本發(fā)明涉及抗腫瘤疫苗領(lǐng)域，更特別地，涉及一種通用腫瘤疫苗組合物和噴劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

癌癥嚴重危及人類的健康和生命，據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)公布的數(shù)據(jù)顯示，每年全球約800萬人死于癌癥。分析檢測數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)，癌癥的發(fā)生存在地區(qū)性和家族性現(xiàn)象。如2003-2007年全國32個腫瘤登記處主要分布在沿海地區(qū)，其中包括7個癌癥高發(fā)現(xiàn)場，即江蘇啟東、浙江嘉善、福建長樂、河南林州、四川鹽亭、廣西扶綏、山東臨朐等。癌家族是指一個家系中惡性腫瘤的發(fā)病率高(約20％)，發(fā)病年齡較早，通常按常染色體顯性方式遺傳，以及某些腫瘤(如腺癌)發(fā)病率很高等。Lynch將上述特點歸納為“癌家族綜合征”。曾經(jīng)報告過一個癌家族，經(jīng)70多年(1895年開始)間的五次調(diào)查，有些支系已傳至第七代，在842名后裔中共發(fā)現(xiàn)95名癌患者，其中患結(jié)腸腺癌48人和子宮內(nèi)膜腺癌18人者占多數(shù)。這95人中有13人腫瘤為多發(fā)性，19人癌發(fā)生于40歲之前；95名患者中72人有雙親之一患癌，男性與女性各47和48人，接近1:1，符合常染色體顯性遺傳。家族性癌是指一個家族內(nèi)多個成員患同一類型的腫瘤，例如，12％～25％的結(jié)腸癌患者有腸癌家族史。許多常見腫瘤如乳腺癌、腸癌、胃癌等，通常是散發(fā)的，但一部分患者有明顯的家族史。此外，患者的一級親屬中發(fā)病率通常高于一般人群3～4倍。這類癌的遺傳方式雖然還不很清楚，但表明一些腫瘤家族聚集現(xiàn)象，或家族成員對這些腫瘤的易感性增高。比如鼻咽癌有明顯的家族聚集現(xiàn)象，許多鼻咽癌患者有家族患癌病史。鼻咽癌具有垂直和水平的家族發(fā)生傾向。

不同種族由于遺傳基因及表觀遺傳學的差異，以及生活習慣的不同，有些腫瘤會在一些種族中高發(fā)。這是癌癥在不同種族發(fā)病情況的差異。

同樣，相對于腫瘤，部分地區(qū)、部分家族也顯現(xiàn)出強大的抗腫瘤能力，長壽現(xiàn)象也同樣具有區(qū)域性和家族性，長壽村在沿海地區(qū)也并不少見，個別家族內(nèi)群體抗腫瘤能力強，平均壽命較長的現(xiàn)像也存在。

腫瘤的發(fā)生一方面與環(huán)境污染、生活習慣有著密切關(guān)系，另一方面我國的腫瘤防治工作也一直存在重治輕防的問題，腫瘤的預防保健教育未能廣泛開展，或者僅存在于喊口號階段，沒有實際行動。公眾對于腫瘤的預防保健認識不夠，或者不知如何進行腫瘤的預防保健。由此可見，對腫瘤的預防保健措施的細化將成為腫瘤防治工作的重點。

因此，需要一種新的通用腫瘤疫苗。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決以上問題，本發(fā)明提供了一種制備通用腫瘤疫苗組合物的方法，其包括以下步驟：

S1：根據(jù)抗腫瘤能力指標從健康群體中篩選具有抗腫瘤能力者；

S2：從所述具有抗腫瘤能力者采集外周血；

S3：從所述外周血中分離得到單核細胞和血漿；

S4：提取所述血漿中的蛋白質(zhì)，得到蛋白粗提物I；

S5：將所述單核細胞培養(yǎng)成一種或多種免疫細胞培養(yǎng)物；

S6：從所述免疫細胞培養(yǎng)物提取蛋白粗提物II；

S7：將所述蛋白粗提物I與蛋白粗提物II混勻，凍干，得到的粉末即所述通用腫瘤疫苗組合物。

進一步地，S1中篩選所述具有抗腫瘤能力者的指標包括：身高、體重、血壓、脈率、心肺功能、血常規(guī)、尿常規(guī)、血糖、肝腎功能、胸片、心電圖、彩超、既往史、家族史、腫瘤易感基因檢測和免疫功能檢測。

進一步地，S4中通過飽和硫酸銨沉淀法來提取所述血漿中的蛋白質(zhì)。

進一步地，S5中，所述免疫細胞為DC、CIK和NK細胞中的一種或多種組合。

進一步地，S6包括以下步驟：

S6.1：從所述免疫細胞培養(yǎng)物分離免疫細胞，留下無細胞培養(yǎng)液待用；

S6.2：破碎所述免疫細胞，離心后收集上清液，將所述上清夜與所述無細胞培養(yǎng)液混合，得到細胞粗提物；

S6.3：通過飽和硫酸銨沉淀法從所述細胞粗提物中提取蛋白質(zhì)，得到蛋白粗提物II。

進一步地，在S7中，凍干前向所述蛋白粗提物I與蛋白粗提物II的混合物中添加抗壞血酸作為蛋白保護劑，然后再進行凍干。

本發(fā)明還公開了一種通用腫瘤疫苗組合物，其通過上述方法制備得到。

本發(fā)明還公開了一種通用腫瘤疫苗霧化噴劑，其通過對上述通用腫瘤疫苗組合物進行殺滅細菌和病毒處理后溶解于藥學可接受的溶劑中，得到所述通用腫瘤疫苗霧化噴劑。

進一步，所述藥學可接受的溶劑為無菌水。

進一步，通過使用鈷⁶⁰照射來殺滅所述通用腫瘤疫苗組合物中的細菌和病毒。

健康極具抗腫瘤能力的人群其本身的免疫能力強，血液中含有具有抗腫瘤能力的因子，抗腫瘤的細胞因子呈高表達狀態(tài)，提取其血漿總同樣含有高表達的細胞因子，另外，從他們的血液中提取的免疫細胞免疫功能強，免疫細胞在體外培養(yǎng)過程中分泌多種細胞因子。因此，本發(fā)明的通用腫瘤疫苗組合物和霧化噴劑中包含多種抗腫瘤細胞因子，例如IL-1家族(IL-1α、IL-1β、IL-1Ra等)、IL-2、IL-12家族(IL-12、IL-23、IL-27和IL-35等)、IL-17家族(IL-17A、IL-17F等)、IL-18、TNF-α、GM-CSF、IFN-γ等有效成分。各種細胞因子在抗腫瘤的過程中起著重要的作用。血漿中的抗腫瘤因子和體外培養(yǎng)過程分泌的具有抗腫瘤作用的因子共同作為霧化噴劑的試劑，可以很好的對腫瘤易感人群起到預防保健的作用。

具體實施方式

以下結(jié)合實例對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

1.具有抗腫瘤能力者的篩選

從健康人群中篩選出具有抗腫瘤能力者，篩選方案如表1所示，選擇一級(評分＞85分)的人作為外周血供體。

表1具有抗腫瘤能力者的篩選

2.通用腫瘤疫苗組合物的制備

通過以下方法制備通用腫瘤疫苗組合物

1)從極具抗腫瘤能力的群體中選擇志愿者，用血細胞單采機采集含有PBMC的外周血100ml；

2)將上述含PBMC的外周血2000r/min離心10-20min,分離單個核細胞與血漿；

3)取血漿,加生理鹽水稀釋,邊攪拌邊緩慢逐滴加入飽和硫酸銨溶液至硫酸銨終濃度50％,4℃靜置6h或過夜,4000r/min離心15-30min,分離沉淀，將沉淀溶于生理鹽水,超濾除鹽濃縮，即得蛋白粗提物I；

4)取單個核細胞，按照常規(guī)方法分別培養(yǎng)DC、CIK細胞；

5)收集DC、CIK細胞，剩下的無細胞培養(yǎng)液待用；通過超聲破碎或反復凍融的方法裂解上述細胞，然后1500×g離心10min，收集上清，將所述上清與所述無細胞培養(yǎng)液混勻，得到細胞粗提物；將所述細胞粗提物進行硫酸銨沉淀，然后透析除鹽，即得蛋白粗提物II；

6)將蛋白粗提物1和蛋白粗提物2混勻后加入0.03mg/ml的抗壞血酸作為蛋白保護劑，而后制成凍干粉，即得到所述通用腫瘤疫苗組合物。

在以上方法中，通過以下步驟來培養(yǎng)DC細胞，并制備腫瘤通用負載物質(zhì)：

1)在PBMC培養(yǎng)物中加入誘導因子來誘導PMBC分化成DC細胞，細胞培養(yǎng)必須在千級超潔凈工作間進行，所有可能開放的操作均應該在百級超潔凈工作臺內(nèi)進行。培養(yǎng)期間對細胞制品進行嚴格質(zhì)量控制，確保無污染。

2)質(zhì)量控制：對細胞形態(tài)進行觀測和免疫表型檢測，確保誘導出功能及表型更加成熟的免疫細胞；并作出無菌試驗、無熱源和支原體試驗，確保細胞的安全性；

3)利用腫瘤通用負載物質(zhì)沖擊DC，使DC成熟，攜帶抗腫瘤信號。

3.制備霧化噴劑

1)于10℃用鈷⁶⁰照射通用腫瘤疫苗組合物干粉，進行病毒滅活處理，將滅活后的干粉分裝保存，鈷⁶⁰輻照劑量為15-30kGy；

2)用雙蒸水溶解分裝后的凍干粉，制成噴劑溶液，即得到所述霧化噴劑，用霧化噴劑裝置進行霧化吸收。

所得到的腫瘤疫苗組合物和霧化噴劑多種抗腫瘤細胞因子，例如IL-1家族(IL-1α、IL-1β、IL-1Ra等)、IL-2、IL-12家族(IL-12、IL-23、IL-27和IL-35等)、IL-17家族(IL-17A、IL-17F等)、IL-18、TNF-α、GM-CSF、IFN-γ等有效成分。各種細胞因子在抗腫瘤的過程中起著重要的作用。血漿中的抗腫瘤因子和體外培養(yǎng)過程分泌的具有抗腫瘤作用的因子共同作為霧化噴劑的試劑，可以很好的對腫瘤易感人群起到預防保健的作用。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。