本發(fā)明屬于生物藥物領(lǐng)域，具體涉及一種由臟毒清制備的含藥血清及其制備方法和在治療結(jié)腸癌上的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

結(jié)腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，它的發(fā)病率和死亡率在世界上分別居于第二位和第三位，四十到五十歲之間發(fā)病率最高，且男性發(fā)病率為女性的2到3倍，早已成為威脅人類健康的重大疾病之一。結(jié)腸癌主要為腺癌、黏液腺癌、未分化癌，其主要發(fā)病原因是高脂肪食物攝入過多和纖維素攝入不足。近年來，臨床上對結(jié)腸癌的治療已取得較大進步，目前西醫(yī)治療結(jié)腸癌多采用手術(shù)、放化療等方法，但總體治療效果仍不佳。因此，探索新型低毒高效的抗結(jié)腸癌中醫(yī)藥非常有意義。中藥是中華民族的寶貴財富，有史以來為中華民族的繁衍昌盛做出了巨大貢獻，其治療理念源遠流長，符合先進醫(yī)學(xué)的發(fā)展方向，抗腫瘤有獨特的優(yōu)勢。中醫(yī)認(rèn)為，結(jié)腸癌是由于臟腑不和，正氣虛弱或氣滯血瘀，毒邪凝聚所致，一般都會采用具有扶正固本、清濕消熱等功能的中藥配方進行治療。

臟毒清(ZDQ)是由聞名全國的老中醫(yī)--河南中醫(yī)學(xué)院一附院終身教授張東岳先生總結(jié)了治療結(jié)腸癌等肛腸病的多年經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，精心篩選整理而成，其中藥方劑為當(dāng)歸15g，黨參20g，焦白術(shù)30g，半枝蓮30g，山慈菇20g，白花蛇舌草30g，白頭翁30g，炙鱉甲20g。當(dāng)歸功效在于補血，活血，調(diào)經(jīng)止痛，潤燥滑腸；黨參功效在于補中益氣，健脾益肺；焦白術(shù)功效在于健脾益氣，燥濕利水，止汗，安胎；半枝蓮功效在于涼血解毒，散瘀止痛，消腫和清熱利濕；山慈菇功效在于清熱解毒，消癰散結(jié)；白花蛇舌草功效在于清熱解毒、消痛散結(jié)、利尿除濕；白頭翁功效在于止痢解毒；炙鱉甲功效在于滋陰潛陽，軟堅散結(jié)。該方劑中八味藥材相輔相成，具有抗炎消腫攻毒，益氣健脾養(yǎng)血，和胃化瘀止痛，軟堅散結(jié)消瘤的功效，臨床上常被應(yīng)用于各種正虛邪戀型大腸腫瘤及臟毒證等疾病并取得良好療效。

中藥血清藥理學(xué)的相關(guān)研究在近年來中藥或中藥復(fù)方研究有了新的進展，它主要是通過模擬中藥或中藥復(fù)方在體內(nèi)的消化、吸收、轉(zhuǎn)化、代謝的一些過程，然后通過采集服用(或注射)中藥的動物的血液并分離血清，進行體外培養(yǎng)實驗研究的一種新的方法。中藥服用或注射的方法及簡稱如下：靜脈注射(iv)、腹腔注射(ip)、口服(po)、皮下注射(ih)、灌胃(ig)、肌注(im)、靜滴(iv)等。這種實驗方法的提出，既可以在一定程度上排除中藥或中藥復(fù)方直接進行體外實驗所產(chǎn)生的難以確定的因素干擾，也可以使實驗結(jié)果的可信度大大提高，更重要的是中藥血清使療效更加顯著。蘆沖等研究發(fā)現(xiàn)，半枝蓮醇提物灌胃大鼠經(jīng)處理獲得的含藥血清對HT-29人結(jié)腸癌細胞有抑制作用，作用機制可能不僅與抑制細胞生長有關(guān)，還和阻滯細胞生長周期及誘導(dǎo)細胞凋亡有關(guān)。范欽等研究發(fā)現(xiàn)，九香蟲灌胃后處理得到的含藥血清孵育SW480人結(jié)腸癌細胞，可促使結(jié)腸癌細胞凋亡，并影響凋亡相關(guān)因子P53、FADD的表達，從而達到抗腫瘤作用。肖海娟等研究發(fā)現(xiàn)，腸胃清灌胃大鼠經(jīng)處理獲得的含藥血清能夠逆轉(zhuǎn)HCT116人結(jié)腸癌鉑類化療耐藥，其機制與促進腫瘤細胞DNA損傷、誘導(dǎo)凋亡有關(guān)。李素云等研究發(fā)現(xiàn)，扶正抑癌方灌胃大鼠經(jīng)處理獲得的含藥血清通過上調(diào)上皮鈣黏蛋白表達和下調(diào)神經(jīng)鈣黏蛋白的表達，抑制lovo細胞的間葉表型細胞即發(fā)生上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變，從而降低lovo細胞的侵襲力和運動能力。李傲等研究發(fā)現(xiàn)，加味三棱丸灌胃大鼠經(jīng)處理獲得的含藥血清可能是通過降低內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細胞雌二醇的分泌水平，從而降低血管內(nèi)皮生長因子的表達和分泌，發(fā)揮其抑制血管生成的作用。安永康等用臟毒清干預(yù)體外培養(yǎng)的SW480結(jié)腸癌細胞研究發(fā)現(xiàn)，臟毒清具有促進人結(jié)腸癌細胞凋亡的作用，并通過線粒體凋亡途徑發(fā)揮作用。目前常用的結(jié)腸癌細胞系有HCT116，HCT8，HT-29，LS174T，LOVO，SW480，SW620等。但暫未發(fā)現(xiàn)使用臟毒清含藥血清對LS174T結(jié)腸癌細胞做相關(guān)研究的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種由臟毒清制備的含藥血清；該含藥血清可有效抑制結(jié)腸癌細胞的增殖、促進其凋亡、抑制其轉(zhuǎn)移。

本發(fā)明還提供一種由臟毒清制備的含藥血清的制備方法及其應(yīng)用。

技術(shù)方案：為了實現(xiàn)上述目的，如本發(fā)明所述的一種由臟毒清制備的含藥血清，所述含藥血清為將臟毒清對大鼠進行灌胃后，采血得到。

其中，所述臟毒清由當(dāng)歸、黨參、焦白術(shù)、半枝蓮、山慈菇、白花蛇舌草、白頭翁和炙鱉甲組成，經(jīng)磨粉、煮沸、煎煮后，將提取液過濾并且蒸餾濃縮得到膏體，再經(jīng)冷凍干燥后粉碎得到。

所述所大鼠為清潔級SD雄性大鼠，大鼠購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，體重為250～400g。

本發(fā)明所述的由川芎醇提物制備的含藥血清的制備方法，包括如下步驟：

(1)給大鼠按體重比灌胃臟毒清(30-50)g/kg；

(2)末次灌胃后1-2h對大鼠進行麻醉，無菌條件下經(jīng)腹主動脈采血；

(3)將血液靜置3-5h，離心，取上清，滅活后過濾除菌，得到含藥血清，分裝，凍存?zhèn)溆谩?/p>

作為優(yōu)選，步驟(1)所述灌胃每日1-2次，持續(xù)4-6d，末次禁食12-14h給藥。

作為優(yōu)選，步驟(3)所述離心為3000-5000rpm，4-6℃離心10-15min。

作為優(yōu)選，步驟(3)所述滅活為56-60℃滅活25-30min。

作為優(yōu)選，步驟(3)所述過濾除菌為通過濾膜過濾除菌，優(yōu)選為0.22um的濾膜。

本發(fā)明所述的由臟毒清制備的含藥血清在制備治療結(jié)腸癌的藥物中應(yīng)用。

進一步地，所述由臟毒清制備的含藥血清在制備治療LS174T結(jié)腸癌細胞的藥物中應(yīng)用。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

1、本發(fā)明由臟毒清制備的含藥血清根據(jù)臟毒清抗炎消腫攻毒，益氣健脾養(yǎng)血，和胃化瘀止痛，軟堅散結(jié)消瘤的特征，可有效抑制結(jié)腸癌細胞的增殖、促進其凋亡、抑制其轉(zhuǎn)移。

2、本發(fā)明以LS174T結(jié)腸癌細胞作為模型，使用臟毒清灌胃大鼠后處理得到的含藥血清培養(yǎng)LS174T結(jié)腸癌細胞，對于抑制結(jié)腸癌細胞的增殖、促進其凋亡、抑制其轉(zhuǎn)移的效果明顯要優(yōu)于臟毒清以及現(xiàn)有治療結(jié)腸癌的藥物；其中給大鼠按體重比灌胃臟毒清(30-50)g/kg制備的含藥血清，取濃度為15％(與DMEM培養(yǎng)基體積比)的含藥血清抑制LS174T結(jié)腸癌細胞存活率可以達到45.72％以下，促進LS174T結(jié)腸癌細胞存活率凋亡率達到34.12％以上；而臟毒清和現(xiàn)有治療結(jié)腸癌的藥物抑制細胞存活率最好的效果僅為82.42％、70.23％，臟毒清和現(xiàn)有治療結(jié)腸癌的藥物促進凋亡率最好的效果為15.48％、16.78％；同時該含藥血清可以有效的抑制LS174T結(jié)腸癌細胞的遷移能力，從而驗證其具有抑制結(jié)腸癌的良好效果；本發(fā)明臟毒清制備的含藥血清制備的藥物在治療結(jié)腸癌時也具有顯著的效果。

3、本發(fā)明的制備方法安全可控，并且便于操作、保管、貯存和運輸。

附圖說明

圖1為將實施例4給大鼠按體重比灌胃臟毒清50g/kg制備的含藥血清以及對照組孵育Transwell細胞，Transwell細胞遷移檢測細胞遷移能力的示意圖；

圖2為將實施例5給大鼠按體重比灌胃臟毒清40g/kg制備的含藥血清以及對照組孵育Transwell細胞，Transwell細胞遷移檢測細胞遷移能力的示意圖；

圖3為將實施例6給大鼠按體重比灌胃臟毒清30g/kg制備的含藥血清以及對照組孵育Transwell細胞，Transwell細胞遷移檢測細胞遷移能力的示意圖。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1

由臟毒清制備的含藥血清

(1)首先稱取當(dāng)歸15g，黨參20g，焦白術(shù)30g，半枝蓮30g，山慈菇20g，白花蛇舌草30g，白頭翁30g，炙鱉甲20g，由河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院提供生草藥，經(jīng)磨粉、煎煮、提取后合并提取液，將提取液通過200目篩網(wǎng)過濾并且蒸餾濃縮得到膏體，再經(jīng)冷凍干燥后粉碎得到臟毒清。

(2)給400g清潔級SD雄性大鼠按體重比灌胃臟毒清50g/kg，每日1次，持續(xù)4d，末次禁食12h給藥；

(2)末次灌胃后1h對大鼠用戊巴比妥鈉麻醉進行麻醉，無菌條件下經(jīng)腹主動脈采血；

(3)將血液靜置3h，3000rpm，4℃離心15min，取上清，56℃滅活30min后通過0.22μm濾膜過濾除菌，得含藥血清，分裝，凍存于－80℃冰箱備用。

實施例2

由臟毒清制備的含藥血清

(1)首先稱取當(dāng)歸15g，黨參20g，焦白術(shù)30g，半枝蓮30g，山慈菇20g，白花蛇舌草30g，白頭翁30g，炙鱉甲20g，由河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院提供生草藥，經(jīng)磨粉、煎煮、提取后合并提取液，將提取液通過200目篩網(wǎng)過濾并且蒸餾濃縮得到膏體，再經(jīng)冷凍干燥后粉碎得到臟毒清。

(2)給300g清潔級SD雄性大鼠按體重比灌胃臟毒清40g/kg，每日2次，持續(xù)6d，末次禁食14h給藥；

(2)末次灌胃后2h對大鼠用戊巴比妥鈉麻醉進行麻醉，無菌條件下經(jīng)腹主動脈采血；

(3)將血液靜置5h，5000rpm，6℃離心10min，取上清，60℃滅活25min后通過0.22μm濾膜過濾除菌，得含藥血清，分裝，凍存于－80℃冰箱備用。

實施例3

由臟毒清制備的含藥血清

(1)首先稱取當(dāng)歸15g，黨參20g，焦白術(shù)30g，半枝蓮30g，山慈菇20g，白花蛇舌草30g，白頭翁30g，炙鱉甲20g，由河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院提供生草藥，經(jīng)磨粉、煎煮、提取后合并提取液，將提取液通過200目篩網(wǎng)過濾并且蒸餾濃縮得到膏體，再經(jīng)冷凍干燥后粉碎得到臟毒清。

(2)給250g清潔級SD雄性大鼠按體重比灌胃臟毒清30g/kg，每日2次，持續(xù)5d，末次禁食12h給藥；

(2)末次灌胃后2h對大鼠用戊巴比妥鈉麻醉進行麻醉，無菌條件下經(jīng)腹主動脈采血；

(3)將血液靜置3h，5000rpm，4℃離心10min，取上清，60℃滅活25min后通過0.22μm濾膜過濾除菌，得含藥血清，分裝，凍存于－80℃冰箱備用。

實施例4

將實施例1給大鼠按體重比灌胃臟毒清50g/kg后處理得到的含藥血清孵育LS174T結(jié)腸癌細胞。

將LS174T結(jié)腸癌細胞解凍復(fù)蘇后加入含有(體積比)10％胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基制成細胞懸液，分種于培養(yǎng)瓶中并置于5％CO₂(細胞培養(yǎng)的常規(guī)環(huán)境，CO₂體積分?jǐn)?shù)為5％)，飽和濕度95％，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。正常培養(yǎng)時約每天更換1次培養(yǎng)液，等到細胞生長融合度達到70％-80％時進行傳代培養(yǎng)；傳代培養(yǎng)時首先棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液，加入37℃磷酸緩沖鹽溶液(PBS)液洗瓶2次，在25cm²培養(yǎng)瓶中加入2mL濃度為0.25％的胰蛋白酶(即2.5g/L的胰蛋白酶溶液)進行消化。然后在倒置顯微鏡下仔細隨時觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)回縮、細胞間隙變大時終止消化。接下來棄去胰酶溶液，加入含濃度(體積比)10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基之后用吸管輕柔吹打使貼壁細胞懸浮。緊接著將含懸浮細胞的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至10mL離心管中，1500rpm離心5min，棄上清液。將細胞重新懸浮于5mL含(體積比)10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基中。細胞計數(shù)結(jié)束，選擇合適濃度將細胞分裝到新的無菌培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)。最后6h后可見細胞貼壁，以后每2-3天換液次，待細胞長滿瓶底70％-80％后再次消化傳代。

取4-6代的生長良好，融合度約為60％-70％的細胞進行細胞實驗。呈亞融合狀態(tài)的細胞，輕柔吹打配成單細胞懸液并接種于96孔培養(yǎng)板，24孔培養(yǎng)板以及Tranwell鋪板，細胞貼壁生長24h后用各個分組對細胞進行孵育24h處理，具體分組情況如下：

對照組(共設(shè)6組，組1-組6)：

1、空白對照組：用無血清DMEM培養(yǎng)液孵育細胞24h；

2、胎牛血清對照組：DMEM培養(yǎng)液中僅加入血清(所述血清為標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，購自杭州四季青生物科技有限公司)，血清濃度(體積比)為15％，該DMEM培養(yǎng)液孵育細胞24h；

3、空白血清對照組：DMEM培養(yǎng)液中僅加入血清(血清采集方法與實施例1相同，不同在于沒有灌胃)，血清濃度(體積比)為15％，該DMEM培養(yǎng)液孵育細胞24h；

4、臟毒清對照組：用臟毒清與沒有灌胃的大鼠得到的血清進行混合(血清采集方法與實施例1相同，不同在于沒有灌胃，臟毒清與實施例1的大鼠體重的重量比為50g/kg)，然后加入到DMEM培養(yǎng)液中，血清濃度(體積比)為15％，用該DMEM培養(yǎng)液孵育細胞24h；

5、生理鹽水對照組：給大鼠按體重比灌胃生理鹽水50g/kg得到的血清(血清采集方法與實施例1相同，不同之處臟毒清換成生理鹽水)加入到DMEM培養(yǎng)液中加入，血清濃度(體積比)為15％，用該DMEM培養(yǎng)液孵育細胞24h；

6、現(xiàn)有藥物對照組：用現(xiàn)有治療結(jié)腸癌藥物5-Fu(5-氟尿嘧啶)與沒有灌胃的大鼠得到的血清進行混合(血清采集方法與實施例1相同，不同在于沒有灌胃，5-Fu與實施例1的大鼠體重的重量比為50g/kg，5-Fu購買于上海旭東海普藥業(yè)有限公司)，然后加入到DMEM培養(yǎng)液中，血清濃度(體積比)為15％，用該DMEM培養(yǎng)液孵育細胞24h；

對照組中沒有設(shè)置5-氟尿嘧啶灌胃制備含藥血清對照組及5-氟尿嘧啶注射制備含藥血清對照組是由于5-氟尿嘧啶注射是其常用方法，不適合灌胃使用，而在本實施例中注射就失去其本身對照組的意義。

處理組(共設(shè)2組，組7和組8)：

按實施例1給大鼠按體重比灌胃臟毒清50g/kg制得的含藥血清加入到DMEM培養(yǎng)液中，配制出含藥血清濃度(體積比)為15％和20％兩種DMEM培養(yǎng)液，分別用濃度15％和20％含藥血清DMEM培養(yǎng)液孵育細胞24h。

實施例5

將實施例2給大鼠按體重比灌胃臟毒清40g/kg后處理得到的含藥血清孵育LS174T結(jié)腸癌細胞，具體的細胞培養(yǎng)方法與實施例4相同，

對照組(共設(shè)6組，組1-組6)：

1、空白對照組：用無血清DMEM培養(yǎng)液孵育細胞24h；

2、胎牛血清對照組：DMEM培養(yǎng)液中僅加入血清(所述血清為標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，購自杭州四季青生物科技有限公司)，血清濃度(體積比)為15％，該DMEM培養(yǎng)液孵育細胞24h；

3、空白血清對照組：DMEM培養(yǎng)液中僅加入血清(血清采集方法與實施例2相同，不同在于沒有灌胃)，血清濃度(體積比)為15％，該DMEM培養(yǎng)液孵育細胞24h；

4、臟毒清對照組：用臟毒清與沒有灌胃的大鼠得到的血清進行混合(血清采集方法與實施例2相同，不同在于沒有灌胃，臟毒清與實施例2大鼠體重的重量比為40g/kg)，然后加入到DMEM培養(yǎng)液中，血清濃度(體積比)為15％，用該DMEM培養(yǎng)液孵育細胞24h；

5、生理鹽水對照組：給大鼠按體重比灌胃生理鹽水40g/kg得到的血清(血清采集方法與實施例2相同，不同之處臟毒清換成生理鹽水)加入到DMEM培養(yǎng)液中加入，血清濃度(體積比)為15％，用該DMEM培養(yǎng)液孵育細胞24h；

6、現(xiàn)有藥物對照組：用現(xiàn)有治療結(jié)腸癌藥物5-Fu(5-氟尿嘧啶)與沒有灌胃的大鼠得到的血清進行混合(血清采集方法與實施例2相同，不同在于沒有灌胃，5-Fu與實施例2大鼠體重的重量比為40g/kg)，然后加入到DMEM培養(yǎng)液中，血清與DMEM培養(yǎng)液重量比為15％，用該DMEM培養(yǎng)液孵育細胞24h；

處理組(共設(shè)2組，組7和組8)：

按實施例2給大鼠按體重比灌胃臟毒清40g/kg制得的含藥血清加入到DMEM培養(yǎng)液中，配制出含藥血清濃度(體積比)為15％和20％兩種DMEM培養(yǎng)液，分別用濃度15％和20％含藥血清DMEM培養(yǎng)液孵育細胞24h。

實施例6

將實施例3給大鼠按體重比灌胃生理鹽水30g/kg后處理得到的含藥血清孵育LS174T結(jié)腸癌細胞，具體的細胞培養(yǎng)方法與實施例4相同，

①對照組(共設(shè)6組，組1-組6)：

1、空白對照組：用無血清DMEM培養(yǎng)液孵育細胞24h；

2、胎牛血清對照組：DMEM培養(yǎng)液中僅加入血清(所述血清為標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，購自杭州四季青生物科技有限公司)，血清濃度(體積比)為15％，該DMEM培養(yǎng)液孵育細胞24h；

3、空白血清對照組：DMEM培養(yǎng)液中僅加入血清(血清采集方法與實施例2相同，不同在于沒有灌胃)，血清濃度(體積比)為15％，該DMEM培養(yǎng)液孵育細胞24h；

4、臟毒清對照組：用臟毒清與沒有灌胃的大鼠得到的血清進行混合(血清采集方法與實施例3相同，不同在于沒有灌胃，臟毒清與實施例3大鼠體重的重量比為30g/kg)，然后加入到DMEM培養(yǎng)液中，血清濃度(體積比)為15％，用該DMEM培養(yǎng)液孵育細胞24h；

5、生理鹽水對照組：給大鼠按體重比灌胃生理鹽水30g/kg得到的血清(血清采集方法與實施例3相同，不同之處臟毒清換成生理鹽水)加入到DMEM培養(yǎng)液中加入，血清濃度(體積比)為15％，用該DMEM培養(yǎng)液孵育細胞24h；

6、現(xiàn)有藥物對照組：用現(xiàn)有治療結(jié)腸癌藥物5-Fu(5-氟尿嘧啶)與沒有灌胃的大鼠得到的血清進行混合(血清采集方法與實施例3相同，不同在于沒有灌胃，5-Fu與實施例3大鼠體重的重量比為30g/kg)，然后加入到DMEM培養(yǎng)液中，血清與DMEM培養(yǎng)液重量比為15％，用該DMEM培養(yǎng)液孵育細胞24h；

處理組(共設(shè)2組，組7和組8)：

按實施例3給大鼠按體重比灌胃臟毒清30g/kg制得的含藥血清加入到DMEM培養(yǎng)液中，配制出含藥血清濃度(體積比)為15％和20％兩種DMEM培養(yǎng)液，分別用濃度15％和20％含藥血清DMEM培養(yǎng)液孵育細胞24h。

試驗例1MTT方法檢測藥物對LS174T結(jié)腸癌細胞增殖活性的作用

MTT全稱3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，漢語化學(xué)名為3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，是一種黃色的染料。處于增殖期的活細胞線粒體中含有的琥珀脫氫酶可使外源性的MTT還原成難溶的針狀Formazan結(jié)晶，呈藍紫色，并沉淀在活細胞中，細胞活力與Formazan的形成量成正比，DMSO能使Formazan結(jié)晶溶解，使用酶標(biāo)儀于波長570nm處測定吸收值，以此間接反映細胞增殖的情況。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。

分別取實施例4，5，6各分組孵育后制備的96孔板的細胞，每孔定量加100μL含(體積比)15％胎牛血清(FBS)完全培養(yǎng)基，然后置于5％CO₂，飽和濕度95％，37℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)24～72h；培養(yǎng)終止前4h加入10μL/孔(濃度為5mg/mL)的MTT；繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心吸棄上清培養(yǎng)液后加100μL/孔二甲基亞砜(DMSO)終止反應(yīng)，于振蕩器上震蕩10min左右，使結(jié)晶物充分溶解；酶標(biāo)儀570nm檢測OD值，實驗至少重復(fù)三次。記錄結(jié)果，計算存活率。

細胞存活率(％)＝處理組平均OD值/對照組平均OD值×100％；結(jié)果見表1至3。

表1 50g/kg的臟毒清灌胃大鼠時MTT法檢測LS174T結(jié)腸癌細胞存活率

*表示與對照組比較差異顯著

表2 40g/kg的臟毒清灌胃大鼠時MTT法檢測LS174T結(jié)腸癌細胞存活率

*表示與對照組比較差異顯著

表3 30g/kg的臟毒清灌胃大鼠時MTT法檢測LS174T結(jié)腸癌細胞存活率

*表示與對照組比較差異顯著

由表1至3可知，給大鼠按體重比分別灌胃臟毒清50、40、30g/kg制備得到的含藥血清，當(dāng)使用體積比15％和20％的含藥血清時LS174T結(jié)腸癌細胞存活率可以達到45.72％和45.58％以下，與臟毒清對照組的細胞存活率以及現(xiàn)有藥物對照組的細胞存活率相比具有明顯的優(yōu)勢，都具有很好的抑制LS174T結(jié)腸癌細胞存活效果，說明本發(fā)明實施例制備的含藥血清具有良好的抑制LS174T結(jié)腸癌細胞的存活的作用。

由表2可知，給大鼠按體重比灌胃臟毒清40g/kg制得的含藥血清效果最好，15％和20％含藥血清組的細胞存活率分別是42.18％，42.20％效果最好；20％含藥血清組時細胞存活率與15％含藥血清組無統(tǒng)計學(xué)差異，因此，通過給大鼠按體重比灌胃臟毒清40g/kg制得的含藥血清，使用其15％的含藥血清就可以取得良好的抑制LS174T結(jié)腸癌細胞存活效果。

試驗例2流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

磷脂酞絲氨酸(PS)只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。在鞘液的約束和包圍下，待測樣本的細胞排成單列由流動室噴嘴高速噴出，而形成細胞液柱。液柱在通過檢測區(qū)時，在入射激光束的照射下可產(chǎn)生側(cè)向散射光(SSC)和前向散射光(FSC)，它們分別反映細胞顆粒度和大小，根據(jù)這些特性將細胞分類。樣本經(jīng)一種或幾種特殊熒光標(biāo)記后，可在激光束的激發(fā)下產(chǎn)生特定熒光，該特定熒光可被光學(xué)系統(tǒng)檢測并分析，由此得到相應(yīng)的各種細胞特性。AnnexinV是一種分子量35～36kDa的Ca²⁺依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結(jié)合。將AnnexinV進行FITC標(biāo)記，以標(biāo)記了AnnexinV作為熒光探針，利用流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發(fā)生。

分別取實施例4，5，6各分組孵育后制備的24孔板的細胞，棄去培養(yǎng)上清后每孔加入0.5mL濃度為0.25％的胰蛋白酶(即2.5g/L的胰蛋白酶溶液)，在倒置顯微鏡下觀察待細胞開始變圓，加少量含血清培養(yǎng)液，終止消化，吹打懸浮細胞后移至離心管中，1000rpm下離心10min，棄上清，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，用250μL結(jié)合緩沖液重懸細胞。調(diào)節(jié)其濃度為1×10⁶/mL，取100μL細胞懸液于5mL流式管中，加入5μL AnnexinVFITC和10μL 20μg/mL的PI溶液，混勻后室溫避光孵育15min，在反應(yīng)管中加入400μL PBS，上流式細胞儀分析。實驗結(jié)果經(jīng)計算機軟件ModFitLT3.0分析軟件分析細胞周期細胞數(shù)，每組實驗至少重復(fù)3次，結(jié)果見表4至6。

表4 50g/kg的臟毒清灌胃大鼠時LS174T結(jié)腸癌細胞凋亡率的變化

*表示與對照組比較差異顯著

表5 40g/kg的臟毒清灌胃大鼠時LS174T結(jié)腸癌細胞凋亡率的變化

*表示與對照組比較差異顯著

表6 30g/kg的臟毒清灌胃大鼠時LS174T結(jié)腸癌細胞凋亡率的變化

*表示與對照組比較差異顯著

由表4至6可知，給大鼠按體重比分別灌胃臟毒清50、40、30g/kg制備得到的含藥血清，當(dāng)使用體積比15％和20％的含藥血清時LS174T結(jié)腸癌細胞存活率可以達到34.12％和34.47％以上，與臟毒清對照組的細胞存活率以及現(xiàn)有藥物對照組的細胞存活率相比具有明顯的優(yōu)勢，都可以使LS174T結(jié)腸癌細胞的凋亡率大大增加，說明本發(fā)明實施例制備的含藥血清具有良好的促進LS174T結(jié)腸癌細胞的凋亡的作用。

由表5可知，給大鼠按體重比灌胃臟毒清40g/kg制得的含藥血清效果最好，15％和20％含藥血清組的細胞凋亡率分別是39.78％，39.75％效果最好；20％含藥血清組時細胞存活率與15％含藥血清組無統(tǒng)計學(xué)差異，因此，通過給大鼠按體重比灌胃臟毒清40g/kg制得的含藥血清，使用其15％的含藥血清就可以取得良好的促使LS174T結(jié)腸癌細胞凋亡效果。

試驗例3Transwell侵襲實驗檢測臟毒清含藥血清對細胞侵襲能力的影響

細胞遷移實驗是將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱為上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔，將研究的腫瘤細胞種在上室內(nèi)，下室加入含F(xiàn)BS或某些特定的趨化因子的培養(yǎng)液，由于聚碳酸酯膜具有通透性，腫瘤細胞會向營養(yǎng)成分高的下室遷移，計數(shù)進入下室的細胞數(shù)量就能反應(yīng)細胞的遷移能力。

分別取實施例4，5，6的Transwell鋪板細胞經(jīng)過各個分組對細胞進行孵育處理24h后，細胞的終濃度大小約為5×10⁵個/mL；24孔板的下室內(nèi)加入500μL的含(體積比)20％FBS的DMEM，在Transwell小室內(nèi)加入100μL的細胞懸液，常規(guī)培養(yǎng)24h；細胞培養(yǎng)完成后，輕提Transwell小室，傾倒室內(nèi)的培養(yǎng)基，用適量的PBS將細胞洗滌2遍，之后每孔加入1mL 4％的多聚甲醛(4％的多聚甲醛為4g多聚甲醛融于100mLPBS中制得；PBS緩沖液的配制：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24，加入800mL去離子水，充分?jǐn)嚢?，用HCl調(diào)節(jié)pH值至7.4，補充去離子水定容至1000mL，高壓蒸汽滅菌，保存于4℃。)固定細胞15min，PBS再清洗3次，每次5min，再使用0.1％的結(jié)晶紫染色細胞30min，用PBS洗滌3次，每次5min，使用超純水輕輕沖洗濕潤小室表面的細胞，最后用濕潤棉簽輕輕擦去未遷移過膜的細胞，風(fēng)機風(fēng)干；倒置Transwell小室，顯微鏡進行觀察和拍照。于顯微鏡下隨機選取5個視野觀察細胞，并計數(shù)遷移細胞數(shù)。

圖1為實施例1給大鼠按體重比灌胃臟毒清50g/kg制備的含藥血清孵育LS174T結(jié)腸癌細胞，Transwell細胞遷移檢測細胞遷移能力，具體分組參照實施例4，其中1空白對照組；2胎牛血清對照組；3空白血清對照組；4臟毒清對照組；5生理鹽水對照組；6現(xiàn)有藥物對照組；7濃度(體積比)15％含藥血清組；8濃度(體積比)20％含藥血清組。圖中＊為P<0.05，差異顯著。

圖2為實施例2給大鼠按體重比灌胃臟毒清40g/kg制備的含藥血清孵育LS174T結(jié)腸癌細胞，Transwell細胞遷移檢測細胞遷移能力，具體分組參照實施例5，其中1空白對照組；2胎牛血清對照組；3空白血清對照組；4臟毒清對照組；5生理鹽水對照組；6現(xiàn)有藥物對照組；7濃度(體積比)15％含藥血清組；8濃度(體積比)20％含藥血清組。圖中＊為P<0.05，差異顯著。

圖3為實施例3給大鼠按體重比灌胃臟毒清30g/kg制備的含藥血清孵育LS174T結(jié)腸癌細胞，Transwell細胞遷移檢測細胞遷移能力，具體分組參照實施例6，其中1空白對照組；2胎牛血清對照組；3空白血清對照組；4臟毒清對照組；5生理鹽水對照組；6現(xiàn)有藥物對照組；7濃度(體積比)15％含藥血清組；8濃度(體積比)20％含藥血清組。圖中＊為P<0.05，差異顯著。

從圖1至3可以看出，給大鼠按體重比分別灌胃臟毒清50g/kg、40g/kg和30g/kg后經(jīng)腹主動脈取血離心后，將其配制成與DMEM培養(yǎng)液體積比15％、20％的含藥血清對LS174T結(jié)腸癌細胞進行孵育，結(jié)果表明含藥血清孵育的LS174T結(jié)腸癌細胞相對于4臟毒清對照組、6現(xiàn)有藥物對照組遷移能力顯著降低，說明本發(fā)明實施例制備的含藥血清具有良好的抑制LS174T結(jié)腸癌細胞遷移的作用。