本發(fā)明涉及細胞因子的用途技術領域，尤其涉及重組的人源Ang-2在制備保護豬內(nèi)皮細胞免于人抗體介導的補體依賴型細胞毒性的藥物中的用途。

背景技術：

人類器官供體的缺乏是器官移植的最主要的限制之一。豬器官被認為是解決這個問題的最適宜的供體來源?？墒?，在豬器官移植到靈長類動物中，凝血調(diào)節(jié)紊亂和炎癥反應仍然是一個問題。血管內(nèi)皮細胞，這類細胞與人類免疫細胞的相互作用在異種移植中具有重要的作用。內(nèi)皮細胞損傷和功能性失調(diào)在炎癥與凝血反應的發(fā)展中具有重要的影響因素，并且在靈長類動物或者人類受體中，能夠影響后來豬異種移植后的存活時間。在血清中，異源抗體，例如，Gal抗體和Neu5Gc抗體，能夠誘導由抗體介導的依賴于補體的細胞毒性，進而導致內(nèi)皮細胞的損傷。在炎癥反應中，細胞因子起重要的作用。在以前的報道中發(fā)現(xiàn)人源IL-4和IL-13，而不是IL-11，TGF-β₂或者IL-10，保護豬內(nèi)皮細胞防止通過激活的PI3K/AKT信號途徑而進行的人類抗體介導的補體依賴型細胞毒性(CDC)?？墒?，這些細胞因子抑制或者促進內(nèi)皮細胞毒性，是否是通過人類抗體介導的補體依賴型細胞毒性，人們?nèi)匀皇遣磺宄?。在血管發(fā)育中血管生成素具有重要的作用并且它們可以穩(wěn)定其整體性。血管生成素1(Ang-1)是一種對內(nèi)皮血管特異性受體酪氨酸激酶2的特異配體，這個激酶在血管成熟和血管重塑中具有重要的意義。Ang-1/Tie2途徑能夠增強血管的整體性和通過激活PI3K/AKT信號途徑的從而促進內(nèi)皮細胞的存活時間。Ang-2與Ang1共用Tie2受體，在與Ang1共通作用下，同樣的被認為在血管增長和血管重塑過程具有重要的作用。對于Tie2，Ang-1被認為是一種激動劑，而Ang-2被認為是拮抗劑，起相反的作用。

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，Ang-1和Ang-2保護豬內(nèi)皮細胞防止通過激活的PI3K/AKT信號途徑而進行的人類抗體介導的補體依賴型細胞毒性。Ang-1和Ang-2不能改變IgM或者IgG對于PIECs的結(jié)合，以及在Ang-1和Ang-2處理下不能上調(diào)表達PIECs補體調(diào)節(jié)因子(CD46、CD55和CD59)。

基于以上發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供一種重組的人源Ang-2在制備保護豬內(nèi)皮細胞免于人抗體介導的補體依賴型細胞毒性的藥物中的用途。

進一步地，上述豬內(nèi)皮細胞是豬髂骨動脈內(nèi)皮細胞。

進一步地，上述重組的人源Ang-2是通過腺病毒介導表達的人源Ang-2。

進一步地，上述腺病毒介導表達的過程中，通過實時定量PCR和/或半定量PCR檢測人源Ang-2的mRNA的表達水平。

進一步地，上述實時定量PCR和/或半定量PCR所使用的用于檢測人源Ang-2的引物對是：

5’-agaaccagacggctgtgatg-3’(SEQ ID NO：3)和

5’-gaagttcaagtctcgtggtct-3’(SEQ ID NO：4)。

進一步地，上述實時定量PCR和/或半定量PCR以GAPDH作為內(nèi)參，用于檢測上述內(nèi)參的引物對是：

5’-acagacagccgtgtgttcc-3’(SEQ ID NO:5)和

5’-accttcaccatcgtgtctca-3’(SEQ ID NO:6)。

進一步地，上述重組的人源Ang-2通過激活PI3K/AKT通路來保護豬內(nèi)皮細胞免于人抗體介導的補體依賴型細胞毒性。

基于本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，Ang-1和Ang-2保護PIECs免于人源抗體介導的CDC，因此Ang-1和Ang-2可以作為制備保護豬內(nèi)皮細胞免于人抗體介導的補體依賴型細胞毒性的藥物的重要活性成分。

附圖說明

圖1顯示Ang-1和Ang-2誘導保護PIECs免于人源抗體介導的CDC。(A)PIECs用重組人EGF(100ng/ml)、bFGF(50ng/ml)、VEGF₁₆₅(100ng/ml)、IL-33(40ng/ml)、IL-17(100ng/ml)、Ang-1(500ng/ml)、IL-4(20ng/ml)或作為陰性對照(NC)的培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時，然后暴露于人血清以誘導抗體介導的CDC。(B)PIECs用不同濃度的rhAng-1(50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml)或作為NC的培養(yǎng)基處理48小時，然后暴露于人血清誘導抗體介導的CDC。(C)PIECs用rhAng-1(500ng/ml)或培養(yǎng)基作為NC處理0、24小時、48小時或72小時，然后暴露于人血清以誘導抗體介導的CDC。(D-E)PIECs用rhAng-1(500ng/ml)、rhAng-2(500ng/ml)或作為NC的培養(yǎng)基處理0、24小時、48小時或72小時，然后暴露于人血清誘導抗體介導的CDC。通過CCK8(D)或中性紅(E)評價細胞毒性的程度。(F)PIEC用不同濃度的rhAng-2(200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml)或作為NC的培養(yǎng)基處理48小時，然后暴露于人血清誘導抗體介導的CDC。(G)PIECs用rhAng-1(500ng/ml)、rhAng-2(500ng/ml)、rhAng-1加rhAng-2或作為NC的培養(yǎng)基處理48小時，然后暴露于人血清誘導抗體介導的CDC。數(shù)據(jù)代表至少三個獨立實驗(平均值±SEM)。通過Student's t檢驗，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

圖2顯示利用腺病毒系統(tǒng)在PIECs中異位表達Ang-1和Ang-2保護PIECs免于人源抗體介導的CDC。(A)使用腺病毒系統(tǒng)構(gòu)建人Ang-1或Ang-2基因。包裝腺病毒。PIECs用ADV-Ang-1，ADV-Ang-2或ADV-EV(空載體)感染72小時，然后暴露于人血清誘導抗體介導的CDC。(B-C)PIECs用ADV-Ang-1(B)，ADV-Ang-2(C)或ADV-EV感染72小時。收集總RNA用于RT-PCR分析。用人Ang-1引物(B)或Ang-2引物(C)評估m(xù)RNA水平，并標準化至豬GAPDH。(D)如(B-C)中所述收集RNA，并使用人Ang-1、Ang-2或豬GAPDH引物通過半定量PCR評估m(xù)RNA水平(N.D.＝未測定)。數(shù)據(jù)代表至少三個獨立實驗(平均值±SEM)。通過Student's t檢驗，***p<0.001。

圖3顯示在PIEC中，rhAng-1或rhAng-2不上調(diào)CD46、CD55或CD59的表達。(A-B)PIECs用rhAng-1(500ng/ml)(A)或rhAng-2(500ng/ml)(B)處理0、2h、6h或12h。通過RT-PCR檢測CD46、CD55或CD59的mRNA水平。數(shù)據(jù)代表至少三個獨立實驗(平均值±SEM)。

圖4顯示人IgG或IgM與PIECs的結(jié)合程度不受rhAng-1或rhAng-2影響。(A-B)PIECs用rhAng-1(500ng/ml)、rhAng-2(500ng/ml)或作為NC的培養(yǎng)基處理48小時，然后與熱滅活的人血清溫育30分鐘。通過流式細胞術(A)檢測人IgM和IgG與PIEC的結(jié)合。通過幾何平均熒光強度(Gmean)(B)評價人IgM或IgG與PIEC的結(jié)合程度。數(shù)據(jù)代表至少三個獨立實驗(平均值±SEM)。通過Student's t檢驗，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

圖5顯示rhAng-1或rhAng-2需要PI3K/AKT途徑以誘導保護PIECs免于人源抗體介導的CDC。(A-B)PIECs用rhAng-1(500ng/ml)(A)或rhAng-2(500ng/ml)(B)處理0、15分鐘、30分鐘或60分鐘。使用針對p-AKT和肌動蛋白的抗體通過蛋白質(zhì)印跡分析裂解物。(C-D)PIECs用渥曼青霉素(wortmannin)(100ng/ml)或DMSO處理3小時，然后暴露于rhAng-1(500ng/ml)(C)或rhAng-2(500ng/ml)(D)0或15分鐘。通過用針對p-AKT和肌動蛋白的抗體進行western印跡分析裂解物。(E-F)PIECs用渥曼青霉素(100ng/ml)或DMSO處理3小時，然后暴露于rhAng-1(500ng/ml)(E)、rhAng-2(500ng/ml)(F)或作為NC的培養(yǎng)基48小時，然后暴露于人血清以誘導抗體介導的CDC。數(shù)據(jù)代表至少三個獨立實驗(平均值±SEM)。通過Student's t檢驗，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

具體實施方式

下面通過具體實驗結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。

1實驗材料

1.1細胞系

實驗中主要培養(yǎng)的細胞系是豬髂骨動脈內(nèi)皮細胞(PIECs)。

1.2細胞因子

重組人的表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(bFGF)、VEGF₁₆₅、IL-33、IL-17、Ang-1、Ang-2和IL-4均購自美國R&D Systems公司。

1.3抗體

肌動蛋白(Actin)和p-AKT購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.4實驗試劑

渥曼青霉素(Wortmannin)購自美國Selleck公司。其它試劑為常規(guī)試劑。

2實驗方法

2.1細胞培養(yǎng)

實驗中培養(yǎng)的細胞系用含10％胎牛血清、1％P/S，DMEM培養(yǎng)基。溫度37℃，5％二氧化碳飽和濕度。

2.2抗體介導的補體依賴的細胞毒性實驗

在96孔板中培養(yǎng)PIECs，每孔4×10³個細胞，用重組細胞因子刺激0、24h、48h、72h(圖1C)，所有其他實驗延長48h。細胞因子刺激后棄培養(yǎng)基，加入含20％混合的多名健康人的血清(n＝20，含ABO血型)孵育2h，以熱滅活的人血清作為對照。2h后，用CCK8檢測PIECs的活性(圖1D)，棄培養(yǎng)基并加入含10％CCK8的RPMI-1640孵育2h。采用multiscan GO分光光度計測OD450吸光度。細胞死亡率(細胞毒性)按以下公式計算：

％細胞性＝(對照毒組OD-實驗組OD)/對照組OD×100

細胞存活性亦采用中性紅色染色方法檢測(圖1E)，細胞毒性百分率采用與CCK8同樣的計算方法計算。

2.3腺病毒介導的Ang-1和Ang-2在PIECs中的表達

按照文獻Song X,H Gao,Y Lin,et al.Alterations in the microbiota drive interleukin-17C production from intestine epithelial cells to promote tumorigenesis[J].Immunity,2014,40(1):140-152構(gòu)建腺病毒過表達質(zhì)粒。構(gòu)建ADV-Ang-1和ADV-Ang-2質(zhì)粒后，將ADV-Ang-1、ADV-Ang-2及空載體ADV-EV轉(zhuǎn)染293T細胞進行包裝腺病毒。對重組腺病毒進行擴增、純化、滴度檢測及稀釋，終濃度為10¹⁰至10¹¹/mlPBS。ADV-Ang-1、ADV-Ang-2、ADV-EV感染PIECs72h，然后暴露于人血清誘導抗體介導CDC。

2.4實時定量PCR和半定量PCR檢測人Ang-1和Ang-2的mRNA水平

采用提取總RNA，用Transcript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(中國北京TransGene Biotech公司)合成cDNA。采用SYBRPremix Ex Taq試劑盒(中國大連Takara公司)檢測人的Ang-1和Ang-2基因水平。這兩種基因的表達以均以GAPDH作為內(nèi)參，以2^-ΔΔct方法計算。在ViiA7實時定量PCR儀(美國Applied Biosystems)上進cDNA的擴增，對于半定量PCR，使用人Ang-1、Ang-2或豬GAPDH引物通過PCR擴增cDNA，PCR產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳

核苷酸引物的序列如下：

人的Ang-1：5’-aaacatgaagtcggagatgg-3’(SEQ ID NO：1)和

5’-ttctccagcagctgtatctc-3’(SEQ ID NO：2)。

人的Ang-2：5’-agaaccagacggctgtgatg-3’(SEQ ID NO：3)和

5’-gaagttcaagtctcgtggtct-3’(SEQ ID NO：4)。

豬的GAPDH：5’-acagacagccgtgtgttcc-3’(SEQ ID NO：5)和

5’-accttcaccatcgtgtctca-3’(SEQ ID NO：6)。

2.5流式細胞術檢測IgG、IgM的結(jié)合

混合多名健康人的血清在56℃中加熱滅活30min。取1×10⁶個PIECs細胞，用20％滅活的人血清在37℃孵育30min。PBS洗一次后，加入10％山羊血清避免非特異性結(jié)合，再加入FITC標記的山羊抗人IgM和IgG抗體，避光4℃條件下孵育30min，以不加人血清的細胞作為對照組。清洗之后用流式細胞儀進行檢測，IgG、IgM與PIECs的結(jié)合程度以幾何平均熒光強度表示。

3實驗結(jié)果

3.1Ang-1和Ang-2保護PIECs免于人源抗體介導的CDC

重組的人源Ang-1(rhAng-1)保護PIECs免于人抗體介導的CDC，殺傷效率從65％下降到25％(圖1A)。rhAng-1的保護效果優(yōu)于rhIL-4(圖1A)。然而，在這個模型中，人源EGF、bFGF、VEGF₁₆₅、IL-33和IL-17對于PIECs并沒有顯示出保護效應(圖1A)。劑量依賴的實驗表明rhAng-1保護PIECs免于人抗體介導的CDC是劑量依賴的(圖1B)。rhAng-1預處理PIECs48h或者72h比24h的保護效果更好(圖1C)。因此，在后續(xù)的實驗中，我們利用500ng/ml的rh-Ang-1處理PIECs48h。

Ang-2是血管生成素家族的另一個成員，傳統(tǒng)觀點認為其與Ang-1存在拮抗效應。我們利用這個模型探究Ang-2的作用。令人驚奇的是，我們發(fā)現(xiàn)Ang-2與Ang-1的效應相似(圖1D-E)。我們利用中性紅和CCK-8兩種試劑評估殺傷效率得出相似的結(jié)果(圖1D-E)。500ng/ml的rhAng-2預處理PIECs的保護效果更好(圖1F)。rhAng-1和rhAng-2共同處理PIECs所顯現(xiàn)的保護效果與Ang-1、Ang-2單獨處理效果相似(圖1G)。因此Ang-2并沒有抑制Ang-1介導的PIECs的保護效應，這兩個細胞因子對于PIECs的保護也沒顯示出協(xié)同效應。

3.2在PIECs中，腺病毒介導的Ang-1、Ang-2過表達保護PIECs免于人源抗體介導的CDC

我們利用腺病毒系統(tǒng)在PIECs中異位表達Ang-1和Ang-2。ADV-Ang-1或者ADV-Ang-2感染過的PIECs顯著的保護PIECs免于人源抗體介導的CDC(圖2A)。ADV-Ang-1或ADV-Ang-2的保護效果與rhAng-1或rhAng-2的保護效果很接近。實時定量PCR和半定量PCR的結(jié)果表明感染ADV-Ang-1或ADV-Ang-2的PIECs中Ang-1或Ang-2的表達水平很高。

3.3Ang-1或Ang-2并沒有影響補體調(diào)節(jié)因子的表達以及人源抗體結(jié)合PIECs的水平

接下來，我們?nèi)ヌ骄科渲械臋C制，我們首先想到Ang-1或Ang-2是否增加了補體調(diào)節(jié)蛋白的表達或者減少了結(jié)合到PIECs的人源IgM或IgG。我們發(fā)現(xiàn)，Ang-1或Ang-2并沒有上調(diào)CD46和CD55、CD59的mRNA水平反而有一定的下調(diào)，雖然這下調(diào)并不顯著(圖3A-B)。

我們通過流式細胞術分析IgG或IgM結(jié)合PIECs的水平，發(fā)現(xiàn)Ang-1、Ang-2處理組和對照組并沒有明顯差別(圖4A；統(tǒng)計學數(shù)據(jù)顯示在4B)。

Ang-1還具有下調(diào)一些連接蛋白的表達水平，例如Zo-1、Occludin和VE-cadherin，進而達到抗?jié)B的作用。先前有報道顯示連接蛋白Claudin 5上調(diào)可以保護豬的內(nèi)皮細胞免于人源抗體介導的CDC，所以我們利用Ang-1處理PIECs并檢測了Claudin-5、Zo-1和Occludin的表達，發(fā)現(xiàn)這些基因并沒有上調(diào)(數(shù)據(jù)沒顯示)。

3.4PI3K/AKT通路對于Ang-1或Ang-2介導的PIECs免于人源抗體介導的CDC的保護效應是必需的

先前的報道表明IL-4通過激活PI3K/AKT通路保護豬的內(nèi)皮細胞免于人源抗體介導的CDC。Ang-1或Ang-2能夠激活PI3K/AKT通路促進ECs的存活。我們探究Ang-1或Ang-2是否通過激活PI3K/AKT通路保護PIECs免于人源抗體介導的CDC。

我們發(fā)現(xiàn)，在PIECs中，rhAng-1或rhAng-2激活了p-AKT(圖5A-B)。我們利用PI3K的特異性抑制劑-wortmannin處理PIECs，發(fā)現(xiàn)wortmannin抑制了Ang-1或者Ang-2誘導了p-AKT的激活(圖5C-D)。Wortmannin抑制了Ang-1或Ang-2介導的PIECs的保護效應(圖5E-F)。我們也檢測了下游促凋亡和抑凋亡基因是否受到調(diào)控，發(fā)現(xiàn)在在Ang-1或Ang-2處理的PIECs中抑凋亡基因Bcl-2，Bcl-xl和促凋亡基因Bad的水平并沒有明顯變化(數(shù)據(jù)沒顯示)。這些數(shù)據(jù)表明PI3K/AKT通路對于Ang-1或Ang-2介導的PIECs免于人源抗體介導的CDC是必需的，下游調(diào)控的基因仍然有待于進一步研究。

4討論

在免疫調(diào)控中，細胞因子扮演著重要的角色，但是在異種移植中它們的功能是不清楚的。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，Ang-1和Ang-2保護豬內(nèi)皮細胞防止通過激活的PI3K/AKT信號途徑而進行的人源抗體介導的補體依賴型細胞毒性。在PIECs中，重組細胞因子和重組腺病毒過量表達Ang-1或者Ang-2人源抗體介導的補體依賴型細胞毒性具有保護作用。另外，我們發(fā)現(xiàn)人源Ang-1和Ang-2不能上調(diào)表達PIECs補體調(diào)節(jié)因子(CD46、CD55和CD59)。并且在Ang-1和Ang-2處理下，人類IgM或者IgG對PIECs結(jié)合時沒有改變的。這些結(jié)果說明Ang-1和Ang-2在保護PIECs防止人源抗體介導的補體依賴型細胞毒性的功能上具有相似性。在豬－非人類靈長類動物異種移植的模型中，Ang-1和Ang-2促進了異種移植的存活時間。由于腺病毒過來表達Ang-1或者Ang-2模擬轉(zhuǎn)基因豬種所達到的表達量，我們推測在異種移植中，Ang-1轉(zhuǎn)基因豬能夠保護器官的存活。由于在胚胎期，Ang-2轉(zhuǎn)基因小鼠中顯示出干擾血管形成，所以Ang-2轉(zhuǎn)基因豬仔血管生成的過程中有一定的缺陷。

血管生成素，結(jié)合Tie2受體的一類糖蛋白，包括Ang-1、Ang-2和Ang-3/Ang-4。Ang-1是一個通過它對Tie2包外的高親和性結(jié)合第一個被鑒定出來的。通過同源性比對，Ang-2氨基酸相似性達到60％。Ang-1在血管生成和血管重塑上具有重要作用，它對內(nèi)皮細胞有抗炎反應，增加存活時間和抗?jié)B透作用。Ang-1通過影響交界基因的表達，例如Zo-1、Occludin和VE-cadherin，來抑制滲透作用。此前的報道顯示，連接蛋白Claudin-5的上調(diào)表達防止人類抗體介導的補體依賴型細胞毒性來保護豬內(nèi)皮細胞?？墒牵覀儼l(fā)現(xiàn)Ang-1不能增加Claudin-5、Zo-1和Occludin的mRNA水平，這就說明在PIECs中，Claudin-5不是主要因素對于Ang-1調(diào)節(jié)保護。當PIECs暴露在人血清CDC中，在PI3K抑制劑，wortmannin，能夠抑制Ang-1/Ang-2調(diào)節(jié)的防護作用。這些數(shù)據(jù)表明PI3K/AKT介導的內(nèi)皮細胞的存活是Ang-1/Ang-2介導對PIECs防護作用的主要因素。但是在Ang-1/Ang-2處理PIECs后，抗凋亡下游基因的表達，Bcl-2和Bcl-xl沒有增加，促凋亡基因Bad也沒有下降。這些結(jié)果說明，由Ang-1/Ang-2調(diào)節(jié)的PI3K/AKT調(diào)控其他保護PIECs的基因來抑制人類抗體介導的補體依賴型細胞毒性。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)Ang-1和Ang-2，通過相似的機制，防止人類抗體介導的補體依賴型細胞毒性來保護豬內(nèi)皮細胞，以及通過激活PI3K/AKT途徑促進PIECs的存活。Ang-1和Ang-2是異種移植潛在的研究目標。Ang-1和Ang-2對于靈長類的調(diào)控可能對異種移植具有防護作用，以免受到補體的損傷和提升起存活時間。Ang-1轉(zhuǎn)基因豬對異種移植有重要的使用價值。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發(fā)明的保護范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市第二人民醫(yī)院

<120> 重組的人源Ang-2在制備藥物中的用途

<130> 17I23951

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaacatgaag tcggagatgg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttctccagca gctgtatctc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agaaccagac ggctgtgatg 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaagttcaag tctcgtggtc t 21

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acagacagcc gtgtgttcc 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

accttcacca tcgtgtctca 20