制劑和三環(huán)類(lèi)抗抑郁藥等，上述藥物雖然具有較好的治療作用，已在臨床上得到廣泛的應(yīng)用，但大多存在藥效弱、起效慢、不良反應(yīng)大、作用時(shí)間短等缺陷，如目前臨床常用的是三環(huán)類(lèi)抗抑郁藥丙米嗪、選擇性5-HT再攝取抑制劑氟西汀(Fluoxetine,FLX)。迄今，大約三分之一的抑郁癥患者對(duì)傳統(tǒng)的抗抑郁治療無(wú)效。闡明抗抑郁作用新機(jī)制、尋找抗抑郁治療新靶點(diǎn)、研發(fā)新的有效的治療藥物依然是神經(jīng)科學(xué)研究的難點(diǎn)與重任。近年來(lái)，從中藥/天然藥物中開(kāi)發(fā)抗抑郁制劑有望成為突破方向之一。

益母草屬中藥唇形科益母草(Leonurus japonicas houtts)屬植物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，中醫(yī)藥文獻(xiàn)中記載其功能主治為活血、調(diào)經(jīng)、祛瘀、消水，素有“血脈圣藥”、“經(jīng)產(chǎn)良方”之稱(chēng)。自1990年以來(lái)，益母草已被列入中華人民共和國(guó)藥典，超過(guò)300種含有益母草的處方被用于治療各種疾病，其藥理作用主要是對(duì)婦產(chǎn)科和心血管方面的保護(hù)。有研究報(bào)道指出益母草對(duì)孕期婦女的焦慮具有保護(hù)作用；益母草混合提取物對(duì)缺血性中風(fēng)模型大鼠具有保護(hù)作用(中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枺?0101087017.4)。益母草堿(Leonurine)作為益母草中主要的有效生物堿，現(xiàn)代藥理研究界已證明益母草堿具有興奮子宮、溶栓、抗凝、降血黏度、降脂、降低紅細(xì)胞聚集、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)、抗氧自由基、抗炎、減少細(xì)胞內(nèi)鈣超載等諸多藥理作用，為其臨床應(yīng)用提供了可靠的理論基礎(chǔ)。近年來(lái)研究報(bào)道指出益母草堿有許多非同于傳統(tǒng)適應(yīng)癥的藥物作用如抗糖尿病，心血管保護(hù)，腦卒中治療，以及在腎臟損傷中發(fā)揮著重要作用。

然而，至今益母草堿對(duì)抑郁癥的效應(yīng)尚未見(jiàn)報(bào)道，本發(fā)明通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，從多方面確證益母草堿作為防治抑郁癥藥物應(yīng)用的可能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供了益母草堿在制藥中的新用途，具體涉及益母草堿在制備預(yù)防或治療抑郁癥藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的益母草堿是基于中草藥益母草的活性單體益母草堿的結(jié)構(gòu)經(jīng)化學(xué)合成得到，其分子式為C₁₄H₂₁N₃O₅,分子量為311.33，熔點(diǎn)為238℃，具體結(jié)構(gòu)式如下：

本發(fā)明應(yīng)用慢性溫和性應(yīng)激(Chronic mild stress，CMS)模型誘導(dǎo)小鼠抑郁樣行為，觀(guān)察益母草堿對(duì)CMS小鼠抑郁樣行為影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，益母草堿顯著改善CMS小鼠的抑郁樣行為，表現(xiàn)為糖水偏愛(ài)率(SPT)顯著升高，強(qiáng)迫游泳(FST)和懸尾實(shí)驗(yàn)(TST)小鼠的不動(dòng)時(shí)間顯著縮短。

本發(fā)明應(yīng)用高效液相色譜技術(shù)觀(guān)察益母草堿對(duì)CMS小鼠腦內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，益母草堿顯著增加CMS小鼠腦內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、NE、多巴胺(Dopamine，DA)的含量。

本發(fā)明應(yīng)用尼氏染色、透射電鏡技術(shù)觀(guān)察益母草堿對(duì)CMS小鼠海馬神經(jīng)元的影響。尼氏染色結(jié)果顯示，益母草堿顯著改善CMS抑郁小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)和結(jié)構(gòu)；透射電鏡結(jié)果顯示，益母草堿顯著改善CMS小鼠海馬神經(jīng)元損傷及神經(jīng)元髓鞘結(jié)構(gòu)異常。

本發(fā)明應(yīng)用免疫熒光法觀(guān)察益母草堿對(duì)CMS小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，益母草堿顯著增加CMS小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，具有改善腦內(nèi)微環(huán)境的可能。

本發(fā)明應(yīng)用Western Blot方法檢測(cè)益母草堿對(duì)CMS小鼠海馬炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-6、TNF-а、NF-ΚB信號(hào)通路及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、GDNF的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，益母草堿顯著抑制CMS小鼠腦內(nèi)神經(jīng)炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-а的蛋白表達(dá)及NF-ΚB信號(hào)通路的激活，升高神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、GDNF的水平。

本發(fā)明中所述的益母草堿，包含但不僅限于益母草堿及其鹽，包含且不僅限于在單組分及復(fù)方制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的預(yù)防或治療抑郁癥藥物的劑型包含且不僅限于片劑、膠囊、緩釋片、控釋片、口服液、糖漿、滴丸、注射液劑型、凍干粉針劑型等。

已知抑郁癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能涉及多系統(tǒng)、多環(huán)節(jié)功能失調(diào)或障礙。本發(fā)明運(yùn)用多系統(tǒng)、多角度的研究，綜合闡明益母草堿對(duì)抑郁癥的預(yù)防與治療作用及其機(jī)制。由本發(fā)明所述可知，益母草堿改善CMS小鼠抑郁樣行為的作用，與其增加腦內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)，抑制神經(jīng)炎癥，增加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞改善腦內(nèi)微環(huán)境等有關(guān)。

本發(fā)明內(nèi)容還包括益母草堿在構(gòu)建CMS動(dòng)物模型中的應(yīng)用。

本發(fā)明內(nèi)容還包括益母草堿在構(gòu)建CMS小鼠模型中的應(yīng)用。

作為優(yōu)選，本發(fā)明中每kg的CMS小鼠每天益母草堿的劑量為30mg～60mg。

由本發(fā)明中所述益母草堿防治CMS小鼠抑郁有效劑量推算至臨床成人每日用量范圍約為50～300mg。

有益效果：本發(fā)明中所述益母草堿通過(guò)調(diào)整抑郁癥多個(gè)病理環(huán)節(jié)從而發(fā)揮抗抑郁作用，且安全性高(口服最大耐受劑量>5g/kg)，有望超越目前作用于單一靶點(diǎn)的治療藥物。

附圖說(shuō)明

圖1：益母草堿對(duì)CMS小鼠糖水偏愛(ài)率的影響。實(shí)驗(yàn)期間每周的糖水偏愛(ài)率以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，n＝11～13，^*P＜0.05，^**P<0.01，與同時(shí)期對(duì)照組比較；^#P＜0.05，^##P<0.01，與同時(shí)期模型組比較。CON，正常小鼠；CMS，CMS小鼠；Leonurine，益母草堿；FLX，氟西?。?/p>

圖2：益母草堿對(duì)CMS小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的影響。數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，n＝8～12，^*P＜0.05，^**P<0.01，與同時(shí)期對(duì)照組比較；^#P＜0.05，^##P<0.01，與同時(shí)期模型組比較；CON，正常小鼠；CMS，CMS小鼠；Leonurine，益母草堿；FLX，氟西?。?/p>

圖3：益母草堿對(duì)CMS小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)的影響。數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，n＝8～12，^*P＜0.05，^**P<0.01，與同時(shí)期對(duì)照組比較；^#P＜0.05，^##P<0.01，與同時(shí)期模型組比較；CON，正常小鼠；CMS，CMS小鼠；Leonurine，益母草堿；FLX，氟西??；

圖4：益母草堿對(duì)CMS小鼠腦內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、NE、DA的影響(A-F)；數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，n＝7～9；其中圖4A-4C是海馬腦區(qū)5-HT、NE、DA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖4E-4F是前額葉皮層5-HT、NE、DA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；^*P＜0.05，^**P<0.01，與同時(shí)期對(duì)照組比較；^#P＜0.05，^##P<0.01，與同時(shí)期模型組比較；CON，正常小鼠；CMS，CMS小鼠；Leonurine，益母草堿；FLX，氟西?。?/p>

圖5：益母草堿對(duì)CMS小鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)的影響(A-B)(×100)；其中圖5A是海馬DG區(qū)尼氏染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖5B是海馬CA3區(qū)尼氏染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果；n＝7～9，CON，正常小鼠；CMS，CMS小鼠；Leonurine，益母草堿；

圖6：益母草堿對(duì)CMS小鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響；其中是圖6(A-C)是神經(jīng)元透射電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×1900)；圖6(D-F)分別是圖(A-C)放大的透射電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×11000)；n＝3，線(xiàn)粒體(arrows)，CON，正常小鼠；CMS，CMS小鼠；Leonurine，益母草堿；

圖7：益母草堿對(duì)CMS小鼠海馬神經(jīng)元髓鞘的影響；其中是圖7A是透射電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×1900)；圖7B是各組的G-比率即髓鞘的內(nèi)徑/外徑(n>100)；CON，正常小鼠；CMS，CMS小鼠；Leonurine，益母草堿；

圖8：益母草堿對(duì)CMS抑郁模型小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響(×100)；其中圖8A是星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性marker GFAP的免疫熒光的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖8B是星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；^*P＜0.05，^**P<0.01，與同時(shí)期對(duì)照組比較；^#P＜0.05,^##P<0.01，與同時(shí)期模型組比較；n＝5，CON，正常小鼠；CMS，CMS小鼠；Leonurine，益母草堿；

圖9：益母草堿對(duì)CMS小鼠海馬炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-6、TNF的影響；其中，數(shù)據(jù)用目的蛋白和內(nèi)參β-actin相比；^*P＜0.05，^**P<0.01，與同時(shí)期對(duì)照組比較；^#P＜0.05，^##P<0.01，與同時(shí)期模型組比較；n＝3，CON，正常小鼠；CMS，CMS小鼠；Leonurine，益母草堿；FLX，氟西??；

圖10：益母草堿對(duì)CMS小鼠海馬NF-ΚB信號(hào)通路的影響；數(shù)據(jù)用目的蛋白和內(nèi)參β-actin相比；^*P＜0.05，^**P<0.01，與同時(shí)期對(duì)照組比較；^#P＜0.05，^##P<0.01，與同時(shí)期模型組比較；n＝3，CON，正常小鼠；CMS，CMS小鼠；Leonurine，益母草堿；FLX，氟西?。?/p>

圖11：益母草堿對(duì)CMS小鼠海馬神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、GDNF的影響；數(shù)據(jù)用目的蛋白和內(nèi)參β-actin相比；^*P＜0.05，^**P<0.01，與同時(shí)期對(duì)照組比較；^#P＜0.05，^##P<0.01，與同時(shí)期模型組比較；n＝3，CON，正常小鼠；CMS，CMS小鼠；Leonurine，益母草堿；FLX，氟西汀。

具體實(shí)施方式：

實(shí)驗(yàn)材料和儀器：

實(shí)驗(yàn)材料：益母草堿，白色粉末，純度＞99.0％，復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院提供。氟西汀(fluoxetine)購(gòu)于sigma公司。標(biāo)準(zhǔn)品使用情況如下：去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、購(gòu)自美國(guó)sigma公司?？贵w使用情況如下：兔抗Bax、兔抗Bcl-2，兔抗Phospho-IKKα/β(Ser176/180)(16A6)，兔抗IKKβ(D30C6)，兔抗Phospho-NF-κB p65(Ser536)(93H1)，兔抗NF-κB p65(D14E12)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；山羊抗IL-1β，小鼠抗β-actin購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，兔抗TNF-a，兔抗IL-6購(gòu)自abcam公司，兔抗BDNF(N-20)，兔抗GDNF購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司。

實(shí)驗(yàn)儀器：Forced Swim ScanTM(Clever Sys Inc.，VA，USA)；Tail Susp ScanTM(Clever Sys Inc.，VA，USA)，Thermo ultimate 3000高效液相色譜儀(Thermo，USA)，Image Quant LAS 4000化學(xué)發(fā)光成像分析儀(GE，USA)，透射電鏡(JEM-1010，Tokyo，Japan)，體視學(xué)系統(tǒng)(MBF，USA)。

小鼠來(lái)源：雄性C57BL/6J小鼠，體重18～22g，2～3月齡，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心(動(dòng)物生成許可證號(hào)為SCXR(蘇)20120004)。

本發(fā)明中所有實(shí)施例中的30mg/kg/day或60mg/kg/day指的是每kg小鼠每天劑量為30mg或60mg。

實(shí)施例1：益母草堿對(duì)CMS小鼠抑郁樣行為的改善作用

本發(fā)明采用國(guó)際學(xué)術(shù)界公認(rèn)的制備嚙齒類(lèi)動(dòng)物抑郁癥的CMS抑郁模型。雄性C57BL/6J小鼠，體重18～22g，2～3月齡，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心(動(dòng)物生成許可證號(hào)為SCXR(蘇)20120004)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，正常對(duì)照組小鼠正常攝食飲水，不給予任何刺激，應(yīng)激小鼠每天進(jìn)行兩種或三種隨機(jī)、溫和不可預(yù)測(cè)的刺激，直至抑郁樣癥狀的出現(xiàn)。CMS方法包含一系列不可預(yù)知的慢性溫和應(yīng)激包括：夾尾、晝夜顛倒、45°斜籠(6h)、束縛(12h)、濕籠(12h)、空籠(10-14h)、食水剝奪(15h)、配對(duì)(2h)、更換墊料、頻閃照明12h等，同種刺激不能連續(xù)給予。每只小鼠每周測(cè)量一次糖水偏愛(ài)率。小鼠進(jìn)行慢性溫和刺激至第6周，灌胃給予益母草堿(30mg/kg/day或60mg/kg/day)持續(xù)4周。于末次給藥結(jié)束后1h，進(jìn)行糖水偏好、強(qiáng)迫游泳和懸尾實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)益母草堿對(duì)CMS小鼠行為學(xué)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析。

糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表1，附圖1)顯示，CMS刺激小鼠進(jìn)行至第6周糖水偏愛(ài)率降低20.14％±1.08％，與正常對(duì)照組比較具有顯著差異(P<0.001)，給予益母草堿各組小鼠糖水偏愛(ài)率逐周增加，至第4周時(shí)，60mg/kg/day益母草堿組小鼠糖水偏愛(ài)率增加較CMS組增加了8.12％±0.87％，具有顯著性差異(P<0.05)。小鼠強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)結(jié)果(表2，附圖2)顯示：給予CMS刺激，小鼠強(qiáng)迫游泳的不動(dòng)時(shí)間增加174.55％±4.53％，具有顯著差異(P<0.001)，益母草堿縮短CMS小鼠不動(dòng)時(shí)間，其中60mg/kg/day益母草堿小鼠的不動(dòng)時(shí)間縮短31.85％±2.13％，具有顯著性差異(P<0.05)；小鼠懸尾試驗(yàn)結(jié)果(表2，附圖3)顯示：給予CMS刺激，小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間增加83.11％±3.77％，具有顯著差異(P<0.01)，益母草堿縮短CMS小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間，其中60mg/kg/day益母草堿小鼠的不動(dòng)時(shí)間縮短28.93％±0.31％，具有顯著性差異(P<0.05)。提示，益母草堿具有改善CMS小鼠抑郁樣行為的作用。

表1小鼠糖水偏愛(ài)率(％)

注：^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001vs正常對(duì)照組，^#p<0.05，^##p<0.01vs CMS模型組Mean±S.E.M.

表2小鼠強(qiáng)迫游泳與懸尾實(shí)驗(yàn)的不動(dòng)時(shí)間

注：^***p<0.001vs正常對(duì)照組，^#p<0.05，^##p<0.01vs CMS模型組Mean±S.E.M.

實(shí)施例2：益母草堿對(duì)CMS小鼠腦內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響

本部分采用實(shí)施例1所述CMS抑郁模型，至第6周，灌胃給予益母草堿(30mg/kg/day或60mg/kg/day)，持續(xù)4周。末次給藥后1h深麻醉小鼠，迅速剝離腦組織，分離海馬和前額葉皮層，加入勻漿液(0.1M HClO₄，0.1mM EDTA)勻漿，離心(20,000rpm，30min)，取上清，Thermo ultimate 3000高效液相色譜系統(tǒng)(HPLC)檢測(cè)各樣本中單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)和多巴胺(DA)含量。

海馬區(qū)單胺遞質(zhì)測(cè)定結(jié)果(表3、附圖4A-4C)所示，與正常對(duì)照組比較，CMS應(yīng)激小鼠5-HT、NE、DA的含量分別降低35.73％、27.91％、37.38％，具有顯著性差異(P<0.001，P<0.01，P<0.05)；連續(xù)給予4周60mg/kg益母草堿組小鼠海馬5-HT、NE、DA的含量較CMS組分別升高40.99％、35.50％、52.42％，具有顯著性差異(P<0.05)。前額葉皮層單胺遞質(zhì)測(cè)定結(jié)果(表4、附圖4D-4F)所示，CMS應(yīng)激小鼠5-HT、NE、DA的含量分別降低42.55％、37.68％、57.31％，具有顯著性差異(P<0.001，P<0.001，P<0.01)，給藥組5-HT、NE、DA的含量較CMS組分別升高21.37％、28.65％、68.30％，具有顯著性差異(P<0.05，P<0.01，P<0.05)。提示，益母草堿增加CMS小鼠腦內(nèi)5-HT、NE、DA等單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量，改善單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的異常。表3小鼠海馬區(qū)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量(ng/g濕組織)

注：^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001vs正常對(duì)照組，^#p<0.05，^##p<0.01vs CMS模型組Mean±S.E.M.

表4小鼠前額葉皮層單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量(ng/g濕組織)

注：^**p<0.01，^***p<0.001vs正常對(duì)照組，^#p<0.05，^##p<0.01vs CMS模型組Mean±S.E.M.

實(shí)施例3：益母草堿對(duì)CMS小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞的影響

本部分采用實(shí)施例1所述CMS抑郁模型，至第六周，灌胃給予益母草堿(30mg/kg/day或60mg/kg/day)，持續(xù)4周。末次給藥后1h深麻醉小鼠，4％多聚甲醛灌注，梯度蔗糖脫水，腦組織進(jìn)行冰凍切片，根據(jù)腦圖譜挑選海馬腦片進(jìn)行尼氏染色觀(guān)察海馬神經(jīng)元形態(tài)、結(jié)構(gòu)；此外，于4％(質(zhì)量百分比)多聚甲醛灌注后，分離海馬于2.5％(質(zhì)量百分比)戊二醛中后固定，電鏡標(biāo)本制樣，透射電鏡下觀(guān)察海馬區(qū)神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)；應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞，結(jié)合MBF體視學(xué)系統(tǒng)計(jì)數(shù)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

尼氏染色結(jié)果(圖5)顯示，正常對(duì)照組，小鼠海馬齒狀回(DG)和CA3區(qū)神經(jīng)元排列緊密，神經(jīng)元胞體較大，細(xì)胞核大而圓，尼氏體豐富；CMS模型組小鼠海馬DG和CA3區(qū)神經(jīng)元錐體細(xì)胞層變薄，細(xì)胞間隙大，排列疏松，細(xì)胞體積變小，尼氏體減少；益母草堿(60mg/kg/day)組小鼠海馬DG和CA3區(qū)神經(jīng)元的排列、胞體大小、胞核形態(tài)及尼氏體數(shù)目均接近正常(附圖6C)。提示，益母草堿能夠改善CMS小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元形態(tài)。

透射電鏡觀(guān)察(圖6)結(jié)果所示，正常對(duì)照組神經(jīng)元胞體大小正常，表面光滑，細(xì)胞核呈卵圓形，兩層膜結(jié)構(gòu)清晰，核染色質(zhì)分布均勻，胞漿內(nèi)細(xì)胞器豐富，結(jié)構(gòu)完整，線(xiàn)粒體呈圓形或橢圓形，內(nèi)嵴清晰可見(jiàn)(6A，6D)；CMS模型組神經(jīng)元胞體變小，核異染色質(zhì)增多，呈塊狀并向邊緣聚集；核周間隙增寬；胞質(zhì)內(nèi)線(xiàn)粒體腫脹，少量呈空泡樣；部分線(xiàn)粒體內(nèi)嵴模糊(6B，6E)。益母草堿(60mg/kg/day)組神經(jīng)元胞體基本正常，核內(nèi)異染色質(zhì)輕度增加，核周間隙基本正常，核緣光滑；線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)基本完整，少見(jiàn)線(xiàn)粒體腫脹(圖6C，圖6F)。提示，益母草堿改善CMS小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，減輕神經(jīng)元損傷。

神經(jīng)髓鞘是神經(jīng)元之間相互作用的關(guān)鍵調(diào)解物，髓鞘結(jié)構(gòu)異常間接地導(dǎo)致神經(jīng)元損失或死亡，影響大腦突觸結(jié)構(gòu)和空間記憶，是海馬功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。本發(fā)明采用透射電鏡技術(shù)檢測(cè)海馬髓鞘結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖7A所示，正常對(duì)照組海馬區(qū)神經(jīng)元髓鞘形狀和結(jié)構(gòu)正常，具有密集的質(zhì)膜環(huán)；模型組出現(xiàn)髓鞘結(jié)構(gòu)異常表現(xiàn)為髓鞘松散排列、髓鞘變薄等組織損傷的跡象，益母草堿(60mg/kg/day)組髓鞘結(jié)構(gòu)則趨于正常。應(yīng)用髓鞘內(nèi)直徑與總外徑的比值(G比率)作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示(表5，圖7B)CMS模型組較正常對(duì)照組增加25.37％，具有顯著差異(P<0.001)；益母草堿(60mg/kg/day)組與正常對(duì)照組相近，較CMS組G比率降低15.48％，具有顯著差異(P<0.01)。提示，益母草堿能夠改善CMS小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)。

表5各組小鼠髓鞘g-比率(髓鞘的內(nèi)徑/外徑)

注：^***p<0.001vs正常對(duì)照組，^##p<0.01vs CMS模型組Mean±S.E.M.

星形膠質(zhì)細(xì)胞是構(gòu)成腦實(shí)質(zhì)的重要組成部分，不僅為神經(jīng)元提供多種營(yíng)養(yǎng)支持物質(zhì)，在突觸重塑，神經(jīng)細(xì)胞再生，調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞外離子、神經(jīng)遞質(zhì)及代謝物等方面也起著重要作用，抑郁癥患者海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞顯著減少。本實(shí)施例應(yīng)用免疫熒光化檢測(cè)益母草堿對(duì)CMS小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響，結(jié)果(表6，圖8)顯示：與正常對(duì)照組比較，CMS模型組小鼠海馬DG區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)減少(8A)，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)(星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性的標(biāo)志物)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少36.09％(8B)，具有顯著差異(P<0.01)；益母草堿(60mg/kg/day)組小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較模型組增加31.20％，具有顯著差異(P<0.05)。提示，益母草堿具有增加腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞，顯著改善神經(jīng)元生存微環(huán)境的作用。

表6各組小鼠海馬DG區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量

注：^**p<0.01vs正常對(duì)照組，^#p<0.05vs CMS模型組Mean±S.E.M.

實(shí)施例4：益母草堿對(duì)CMS小鼠腦內(nèi)神經(jīng)炎癥的影響

本部分采用實(shí)施例1所述CMS抑郁模型，至第6周，灌胃給予益母草堿(30mg/kg/day或60mg/kg/day)，持續(xù)4周。末次給藥后1h深麻醉小鼠，迅速分離海馬組織，加入蛋白裂解液，組織蛋白提取，應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)小鼠海馬神經(jīng)炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-6、TNF的蛋白表達(dá)及NF-ΚB信號(hào)通路的變化。將海馬組織稱(chēng)重后，按1:10(w/v)加入RIPA裂解液，進(jìn)行組織勻漿，冰上裂解30min，16000rpm×4℃×15min，吸取上清。取1μL進(jìn)行BCA蛋白定量(碧云天，上海)，余下上清蛋白按照體積比加入5X上樣緩沖液95℃下變性5min，分裝后-20℃保存。根據(jù)BCA定量結(jié)果，取40μg樣品/泳道上樣，根據(jù)蛋白的分子量選擇濃度制備SDS-PAGE膠進(jìn)行恒壓(80-120V)凝膠電泳分離，300mA恒流下電轉(zhuǎn)70-120min至PVDF膜(Millipore，USA)。5％(質(zhì)量百分比脫脂奶粉的TBST(pH7.4，10mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.1％Tween-20)室溫下震蕩封閉1h，加入5％(質(zhì)量百分比)BSA-TBST配制的一抗：兔抗Phospho-IKKα/β(Ser176/180)(16A6)(1:1000，CST，2697)，兔抗IKKβ(D30C6)(1:1000，CST，8943)，兔抗Phospho-NF-κB p65(Ser536)(93H1)(1:1000，CST，3033)，兔抗NF-κB p65(D14E12)(1:1000，CST，8242S)，兔抗Bcl-2(1:1000，CST，2876)，兔抗Bax(1:1000，CST，2772)，山羊抗IL-1β(1:1000，sigma，13767，)，兔抗TNF-a(1:1000，Abcam，ab9739)，兔抗IL-6(1:1000，Abcam，ab83339)，兔抗BDNF(N-20)(1:1000，Santa Cruz，sc-546)，兔抗GDNF(1:1000，Santa Cruz，sc-328)，小鼠抗β-actin(1:1000，Sigma，A5441)。4℃孵育過(guò)夜。TBST漂洗10min 3遍，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗：山羊抗兔-HRP(1:800，KPL)，山羊抗小鼠-HRP(1:800，KPL)，兔抗山羊-HRP(1:800，KPL)，室溫孵育60min，加入ECL(Pierce)化學(xué)發(fā)光底物顯色。用Image Quant LAS 4000化學(xué)發(fā)光成像分析儀顯影分析；將磷酸化蛋白激酶灰度值與各自總蛋白激酶灰度值進(jìn)行比較判斷磷酸化程度，用目的蛋白灰度值與各自?xún)?nèi)參β-actin灰度值之比進(jìn)行半定量分析(Image J.)。以上的1:1000均指的是稀釋1000倍。

結(jié)果顯示(附圖9、圖10)。與正常小鼠組比較，CMS小鼠海馬炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-а的蛋白表達(dá)(附圖9)及IKKβ和P65的磷酸化水平(附圖10)顯著升高。益母草堿組較CMS組海馬炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-а的蛋白水平及IKKβ和P65的磷酸化水平降低，其中60mg/kg/day益母草堿具有顯著性差異(P<0.01)。提示，益母草堿抑制CMS小鼠腦內(nèi)NF-ΚB信號(hào)通路的激活，從而抑制炎癥反應(yīng)。

實(shí)施例5：益母草堿對(duì)CMS小鼠腦內(nèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的影響

本部分采用實(shí)施例1所述CMS抑郁模型，至第六周，灌胃給予益母草堿(30mg/kg/day或60mg/kg/day)，持續(xù)4周。末次給藥后1h深麻醉小鼠，迅速分離海馬組織，加入蛋白裂解液，組織蛋白提取，應(yīng)用Western blot方法(同實(shí)施例4)檢測(cè)小鼠海馬區(qū)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、GDNF的蛋白水平。

結(jié)果如圖11所示，CMS小鼠海馬神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、GDNF蛋白水平顯著降低，益母草堿(60mg/kg/day)組BDNF、GDNF蛋白水平較CMS組升高具有顯著性差異(P<0.05)。提示，益母草堿能夠顯著恢復(fù)CMS小鼠腦內(nèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子水平。