本發(fā)明涉及腫瘤藥物研究領(lǐng)域，尤其涉及一種藥物組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤是機(jī)體在各種致瘤因素作用下，局部組織的細(xì)胞在基因水平上失去對(duì)其生長(zhǎng)的正常調(diào)控導(dǎo)致異常增生與分化而形成的新生物。新生物一旦形成，不因病因消除而停止生長(zhǎng)，他的生長(zhǎng)不受正常機(jī)體生理調(diào)節(jié)，而是破壞正常組織與器官，這一點(diǎn)在惡性腫瘤尤其明顯。與良性腫瘤相比，惡性腫瘤生長(zhǎng)速度快，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，易發(fā)生出血、壞死、潰瘍等，并常有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，造成人體消瘦、無力、貧血、食欲不振、發(fā)熱以及嚴(yán)重的臟器功能受損等，最終造成患者死亡。

腎癌是一種嚴(yán)重危害人類健康的惡性疾病遙大多數(shù)晚期腎癌對(duì)放化療不敏感袁且預(yù)后較差，細(xì)胞免疫治療對(duì)腫瘤的生物治療取得了良好效果并逐漸成為腫瘤治療的重要手段之一。近年細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer,CIK)的免疫功能得到廣泛研究，CIK細(xì)胞作為一種新型的廣譜抗腫瘤免疫細(xì)胞，不僅具有強(qiáng)大的廣譜抗腫瘤效應(yīng)，而且可以調(diào)節(jié)增強(qiáng)腫瘤患者的免疫功能。

程序性死亡受體1(Programmed Death-1；PD-1)，是一種重要的免疫抑制分子，為CD28超家族成員,其最初是從凋亡的小鼠T細(xì)胞雜交瘤2B4.11克隆出來。PD-1主要是在激活的T細(xì)胞和B細(xì)胞中表達(dá)，具有抑制細(xì)胞激活的功能，這是免疫系統(tǒng)中一種正常的自穩(wěn)機(jī)制，因?yàn)檫^度的T/B細(xì)胞激活會(huì)引起自身免疫疾病，所以PD-1相當(dāng)于人體內(nèi)的一道護(hù)欄。

CN 105326893 A公開了一種抗癌組合物及其制劑。該組合物包括DC-CIK細(xì)胞和康艾注射液。該發(fā)明將DC-CIK細(xì)胞與康艾注射液聯(lián)合使用時(shí)，在藥物用量減少的情況下效果更好，可有效治療癌癥。該抗癌組合物針對(duì)性不強(qiáng)，也沒有有力的證據(jù)可以證明其對(duì)癌癥有顯著的治療效果。

CN 105744955 A公開了包含抗CEACAM1抗體的組合物、包含能夠抑制或阻斷PD-1和其配體之間相互作用的抗體的組合物，以及在治療癌癥中所述組合物組合使用的方法。該發(fā)明將PD-1抗體單獨(dú)施用或與別的抗體結(jié)合，其針對(duì)性不強(qiáng)，也沒有有力的證據(jù)證明其對(duì)癌癥有明顯的治療效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)目前存在的問題，本發(fā)明提供一種藥物組合物及其應(yīng)用，所述藥物組合物包括PD-1抗體和非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞，該藥物組合物對(duì)腎癌有明顯的治療效果，按RESIST標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)均達(dá)到PR(部分緩解)或接近CR(完全緩解)，有效率達(dá)100％，而副作用都十分微小，無3或4級(jí)不良反應(yīng)發(fā)生。

為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，所述組合物包括PD-1抗體和非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞。

本發(fā)明中，非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞指的是CD8+T、CD4+T經(jīng)過擴(kuò)增激活后，獲得的一類具有廣譜殺傷功能的CD8CD4混合T淋巴細(xì)胞群，由患者外周血中的T淋巴細(xì)胞經(jīng)多種細(xì)胞因子活化擴(kuò)增而成，具有正向免疫調(diào)節(jié)作用，如它們能分泌多種細(xì)胞因子如IFN-γ、IL-2等，還能抑制免疫抑制細(xì)胞如MDSC等，非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)后，它們能進(jìn)入腫瘤組織中。在腫瘤組織的微環(huán)境中，它們發(fā)揮免疫調(diào)控的作用，通過分泌的IFN-γ等細(xì)胞因子誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-1的配體PD-L1，并抑制腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制細(xì)胞，發(fā)揮免疫調(diào)控作用。PD-1抗體主要通過阻斷腫瘤組織中T淋巴細(xì)胞上的PD-1分子與PD-L1結(jié)合，重新活化T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。但由于腫瘤微環(huán)境中免疫抑制因素如MDSC及Treg等細(xì)胞的存在，減低了PD-1抗體對(duì)T淋巴細(xì)胞的再活化作用。非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞能抑制腫瘤微環(huán)境的免疫抑制細(xì)胞，因而能增強(qiáng)PD-1抗體的作用。

根據(jù)本發(fā)明，所述PD-1抗體為從商業(yè)途徑可以購(gòu)買得到的PD-1抗體都是可行的，不同購(gòu)買途徑的PD-1抗體不會(huì)對(duì)本申請(qǐng)的藥物組合物的藥效造成影響，本申請(qǐng)的PD-1抗體購(gòu)買自Keytruda，PD-1抗體為美國(guó)FDA已批復(fù)的處方藥，所述PD-1抗體的濃度為1-10mg/kg，例如可以是1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg、4.5mg/kg、5mg/kg、5.5mg/kg、6mg/kg、6.5mg/kg、7mg/kg、7.5mg/kg、8mg/kg、8.5mg/kg、9mg/kg、9.5mg/kg或10mg/kg，優(yōu)選為1-5mg/kg，進(jìn)一步優(yōu)選為2mg/kg，以及上述數(shù)值之間的具體點(diǎn)值，限于篇幅及出于簡(jiǎn)明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點(diǎn)值。

根據(jù)本發(fā)明，所述非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞的數(shù)量為(3-12)×10⁹個(gè)，例如可以是3×10⁹個(gè)、3.1×10⁹個(gè)、3.2×10⁹個(gè)、3.3×10⁹個(gè)、3.5×10⁹個(gè)、3.8×10⁹個(gè)、4×10⁹個(gè)、4.2×10⁹個(gè)、4.5×10⁹個(gè)、4.8×10⁹個(gè)、5×10⁹個(gè)、5.3×10⁹個(gè)、5.5×10⁹個(gè)、5.8×10⁹個(gè)、5.83×10⁹個(gè)、6×10⁹個(gè)、6.5×10⁹個(gè)、7×10⁹個(gè)、7.5×10⁹個(gè)、8×10⁹個(gè)、8.5×10⁹個(gè)、9×10⁹個(gè)、9.5×10⁹個(gè)、10×10⁹個(gè)、10.5×10⁹個(gè)、11×10⁹個(gè)、11.5×10⁹個(gè)或12×10⁹個(gè)，優(yōu)選為(6-10)×10⁹個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選為5.83×10⁹個(gè)，以及上述數(shù)值之間的具體點(diǎn)值，限于篇幅及出于簡(jiǎn)明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點(diǎn)值。

優(yōu)選地，所述非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞的制備方法包括如下步驟：

(1)抽取患者外周血，離心；

(2)離心后的上層血漿放入4℃冰箱中保存，用生理鹽水稀釋下層血細(xì)胞，稀釋后的血細(xì)胞加至淋巴細(xì)胞細(xì)胞分離液上層，離心；

(3)離心后提取單個(gè)核細(xì)胞，用生理鹽水洗滌，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；

(4)細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種在包被過重組人纖粘連蛋白(RetroNectin)、CD3單抗和PBS的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入完全培養(yǎng)液50-60mL，放入5％CO₂培養(yǎng)箱中，37℃進(jìn)行非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞的培養(yǎng)；

(5)隔日顯微鏡下觀察，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)和數(shù)量補(bǔ)充完全培養(yǎng)基；

(6)10-20d，優(yōu)選14d后非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞成熟，用生理鹽水洗滌，重懸后低速離心，棄上清，用含有20％白蛋白的生理鹽水重懸細(xì)胞。

本發(fā)明中，研究發(fā)現(xiàn)在淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入RetroNectin，促使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，可以使細(xì)胞獲得上萬倍的細(xì)胞增值率。RetroNectin與CD3單抗聯(lián)合包被，Retronectin參與細(xì)胞的附著、伸展、分化和增殖的同時(shí)，也增加了CD3單抗與非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞的接觸、附著，即增加了CD3單抗的作用，進(jìn)一步提高了非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)效率。

優(yōu)選地，步驟(1)所述離心的條件為500-1000g，4℃離心10-20min，優(yōu)選為800g、4℃離心15min。

所述離心的轉(zhuǎn)速為500-1000g，例如可以是500g、550g、600g、650g、700g、750g、800g、850g、900g、950g或1000g，以及上述數(shù)值之間的具體點(diǎn)值，限于篇幅及出于簡(jiǎn)明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點(diǎn)值。

所述離心的時(shí)間為10-20min，例如可以是10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min或20min，以及上述數(shù)值之間的具體點(diǎn)值，限于篇幅及出于簡(jiǎn)明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點(diǎn)值。

優(yōu)選地，步驟(2)所述的生理鹽水和血細(xì)胞的體積比為(1-3):1，例如可以是1:1、2:1或3:1，優(yōu)選為1:1，以及上述數(shù)值之間的具體點(diǎn)值，限于篇幅及出于簡(jiǎn)明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點(diǎn)值。

優(yōu)選地，步驟(2)所述離心的條件為500-1000g，16-23℃離心10-20min，優(yōu)選為800g、20℃離心17min，以及上述數(shù)值之間的具體點(diǎn)值，限于篇幅及出于簡(jiǎn)明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點(diǎn)值。

所述離心的轉(zhuǎn)速為500-1000g，例如可以是500g、550g、600g、650g、700g、750g、800g、850g、900g、950g或1000g，以及上述數(shù)值之間的具體點(diǎn)值，限于篇幅及出于簡(jiǎn)明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點(diǎn)值。

所述離心的溫度為16-23℃，例如可以是16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃或23℃，以及上述數(shù)值之間的具體點(diǎn)值，限于篇幅及出于簡(jiǎn)明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點(diǎn)值。

所述離心的時(shí)間為10-20min，例如可以是10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min或20min，以及上述數(shù)值之間的具體點(diǎn)值，限于篇幅及出于簡(jiǎn)明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點(diǎn)值。

優(yōu)選地，步驟(3)所述洗滌的次數(shù)為1-5遍，例如可以是1遍、2遍、3遍、4遍或5遍，優(yōu)選為2-3遍，以及上述數(shù)值之間的具體點(diǎn)值，限于篇幅及出于簡(jiǎn)明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點(diǎn)值。

優(yōu)選地，步驟(4)所述細(xì)胞計(jì)數(shù)后將細(xì)胞進(jìn)行CD4和CD8磁珠分選，并將獲得的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞進(jìn)行混合。

優(yōu)選地，所述CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量比為1:1。

本發(fā)明中，CD8+T即細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Tc)可通過顆粒酶、細(xì)胞毒性細(xì)胞因子的釋放及Fas途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷；CD4+T即輔助性T細(xì)胞(Th)可分泌大量細(xì)胞因子以維護(hù)Tc細(xì)胞的免疫應(yīng)答。這兩種效應(yīng)細(xì)胞相互協(xié)調(diào)是有效維持獲得性免疫所必需的，所以非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞相較于單純CD8+T或者CIK在體內(nèi)發(fā)生殺傷的效率更高，持續(xù)時(shí)間也更久。

優(yōu)選地，步驟(4)所述的完全培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基中加入800-1200IU/mL IL-2、800-1200IU/mL IFN-γ、100-200IU/mL慶大霉素、50-150IU/mL IL-1α和1-8％自體血漿，優(yōu)選為1000IU/mL IL-2、1000IU/mL IFN-γ、160IU/mL慶大霉素、100IU/mL IL-1α和5％自體血漿。

所述IL-2的濃度為800IU/mL、850IU/mL、900IU/mL、950IU/mL、1000IU/mL、1050IU/mL、1100IU/mL、1150IU/mL或1200IU/mL，以及上述數(shù)值之間的具體點(diǎn)值，限于篇幅及出于簡(jiǎn)明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點(diǎn)值。

所述IFN-γ的濃度為800IU/mL、850IU/mL、900IU/mL、950IU/mL、1000IU/mL、1050IU/mL、1100IU/mL、1150IU/mL或1200IU/mL，以及上述數(shù)值之間的具體點(diǎn)值，限于篇幅及出于簡(jiǎn)明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點(diǎn)值。

所述慶大霉素的濃度為100IU/mL、120IU/mL、130IU/mL、140IU/mL、150IU/mL、160IU/mL、180IU/mL、190IU/mL或200IU/mL，以及上述數(shù)值之間的具體點(diǎn)值，限于篇幅及出于簡(jiǎn)明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點(diǎn)值。

所述IL-1α的濃度為50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、110IU/mL、120IU/mL、130IU/mL、140IU/mL或150IU/mL，以及上述數(shù)值之間的具體點(diǎn)值，限于篇幅及出于簡(jiǎn)明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點(diǎn)值。

所述自體血漿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％或8％，以及上述數(shù)值之間的具體點(diǎn)值，限于篇幅及出于簡(jiǎn)明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點(diǎn)值。

優(yōu)選地，步驟(6)所述的洗滌后進(jìn)行離心，離心的條件為100-500g，4℃離心5-16min，優(yōu)選為300g、4℃離心8min。

所述離心的轉(zhuǎn)速為100-500g，例如可以是100g、150g、200g、250g、300g、350g、400g、450g、500g、550g或600g，以及上述數(shù)值之間的具體點(diǎn)值，限于篇幅及出于簡(jiǎn)明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點(diǎn)值。

所述離心的時(shí)間為5-16min，例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min或16min，以及上述數(shù)值之間的具體點(diǎn)值，限于篇幅及出于簡(jiǎn)明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點(diǎn)值。

優(yōu)選地，所述非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞的制備方法包括如下步驟：

(1)抽取病人外周血50mL(肝素鈉抗凝)，分裝在兩個(gè)50mL的離心管內(nèi)800g、4℃離心15min；

(2)離心后抽取上層血漿于50mL離心管中放于4℃冰箱中保存；

(3)將離心管中的血細(xì)胞與生理鹽水1:1稀釋，緩慢加至淋巴細(xì)胞細(xì)胞分離液上層，800G、20℃離心17min；

(4)離心后提取單個(gè)核細(xì)胞(即白膜層)置于50mL離心管內(nèi)，加入生理鹽水洗滌，300G、4℃離心8min，洗2遍；

(5)細(xì)胞計(jì)數(shù)后將細(xì)胞進(jìn)行CD4和CD8磁珠分選，并將獲得的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞按細(xì)胞數(shù)量比1:1進(jìn)行混合，細(xì)胞接種在包被過RetroNectin60μL/瓶、CD3單抗15μL/瓶、PBS 10mL/瓶的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入完全培養(yǎng)液50-60mL，所述完全培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)液中加入IL-2為1000IU/mL，IFN-γ為1000IU/mL，慶大霉素為160IU/mL，IL-1α為50-150IU/mL，5％自體血漿，放入5％CO₂培養(yǎng)箱中，37℃進(jìn)行非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞的培養(yǎng)。

(6)隔日顯微鏡下觀察，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)和數(shù)量適量補(bǔ)充完全培養(yǎng)基；

(7)14d左右非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞成熟，提前進(jìn)行質(zhì)控檢測(cè)，合格后結(jié)合醫(yī)囑回收細(xì)胞，用生理鹽水洗3遍，重懸后低速離心、棄上清，用適量含有20％白蛋白的生理鹽水重懸細(xì)胞

第二方面，本發(fā)明提供如第一方面所述的藥物組合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，所述腫瘤為肺癌、乳腺癌、腎癌或肝癌中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選為腎癌。

優(yōu)選地，所述抗腫瘤藥物還包括藥學(xué)上接受的輔料。

優(yōu)選地，所述輔料為賦形劑、稀釋劑、載體、調(diào)味劑、粘合劑和填充劑中的任意一種或至少兩種的組合。

第三方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)如第一方面所述的藥物組合物對(duì)腎癌細(xì)胞抑制作用的方法，包括如下步驟：

通過將如第一方面所述的藥物組合物移植到患有腎癌的模型生物體內(nèi)，檢測(cè)模型生物體內(nèi)腎癌腫瘤組織塊來判斷藥物組合物對(duì)腎癌細(xì)胞的抑制作用。

本發(fā)明中，所述模型用于非治療目的的檢測(cè)藥物組合物對(duì)腎癌細(xì)胞抑制作用，通過將藥物組合物移植到患有腎癌的免疫缺陷小鼠體內(nèi)，構(gòu)建可有效模擬腎癌病人體內(nèi)病理微環(huán)境的人源化小鼠模型，并在該模型中模擬臨床治療模型多次移植藥物組合物，確保藥物組合物的穩(wěn)定供給，通過腫瘤監(jiān)控評(píng)估藥物組合物對(duì)腎癌的治療作用。

優(yōu)選地，所述藥物組合物轉(zhuǎn)移的頻率為2-5周一次，例如可以是2周一次、3周一次、4周一次或5周一次，優(yōu)選為3周一次，以及上述數(shù)值之間的具體點(diǎn)值，限于篇幅及出于簡(jiǎn)明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點(diǎn)值。

根據(jù)本發(fā)明，所述模型生物體為本領(lǐng)域常規(guī)的模型生物，本發(fā)明模型生物可以選自兔、鼠、貓、狗或猴中的任意一種模型生物，優(yōu)選為免疫缺陷小鼠模型。

優(yōu)選地，所述檢測(cè)的方式為量取腎癌腫瘤組織塊大小、稱量腎癌腫瘤組織塊重量、熒光素酶-活體成像技術(shù)或流式細(xì)胞儀和免疫組化技術(shù)中的任意一種或至少兩種的組合。

根據(jù)本發(fā)明，所述量取肝癌腫瘤組織塊大小、稱量肝癌腫瘤組織塊重量的方式、熒光素酶-活體成像技術(shù)或流式細(xì)胞儀和免疫組化技術(shù)為本領(lǐng)域常規(guī)的量取方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行選擇，在此不做特殊限定。

第四方面，本發(fā)明提供如第三方面所述的方法在評(píng)估藥物組合物對(duì)腎癌細(xì)胞抑制效果中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明藥物組合物包括PD-1抗體和非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞，兩種組分協(xié)同作用，能夠明顯抑制腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并對(duì)腎癌細(xì)胞具有殺傷作用；

(2)本發(fā)明藥物組合物對(duì)腎癌有明顯的治療效果，按RESIST標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)均達(dá)到PR(部分緩解)或接近CR(完全緩解)，有效率達(dá)100％，而副作用都十分微小，無3或4級(jí)不良反應(yīng)發(fā)生。

附圖說明

圖1為成熟的非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，其中，圖1(A)為CD3+CD4+細(xì)胞的結(jié)果，圖1(B)為CD3+CD8+細(xì)胞的結(jié)果，PE和FITC為流式細(xì)胞儀的通道；

圖2為施用本發(fā)明藥物組合物后臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，圖2(A)-(B)治療前的腦胸部轉(zhuǎn)移灶的腫瘤大小結(jié)果圖，圖2(C)-(D)治療2月后腦胸部轉(zhuǎn)移灶的腫瘤大小結(jié)果圖，圖2(E)-(F)治療6月后腦胸部轉(zhuǎn)移灶的腫瘤大小結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明施用本發(fā)明藥物組合物后臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，圖3(A)-(E)治療前的骨、肝、腦、胰腺及右腎多發(fā)轉(zhuǎn)移灶腫瘤大小結(jié)果圖，圖3(F)-(J)治療3月后各器官多發(fā)轉(zhuǎn)移灶腫瘤大小結(jié)果圖，圖3(K)-(O)治療5月后病灶腫瘤大小結(jié)果圖，圖3(P)-(T)治療11月后病灶腫瘤大小結(jié)果圖；

圖4施用本發(fā)明藥物組合物后臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，圖4(A)-(E)治療前的胸腹部多發(fā)轉(zhuǎn)移灶腫瘤大小結(jié)果圖，圖4(F)-(J)治療45天后胸腹部多發(fā)轉(zhuǎn)移灶腫瘤大小結(jié)果圖，圖4(K)-(O)治療3月后病灶腫瘤大小結(jié)果圖，圖4(P)-(T)治療5月后病灶腫瘤大小結(jié)果圖；

圖5施用本發(fā)明藥物組合物后臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，圖5(A)、圖5(C)和圖5(E)為治療前的肺部多發(fā)轉(zhuǎn)移灶的腫瘤大小結(jié)果圖，圖5(B)、圖5(D)和圖5(F)為治療2.5月后肺部多發(fā)轉(zhuǎn)移灶的腫瘤大小結(jié)果圖；

圖6施用本發(fā)明藥物組合物后臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，圖6(A)-(D)為治療4周期后肺部轉(zhuǎn)移灶的腫瘤大小結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明所采取的技術(shù)手段及其效果，以下結(jié)合附圖并通過具體實(shí)施方式來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明并非局限在實(shí)施例范圍內(nèi)。

實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可通過正規(guī)渠道商購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1：制備非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞

所述非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞的制備方法包括如下步驟：

(1)抽取病人外周血50mL(肝素鈉抗凝)，分裝在兩個(gè)50mL的離心管內(nèi)800g、4℃離心15min；

(2)離心后抽取上層血漿于50mL離心管中放于4℃冰箱中保存；

(3)將離心管中的血細(xì)胞與生理鹽水1:1稀釋，緩慢加至淋巴細(xì)胞細(xì)胞分離液上層，800g、20℃離心17min；

(4)離心后提取單個(gè)核細(xì)胞(即白膜層)置于50mL離心管內(nèi)，加入生理鹽水洗滌，300g、4℃離心8min，洗2遍；

(5)細(xì)胞計(jì)數(shù)后將細(xì)胞進(jìn)行CD4和CD8磁珠分選，并將獲得的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞按細(xì)胞數(shù)量比1:1進(jìn)行混合，細(xì)胞接種在包被過(RetroNectin60μL/瓶、CD3單抗15μL/瓶、PBS 10mL/瓶)的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入完全培養(yǎng)液50-60mL，所述完全培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)液中加入IL-2為1000IU/mL，IFN-γ為1000IU/mL，慶大霉素為160IU/mL，IL-1α為50-150IU/mL，5％自體血漿，放入5％CO₂培養(yǎng)箱中，37℃進(jìn)行非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞的培養(yǎng)；

(6)隔日顯微鏡下觀察，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)和數(shù)量適量補(bǔ)充完全培養(yǎng)基；

(7)14d后非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞成熟，提前進(jìn)行質(zhì)控檢測(cè)，合格后結(jié)合醫(yī)囑回收細(xì)胞，用生理鹽水洗3遍(重懸后低速離心、棄上清)，用適量含有20％白蛋白的生理鹽水重懸細(xì)胞。

將細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀鑒定，結(jié)果如圖1(A)-1(B)所示，CD3+CD4+含量為34.66％，CD3+CD8+含量為68.16％，符合細(xì)胞發(fā)放標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)施例2：藥物組合物對(duì)小鼠模型腎癌細(xì)胞的抑制作用

(1)小鼠腎癌模型的建立采用皮下抑制模型，便于觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。取正常6周齡裸鼠25只，每只老鼠體重約為20g，在每只裸鼠右側(cè)鼠鼠鼷處皮下注射0.2mL腎癌細(xì)胞懸液，10d于接種出長(zhǎng)出2～3mm瘤時(shí)，小鼠黑色素瘤模型制作成功。

(2)分組及處理

造模后小鼠隨機(jī)分成5組，每組5只，分別包括PBS對(duì)照組(腹腔注射滅菌PBS 1mL)，PD-1單抗處理組(腹腔注射2mg/kg)，非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞處理組(雙歧桿菌5.83×10⁹個(gè))，藥物組合物處理組，與接種瘤細(xì)胞后次日開始給藥，每三周給藥一次，連續(xù)給藥4個(gè)周期。

(3)對(duì)小鼠腎癌細(xì)胞抑制作用的研究

停藥次日并稱重處死小鼠，解剖剝離腫瘤塊，稱瘤重，按平均瘤重計(jì)算抑瘤率。抑瘤率＝[(對(duì)照組腫瘤體積-實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積)/對(duì)照組腫瘤體積]×100％。

(4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，處理組與PBS對(duì)照組相比，前者明顯抑制了小鼠腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，PD-1單抗處理組、非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞處理組和藥物組合物處理組的抑瘤率分別為27％、70％、100％。其中，藥物組合物處理組和其他兩組相比，有顯著差異(P<0.05)。說明，藥物組合物處理組使用抑制腎癌細(xì)胞效果要高于其他各組

實(shí)施例3：臨床實(shí)驗(yàn)

男，50歲。2012.12診為左腎透明細(xì)胞癌并肺骨轉(zhuǎn)移，行左腎癌手術(shù)切除后，應(yīng)用雙磷酸鹽維持治療，2013.5因腦轉(zhuǎn)移γ-刀放療。2013.9-2014.10，因肺部腫瘤進(jìn)展口服索坦治療，期間及2013.11因腦部出現(xiàn)新病灶行γ-刀放療及全腦放療。2014.11-2015.5：因腦肺轉(zhuǎn)移進(jìn)展改用依維莫司治療，期間2014.4行γ-刀立體定向放射外科治療。

2015.6-2016.1：因腦胸部腫瘤再次進(jìn)展，應(yīng)用PD-1抗體(keytruda)2mg/kg，三周一次，共8次。非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞5.83×10⁹/次，共11次。結(jié)果如圖2所示，圖2(A)-(B)顯示治療前腎癌腫瘤的最大直徑之和為6.7cm，圖2(C)-(D)顯示治療2月后腦胸部轉(zhuǎn)移灶的腫瘤明顯縮小，圖2(E)-(F)顯示治療6月后腦胸部轉(zhuǎn)移灶的腫瘤的最大直徑之和為1.4cm，腫瘤縮小79.1％，明顯治療2月后腦胸部轉(zhuǎn)移灶逐漸縮小，療效持續(xù)6.5個(gè)月，療效評(píng)價(jià)達(dá)PR(部分緩解)。

2016.2-2016.6.8：腦轉(zhuǎn)移灶再次進(jìn)展，對(duì)癥支持治療，2016年6月8日去世

不良反應(yīng)：回輸PD-1抗體后最高體溫37.8℃，持續(xù)36小時(shí)(沒有用退熱藥物)。輕度乏力(可能與治療無關(guān))。

實(shí)施例4：臨床實(shí)驗(yàn)

男，66歲。2012.6診斷為左腎透明細(xì)胞癌并多發(fā)骨轉(zhuǎn)移，行左腎癌切除術(shù)。

2012.7-2015.7：口服索拉菲尼治療。2013.7行第三腰椎放療(30Gy/10f)，2015.4因左肱骨病理性骨折行左肱骨內(nèi)鋼板內(nèi)固定術(shù)。

2015.7-2015.10：因骨轉(zhuǎn)移進(jìn)展口服舒尼替尼治療。在此期間腫瘤進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到肝、腦、胰腺及右側(cè)腎上腺，口服舒尼替尼期間出現(xiàn)Ⅲ度血小板減少及貧血，Ⅱ度陰囊皮膚潰瘍。

2015.7-2016.8：因腫瘤進(jìn)展無法控制，應(yīng)用PD-1抗體(keytruda)2mg/kg，三周一次，共10次，聯(lián)合非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞5.83×10⁹/次，共10次，結(jié)果如圖3所示，圖3(A)-(E)顯示治療前病灶腫瘤的最大直徑之和為6.1cm，有胸水，圖3(F)-(J)顯示治療3月后病灶腫瘤的最大直徑之和明顯縮小，圖3(K)-(O)顯示治療5月后病灶腫瘤的最大直徑之和幾乎不可見，圖3(P)-(T)顯示治療11月后病灶腫瘤消失，胸水消失，療效持續(xù)大于10個(gè)月，療效評(píng)價(jià)為CR(完全緩解)。

不良反應(yīng)：前2次PD-1抗體回輸后最高體溫38.2℃，1度甲狀腺功能減低。

實(shí)施例5：臨床實(shí)驗(yàn)

男，79歲。2016.6診斷為左腎透明細(xì)胞癌，行左腎癌根治術(shù)。

2015.10-2016.3：因胸腹部多發(fā)轉(zhuǎn)移，口服阿昔替尼治療，效果差，腫瘤持續(xù)進(jìn)展，出現(xiàn)皮疹及腹瀉3級(jí)不良反應(yīng)。

2015.6-至今：應(yīng)用PD-1抗體2mg/kg，三周一次，共聯(lián)合非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞5.83×10⁹/次6次。為緩解第三腰椎疼痛在免疫治療前進(jìn)行了局部放療，結(jié)果如圖4所示，圖4(A)-(E)顯示治療前病灶腫瘤的最大直徑之和為6.3cm，圖4(F)-(J)顯示治療45天后病灶腫瘤的最大直徑之和為0.6cm，圖4(K)-(O)顯示治療3月后病灶腫瘤的最大直徑之和明顯縮小，圖4(P)-(T)顯示治療5月后病灶腫瘤的最大直徑之和為0.6cm，腫瘤縮小91.5％，治療持續(xù)大于7個(gè)月，療效評(píng)價(jià)為PR(部分緩解)。

不良反應(yīng)：每次PD-1抗體及回輸后皮膚出現(xiàn)數(shù)片蕁麻疹，不用藥物自行消退。

實(shí)施例6：臨床實(shí)驗(yàn)

男，65歲，右腎癌3期術(shù)后3月出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，應(yīng)用索拉菲尼治療2年半后耐藥出現(xiàn)疾病進(jìn)展，應(yīng)用PD-1抗體2mg/kg，三周一次，共聯(lián)合非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞5.83×10⁹/次6次，結(jié)果如圖5(A)-(F)所示，治療前轉(zhuǎn)移肺的腫瘤最大直徑之和為2.3cm，治療1月后轉(zhuǎn)移肺的腫瘤的最大直徑之和縮小為1.9cm，腫瘤縮小23.5％，治療1月后復(fù)查肺部轉(zhuǎn)移灶開始縮小，治療2月半后復(fù)查腫瘤幾乎消失，療效評(píng)價(jià)為CR(完全緩解)。

不良反應(yīng)：副作用為PD1回輸后低熱、乏力，3天后緩解，自述副作用遠(yuǎn)較索拉菲尼小。

實(shí)施例7：臨床實(shí)驗(yàn)

男，58歲。2014年11月行右腎癌根治術(shù)，術(shù)后11月出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。

2015年11月至2016年7月：應(yīng)用PD-1抗體2mg/kg，三周一次，共聯(lián)合非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞5.83×10⁹/次6次，結(jié)果如圖6(A)-圖6(D)所示，治療前轉(zhuǎn)移肺的腫瘤最大直徑之和為1.2cm，治療11月后轉(zhuǎn)移肺的腫瘤細(xì)胞基本消失，療效持續(xù)大于11個(gè)月，療效評(píng)價(jià)為CR(完全緩解)。

不良反應(yīng)：無明顯不良反應(yīng)。

綜上所述，本發(fā)明藥物組合物通過PD-1抗體和非特異性擴(kuò)增激活T細(xì)胞協(xié)同作用，對(duì)腎癌有明顯的治療效果，按RESIST標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)均達(dá)到PR(部分緩解)或接近CR(完全緩解)，有效率達(dá)100％，而副作用都十分微小，無3或4級(jí)不良反應(yīng)發(fā)生。

申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)方法才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。