本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種納米粒，包含載體材料、活性成分和靶向分子，所述載體材料為人血清白蛋白，所述活性成分是能夠預(yù)防和/或治療神經(jīng)退行性疾病的活性成分。本發(fā)明還涉及制備所述納米粒的方法，含有所述納米粒的藥物組合物，以及所述納米?；蛩幬锝M合物在制備用于預(yù)防和/或治療受試者的神經(jīng)退行性疾病的藥物中的用途。

背景技術(shù)：

1、阿爾茨海默癥膽堿能假說

阿爾茨海默癥(AD)是以記憶和認(rèn)知能力進(jìn)行性減退為主要特征的神經(jīng)退行性疾病，目前，對于AD發(fā)生的病因仍沒有明確的定論，主要集中在膽堿能學(xué)說及β-淀粉樣蛋白(Aβ)學(xué)說。

中樞膽堿能系統(tǒng)與學(xué)習(xí)、記憶密切相關(guān)，乙酰膽堿是中樞膽堿能系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，其主要功能是維持意識的清醒，在學(xué)習(xí)記憶中起重要作用。盡管AD的確切病因還仍是未知，但是患者特定腦區(qū)神經(jīng)元大量丟失是導(dǎo)致認(rèn)知和記憶能力進(jìn)行性減退的直接原因，尤其是海馬區(qū)膽堿能神經(jīng)元的丟失。目前，美國FDA批準(zhǔn)上市用于治療AD的藥物共有五種，分別為他克林、新斯的明、加蘭他敏、多奈哌齊和美金剛，前四種均為可逆性乙酰膽堿酯酶抑制劑。乙酰膽堿酯酶抑制劑可較牢固地與體內(nèi)乙酰膽堿酯酶相互作用，占據(jù)酶位點，使酶失去分解乙酰膽堿的功能，從而間接升高突觸間隙內(nèi)乙酰膽堿的濃度，達(dá)到緩解AD的療效。

2、現(xiàn)有藥物應(yīng)用的局限

目前，用于治療AD的藥物仍很局限，不僅是因為其始發(fā)機制不明確，還由于大腦復(fù)雜的防御體系，造成藥物無法穿透血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)，靶向進(jìn)入中樞；此外，即使有部分藥物透過BBB，在膜外排轉(zhuǎn)運體(如：p-糖蛋白)作用下仍會被泵出。普通藥物的這些局限雖然可以通過化學(xué)修飾得以克服，但是，修飾后藥效下降、修飾過程中可能引入毒副產(chǎn)物及修飾過程復(fù)雜等問題也會應(yīng)運而生。對于蛋白及多肽類藥物，它們在外周蛋白酶的作用下很快分解失活，限制了大量效應(yīng)分子的應(yīng)用。

以AD為代表的神經(jīng)退行性疾病是一類慢性疾病，患者在確診后，需長期不間斷服藥，甚至終身服藥?，F(xiàn)有AD治療藥物血漿半衰期較短、血腦屏障穿透能力差、代謝速度快等問題，使患者需每日按時、按量服藥，這對記憶力日益減退的病人來說是很困難的。所以，制備高效、緩釋、靶向性強的治療AD的藥物刻不容緩。

3、納米藥物研究進(jìn)展

現(xiàn)有的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)為靶向目標(biāo)的納米藥物中，多數(shù)是采用人工合成聚合物類材料作為載體，即在目標(biāo)藥物外層包裹載體材料，當(dāng)載體材料在靶位點降解時，內(nèi)核藥物即被釋放。此類納米藥物制備簡單，穩(wěn)定性高，在一定程度上無毒且易于降解。

但是，以AD為代表的神經(jīng)退行性疾病屬于老年慢性疾病，患者腦代謝能力減退，這些外源性人工合成聚合物類材料及其降解產(chǎn)物無疑會增加腦的負(fù)擔(dān)，因此在制備AD納米藥物時，應(yīng)更加重視材料的生物相容性以及材料代謝產(chǎn)物的毒性。

基于如上原因，印度的ShrinidhA.Joshi研究組采用生物相容性較好的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)作為載體，裝載AD治療藥物利斯的明，利用沉降法制備包裹型納米粒。從材料的安全性角度來看，雖然PLGA在一定程度上增強了生物相容性，但中樞靶向性差、藥物釋放迅速，依然不能滿足慢性疾病的治療需求(Shrinidh A.Joshi,Sandip S.Chavhan等，Rivastigmine-loaded PLGA and PBCA nanoparticles:Preparation,optimization,characterization,in vitro and pharmacodynamic studies，European Journal of Pharmaceuticsand Biopharmaceutics 76(2010)189–199)。

英國的Helen F.Stanyon研究組發(fā)現(xiàn)在生理水平上，人血清白蛋白(HSA)不僅可以與外周血漿中95％的Aβ結(jié)合，還可與腦脊液中近一半的Aβ單體結(jié)合，有效抑制β-淀粉樣蛋白纖維的形成，并顯著降低原纖維的總量；除此之外，HSA還可通過剝奪Aβ-Cu(Ⅱ)復(fù)合物中的Cu(Ⅱ)，降低金屬離子的催化作用，雙重機制抑制原纖維的形成(Helen F.Stanyon and John H.Viles，Human Serum Albumin Can Regulate Amyloid-βPeptide Fiber Growth in the Brain Interstitium,J.Biol.Chem.2012,287:28163-28168)。

綜上所述，目前無論是分子藥物還是現(xiàn)有的納米藥物，均無法滿足神經(jīng)退行性疾病高效、緩釋、靶向的治療需求。人血清白蛋白作為一種天然蛋白質(zhì)，展現(xiàn)出了良好的材料屬性及針對Aβ的靶向?qū)傩?。因此，亟需開發(fā)利用人血清白蛋白納米粒作為載體材料的納米藥物，來滿足高效、緩釋、靶向的治療需求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。并且，本文中所涉及的實驗室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的常規(guī)步驟。同時，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語的定義和解釋。

如本文中使用的，術(shù)語“納米?！?nanoparticle,NP)是指粒徑在納米級的粒子，例如粒徑不大于1000nm的粒子，例如粒徑在10nm～100nm、100nm～200nm、200nm～300nm、300nm～400nm、400nm～500nm、500nm～600nm、600nm～700nm、700nm～800nm、800nm～900nm或900nm～1000nm之間的粒子。

如本文中使用的，術(shù)語“粒徑”即“等效粒徑”，是指當(dāng)被測粒子的某種物理特性或物理行為與某一直徑的同質(zhì)球體(或組合)最相近時，就把該球體的直徑(或組合)作為被測粒子的等效粒徑(或粒度分布)。

如本文中使用的，術(shù)語“平均粒徑”是指對于一個由大小和形狀不相同的粒子組成的實際粒子群，與一個由均一的球形粒子組成的假想粒子群相比，如果兩者的粒徑全長相同，則稱此球形粒子的直徑為實際粒子群的平均粒徑。平均粒徑的測量方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如光散射法；平均粒徑的測量儀器包括但不限于光散射粒度儀。

如本文中使用的，術(shù)語“膽堿能遞質(zhì)補充劑”是指外源性地對膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)(膽堿能遞質(zhì))進(jìn)行補充的活性成分(例如藥物)。

如本文中使用的，術(shù)語“前體藥物”是指化合物經(jīng)修飾后得到的在體外無活性或活性較小、在體內(nèi)經(jīng)酶或非酶的轉(zhuǎn)化釋放出活性藥物而發(fā)揮藥效的化合物。前體藥物的設(shè)計原理以及制備方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。

如本文中使用的，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”是指(1)化合物中存在的酸性官能團(例如-COOH、-OH、-SO₃H等)與適當(dāng)?shù)臒o機或者有機陽離子(堿)形成的鹽，例如化合物與堿金屬或堿土金屬形成的鹽、化合物的銨鹽，和化合物與含氮有機堿形成的鹽；以及(2)化合物中存在的堿性官能團(例如-NH₂等)與適當(dāng)?shù)臒o機或者有機陰離子(酸)形成的鹽，例如化合物與無機酸或有機羧酸形成的鹽。

因此，本申請中，“藥學(xué)上可接受的鹽”包括但不限于，堿金屬鹽，如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽等；堿土金屬鹽，如鈣鹽、鎂鹽等；其他金屬鹽，如鋁鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、鎳鹽、鈷鹽等；無機堿鹽，如銨鹽；有機堿鹽，如叔辛基胺鹽、二芐基胺鹽、嗎啉鹽、葡糖胺鹽、苯基甘氨酸烷基酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基葡糖胺鹽、胍鹽、二乙胺鹽、三乙胺鹽、二環(huán)己基胺鹽、N,N’-二芐基乙二胺鹽、氯普魯卡因鹽、普魯卡因鹽、二乙醇胺鹽、N-芐基-苯乙基胺鹽、哌嗪鹽、四甲基胺鹽、三(羥甲基)氨基甲烷鹽；氫鹵酸鹽，如氫氟酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽等；無機酸鹽，如硝酸鹽、高氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等；低級烷磺酸鹽，如甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、乙磺酸鹽等；芳基磺酸鹽，如苯磺酸鹽、對苯磺酸鹽等；有機酸鹽，如醋酸鹽、蘋果酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽等；氨基酸鹽，如甘氨酸鹽、三甲基甘氨酸鹽、精氨酸鹽、鳥氨酸鹽、谷氨酸鹽、天冬氨酸鹽等。

如本文中使用的，術(shù)語“神經(jīng)退行性疾病”是指由神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性病變所引起的疾病，包括但不限于阿爾茲海默癥(AD)、帕金森氏癥、亨廷頓氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化和腦脊髓多發(fā)性硬化。如本文中使用的，術(shù)語“良溶劑”是指能夠溶解人血清白蛋白的溶劑，所述良溶劑包括但不限于水和氯化鈉溶液。

如本文中使用的，術(shù)語“不良溶劑”是指不能溶解人血清白蛋白的溶劑，所述不良溶劑包括但不限于乙醇。

如本文中使用的，術(shù)語“室溫”是指25±5℃。

如本文中使用的，術(shù)語“約”應(yīng)該被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，并將隨其所用之處的上下文而有一定程度的變化。如果根據(jù)術(shù)語應(yīng)用的上下文，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，其使用不是清楚的，那么“約”的意思是不超過所述特定數(shù)值或范圍的正負(fù)10％。

為了滿足阿爾茲海默癥等神經(jīng)退行性疾病的治療需求，發(fā)明人通過深入的研究和創(chuàng)造性的勞動，得到了本申請的納米粒，其可以用于遞送血腦屏障透過性差和/或血漿半衰期短的藥物，有效地實現(xiàn)了藥物的中樞靶向與緩釋目標(biāo)，由此提供了下述發(fā)明：

在一個方面，本發(fā)明提供了一種納米粒，包含載體材料、活性成分和靶向分子，所述載體材料為人血清白蛋白，所述活性成分是能夠預(yù)防和/或治療神經(jīng)退行性疾病的活性成分。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在載體材料的選擇上，天然蛋白類藥物載體人血清白蛋白納米?？梢杂行У貪M足中樞靶向給藥的各項要求。首先，人血清白蛋白與Aβ單體具有較高的親和力，具有針對Aβ的靶向?qū)傩?，在保證能大量包裹藥物分子的同時，可迅速靶向病灶部位，實現(xiàn)了材料自身的優(yōu)良靶向性能。

另外，天然蛋白類材料的生物安全性高，滿足藥學(xué)領(lǐng)域的使用要求，無免疫原性，分解產(chǎn)物為氨基酸，可作為人體自身的營養(yǎng)成分重新利用或轉(zhuǎn)化為其他含氮物，最大程度地降低了外源性有機或無機高分子材料對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷與負(fù)擔(dān)。

在某些實施方案中，所述活性成分裝載在載體材料中，形成人血清白蛋白載藥納米粒。

在某些實施方案中，所述人血清白蛋白載藥納米粒是通過包含以下步驟的方法形成的：

步驟(1-1)：將人血清白蛋白和活性成分溶解或分散于良溶劑中，形成溶液(1)；

步驟(1-2)：將溶液(1)滴加至不良溶劑中，并加入交聯(lián)劑進(jìn)行反應(yīng)，得到人血清白蛋白載藥納米粒。

在某些實施方案中，所述納米粒的載藥率為15％至25％，例如15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％。

在某些實施方案中，所述活性成分選自膽堿能遞質(zhì)補充劑和膽堿酯酶抑制劑。

在某些實施方案中，所述膽堿能遞質(zhì)補充劑選自乙酰膽堿、乙酰膽堿的前體藥物或乙酰膽堿藥學(xué)上可接受的鹽(例如鹽酸鹽)。

在某些實施方案中，所述膽堿能遞質(zhì)補充劑為乙酰膽堿或氯化乙酰膽堿。

在某些實施方案中，所述膽堿酯酶抑制劑選自利斯的明、加蘭他敏或多奈哌齊，或這些化合物藥學(xué)上可接受的鹽(例如酒石酸鹽)。

在某些實施方案中，所述膽堿酯酶抑制劑為重酒石酸利斯的明。

為保證足夠的中樞輸入劑量，增強納米粒的中樞靶向性，納米粒的表面修飾有靶向分子，以增加納米粒對血腦屏障的通透性，實現(xiàn)高效的中樞靶向輸運。

在某些實施方案中，所述靶向分子選自表面活性劑、聚乙二醇類高分子和血腦屏障特異性抗體。

在某些實施方案中，所述靶向分子為表面活性劑。

在某些實施方案中，所述靶向分子為吐溫-80。

在某些實施方案中，所述靶向分子修飾在納米粒的表面。

在某些實施方案中，所述靶向分子修飾在人血清白蛋白載藥納米粒的表面。

在某些實施方案中，所述靶向分子通過吸附作用修飾在納米粒的表面。

在某些實施方案中，所述納米粒的直徑為150nm至250nm；例如，150nm至180nm、180nm至200nm、200nm至220nm或220nm至250nm；例如150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm或250nm。

在某些實施方案中，所述納米粒的zeta電位為-30mV至+20mV，例如-30mV至-20mV、-20mV至-10mV、-10mV至0、0至+10mV或+10mV至+20mV；例如-30mV、-25mV、-20mV、-15mV、-10mV、-5mV、0、+5mV、+10mV、+15mV或+20mV。

在某些實施方案中，所述納米粒的包封率為40％至50％，例如40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％。

圖1示例性地顯示了本申請的納米粒的一種結(jié)構(gòu)。圖中所示的納米粒中，以具有Aβ靶向?qū)傩缘腍SA作為納米載體，包裹裝載了能夠治療AD的藥物，并且，在HSA納米粒的表面修飾有靶向分子，以提高HSA納米粒的血腦屏障(BBB)透過性，并延長體內(nèi)循環(huán)時間。

在一個方面，本申請?zhí)峁┝酥苽渖鲜黾{米粒的方法，所述方法包括以下步驟：

步驟(1)：制備人血清白蛋白載藥納米粒；

步驟(2)：在人血清白蛋白載藥納米粒的表面修飾靶向分子。

在某些實施方案中，所述步驟(1)中，制備人血清白蛋白載藥納米粒的方法為反溶劑法。。

在某些實施方案中，所述步驟(1)包括以下步驟：

步驟(1-1)：將人血清白蛋白和活性成分溶解或分散于良溶劑中，形成溶液(1)；

步驟(1-2)：將溶液(1)滴加至不良溶劑中，并加入交聯(lián)劑進(jìn)行反應(yīng)，得到人血清白蛋白載藥納米粒。

在某些實施方案中，所述步驟(1-1)中，人血清白蛋白與活性成分的質(zhì)量比為1:1至10:1，例如1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。

在某些實施方案中，所述步驟(1-1)中，所述良溶劑為氯化鈉溶液。

在某些實施方案中，所述步驟(1-1)中，氯化鈉溶液的濃度為1mmol/L至20mmol/L，例如1mmol/L至5mmol/L、5mmol/L至10mmol/L、10mmol/L至15mmol/L或15mmol/L至20mmol/L。

在某些實施方案中，所述步驟(1-1)還包括：調(diào)節(jié)溶液(1)的pH。

在某些實施方案中，所述不良溶劑為乙醇。

在某些實施方案中，所述步驟(1-2)在攪拌下進(jìn)行。

在某些實施方案中，所述步驟(1-2)中的交聯(lián)劑為戊二醛。

本發(fā)明中，加入交聯(lián)劑可以使人血清白蛋白顆粒發(fā)生交聯(lián)固化，使其在水溶液中不會立即溶脹散開，避免過快地釋放出顆粒內(nèi)包裹的藥物。

在某些實施方案中，所述步驟(1)還包括步驟(1-3)：對人血清白蛋白載藥納米粒進(jìn)行分離。

在某些實施方案中，所述步驟(1-3)中，通過離心對人血清白蛋白載藥納米粒進(jìn)行分離。

在某些實施方案中，所述步驟(2)包括以下步驟：

步驟(2-1)：將人血清白蛋白載藥納米粒分散于生理鹽水中；得到溶液(2)；

步驟(2-2)：將溶液(2)與靶向分子或其溶液混合。

在某些實施方案中，所述靶向分子的溶液為靶向分子的生理鹽水溶液。

在某些實施方案中，所述靶向分子的溶液中，靶向分子的質(zhì)量百分濃度為0.1％至10％，例如0.1％至0.5％、0.5％至1％、1％至5％或5％至10％。

在某些實施方案中，在步驟(2-2)中，通過攪拌和/或超聲進(jìn)行混合。

在某些實施方案中，在步驟(1)之后，對裝載藥物的人血清白蛋白納米粒的載藥率和包封率進(jìn)行測試。

圖2示例性地顯示了制備本申請的納米粒的方法。圖中所述的方法包括：將活性成分(例如乙酰膽堿或利斯的明)與HSA進(jìn)行混合，在戊二醛的作用下，HSA發(fā)生交聯(lián)，形成HSA載藥納米粒；在HSA載藥的表面修飾靶向分子(例如吐溫-80)，得到修飾后的載藥納米粒。

在一個方面，本申請?zhí)峁┝艘环N藥物組合物，其含有上述納米粒。

本發(fā)明中，任選地，所述藥物組合物還包含藥學(xué)上可接受的輔料(例如載體和/或賦形劑)。在某些實施方案中，所述載體和/或賦形劑選自:離子交換劑，氧化鋁，硬脂酸鋁，卵磷脂，血清蛋白(例如人血清蛋白)，甘油，山梨酸，山梨酸鉀，飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，硫酸魚精蛋白，磷酸氫二鈉，磷酸氫鉀，氯化鈉，鋅鹽，膠態(tài)氧化硅，三硅酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，纖維素物質(zhì)，聚乙二醇，羧甲基纖維素鈉，聚丙烯酸酯，蜂蠟，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物和羊毛脂。

本發(fā)明中，所述藥物組合物可以制成藥學(xué)上可接受的任一劑型。例如，本發(fā)明的藥物組合物可以配制為片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑、注射劑(包括液體注射劑、注射用粉劑或注射用片劑)、栓劑、吸入劑或噴霧劑。

此外，本發(fā)明的所述藥物組合物還可以以任何合適的給藥方式，例如口服、胃腸外、直腸、經(jīng)肺或局部給藥等方式施用于受試者。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述藥物組合物適用于口服、胃腸外(靜脈內(nèi)、肌肉或皮下)、經(jīng)皮、經(jīng)舌或呼吸給藥。

當(dāng)用于口服給藥時，所述藥物組合物可制成口服制劑，例如口服固體制劑，如片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑等；或，口服液體制劑，如口服溶液劑、口服混懸劑、糖漿劑等。當(dāng)制成口服制劑時，所述藥物組合物還可包含適宜的填充劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑等。當(dāng)用于腸胃外給藥時，所述藥物組合物可制成注射劑，包括包括液體注射劑、注射用粉劑或注射用片劑。當(dāng)制成注射劑時，所述藥物組合物可采用現(xiàn)有制藥領(lǐng)域中的常規(guī)方法來進(jìn)行生產(chǎn)。當(dāng)配制注射劑時，所述藥物組合物中可以不加入附加劑，也可根據(jù)藥物的性質(zhì)加入適宜的附加劑。當(dāng)用于直腸給藥時，所述藥物組合物可制成栓劑等。用于經(jīng)肺給藥時，所述藥物組合物可制成吸入劑或噴霧劑等。

在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的納米粒以單位劑量的形式存在于藥物組合物中。

在某些優(yōu)選的實施方案中，給予受試者有效量的所述藥物組合物。如本文中所使用的，術(shù)語“有效量”是指足以獲得或至少部分獲得期望的效果的量。例如，預(yù)防疾病有效量是指，足以預(yù)防，阻止，或延遲疾病的發(fā)生的量；治療疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并發(fā)癥的量。測定這樣的有效量完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。例如，對于治療用途有效的量將取決于待治療的疾病的嚴(yán)重度、患者自己的免疫系統(tǒng)的總體狀態(tài)、患者的一般情況例如年齡，體重和性別，藥物的施用方式，以及同時施用的其他治療等等。

在一個方面，本申請?zhí)峁┝松鲜黾{米粒或藥物組合物在制備用于預(yù)防和/或治療受試者的神經(jīng)退行性疾病的藥物中的用途。

在一個方面，本申請?zhí)峁┝艘环N預(yù)防和/或治療受試者的神經(jīng)退行性疾病的方法，包括給受試者施用如上所述的納米粒。

在一個方面，本申請?zhí)峁┝巳缟纤龅募{米粒，所述納米粒用于預(yù)防和/或治療受試者的神經(jīng)退行性疾病。

在某些實施方案中，所述神經(jīng)退行性疾病選自阿爾茲海默病、帕金森氏癥、亨廷頓氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化和腦脊髓多發(fā)性硬化。

在某些實施方案中，所述受試者為哺乳動物，例如?？苿游?、馬科動物、羊科動物、豬科動物、犬科動物、貓科動物、嚙齒類動物、靈長類動物；例如，所述受試者為人。

本申請的納米粒，特別適合于遞送因水溶性強而難以透過血腦屏障的藥物，或血漿半衰期短而無法滿足長期持續(xù)釋放要求的藥物。因此，在另一個方面，本申請?zhí)峁┝松鲜黾{米粒的用途，所述納米粒用于提高活性成分透過受試者血腦屏障的能力，和/或延長活性成分在受試者體內(nèi)的釋放時間；所述活性成分是能夠預(yù)防和/或治療受試者的神經(jīng)退行性疾病的活性成分。

在某些實施方案中，所述活性成分選自膽堿能遞質(zhì)補充劑和膽堿酯酶抑制劑。

在某些實施方案中，所述膽堿能遞質(zhì)補充劑選自乙酰膽堿、乙酰膽堿的前體藥物或乙酰膽堿藥學(xué)上可接受的鹽(例如鹽酸鹽)。

在某些實施方案中，所述膽堿能遞質(zhì)補充劑為乙酰膽堿或氯化乙酰膽堿。

在某些實施方案中，所述膽堿酯酶抑制劑選自利斯的明、加蘭他敏或多奈哌齊，或這些化合物藥學(xué)上可接受的鹽(例如酒石酸鹽)。

在某些實施方案中，所述膽堿酯酶抑制劑為重酒石酸利斯的明。

在某些實施方案中，所述神經(jīng)退行性疾病選自阿爾茲海默病、帕金森氏癥、亨廷頓氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化和腦脊髓多發(fā)性硬化。

在某些實施方案中，所述受試者為哺乳動物，例如?？苿游铩ⅠR科動物、羊科動物、豬科動物、犬科動物、貓科動物、嚙齒類動物、靈長類動物；例如，所述受試者為人。

有益效果

本申請的納米粒具有以下有益效果中的一個或多個：

1.本申請的納米粒解決了水溶性強的藥物難以通過血腦屏障的問題，和/或血漿半衰期短的藥物無法實現(xiàn)長期緩慢釋藥的問題。

2.本申請的納米粒安全性高。本申請的納米粒所使用的納米載體為天然蛋白類材料，無免疫原性、生物相容性高，降解產(chǎn)物為多種人體必需氨基酸，無毒副作用。

3.本申請的納米粒的載藥方式優(yōu)化。文獻(xiàn)報道的載藥方式多以納米粒外層吸附藥物分子為主，載藥率低且易解吸；而本發(fā)明采用納米粒包裹藥物分子，藥物分子包裹纏繞于納米載體之中，隨著納米粒的逐步崩解，藥物分子緩慢釋放。

4.本申請的納米?？捎行Ц纳菩∈蟮目臻g學(xué)習(xí)及記憶能力，維持膽堿能系統(tǒng)相關(guān)酶的活性及乙酰膽堿含量的動態(tài)平衡，降低氧化應(yīng)激水平，尤其對額顳葉皮層具有明顯保護(hù)作用。

下面將結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，下列附圖和實施例僅用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的范圍的限定。根據(jù)附圖和優(yōu)選實施方案的下列詳細(xì)描述，本發(fā)明的各種目的和有利方面對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將變得顯然。

附圖說明

圖1示例性地顯示了本申請的納米粒的一種結(jié)構(gòu)。圖中所示的納米粒中，以具有Aβ靶向?qū)傩缘腍SA作為載體材料，包裹裝載了能夠治療AD的藥物，并且，在HSA納米粒的表面修飾有靶向分子，以提高HSA納米粒的BBB透過性，并延長體內(nèi)循環(huán)時間。

圖2示例性地顯示了制備本申請的納米粒的方法。圖中所述的方法包括：將活性成分(例如乙酰膽堿或利斯的明)與HSA進(jìn)行混合，在戊二醛的作用下，HSA發(fā)生交聯(lián)，形成HSA載藥納米粒；在HSA載藥的表面修飾靶向分子(例如吐溫-80)，得到修飾后的載藥納米粒。

圖3為實施例1中未修飾吐溫-80的裝載乙酰膽堿的HSA納米粒的掃描電鏡照片。如圖所示，未修飾的HSA載藥納米粒呈球形，直徑約為200nm。

圖4為實施例1中修飾了吐溫-80的裝載乙酰膽堿的HSA納米粒的掃描電鏡照片。如圖所示，修飾了吐溫-80的HSA載藥納米粒呈規(guī)則正方體，邊長為200nm左右。

圖5為實施例1中修飾了吐溫-80的裝載乙酰膽堿的HSA納米粒的掃描電鏡照片。如圖所示，修飾了吐溫-80的HSA載藥納米粒呈規(guī)則正方體，邊長為200nm左右。

圖6顯示了實施例3中，ACh水溶液、HSA水溶液、未裝載藥物且未修飾吐溫-80的空白HSA納米粒，以及未修飾吐溫-80的HSA-ACh納米粒的紫外吸收曲線。圖中，HSA溶液在280nm附近有明顯特征吸收峰(曲線1)，而Ach溶液在280nm附近沒有吸收(曲線2)。HSA形成納米粒后，280nm附近的吸收峰仍明顯可見(曲線3)；而裝載了Ach的HSA納米粒，280nm附近的吸收峰明顯降低(曲線4)。結(jié)果表明，藥物分子成功摻雜包裹在納米載體之中。

圖7顯示了實施例3中，未裝載藥物且未修飾吐溫-80的空白HSA納米粒，未修飾吐溫-80的HSA-Ach納米粒，吐溫-80修飾的未裝載的藥物HSA納米粒以及吐溫-80修飾的HSA-Ach納米粒的XRD譜圖。圖中，經(jīng)吐溫-80修飾后的HSA納米粒，在2θ＝31.6°可見明顯尖峰(曲線3和曲線4)，而未修飾的納米粒在此處無峰值(曲線1和曲線2)。結(jié)果證明，靶向分子吐溫-80已成功修飾于納米粒表面。

圖8為實施例4中，用紫外分光光度法測定的多柔比星的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖9為實施例4中，多柔比星樣品的體外累計釋放率曲線。如圖所示，多柔比星溶液組在10h左右達(dá)到累計釋放率最大值，回收率達(dá)90％以上，證明多柔比星已完全釋放；而多柔比星載藥納米粒組在80h內(nèi)的累計釋放率穩(wěn)定持續(xù)上升，且在中性生理鹽水溶液中的累計釋放率僅為載藥率的30％。由此推斷，載藥納米粒在體液運輸中可保持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，保證了進(jìn)入中樞的納米粒仍能維持較高的載藥率。

圖10為實施例5中水迷宮行為學(xué)評價訓(xùn)練期4天內(nèi)各組小鼠找到平臺時間的趨勢圖。訓(xùn)練期內(nèi)，各組小鼠在第1天時找到平臺時間沒有較大差異；而在第3天及第4天時，空白對照組找到平臺時間為20s，模型組、ACh溶液組及RT溶液組找到平臺時間明顯長于空白對照組，而HSA-ACh納米粒組及HSA-RT納米粒組找到平臺時間與空白對照組相比無明顯差異，且明顯低于模型組。實驗證明，在分別給予HSA-ACh納米粒及HSA-RT納米粒后，小鼠的短期空間學(xué)習(xí)能力得到改善。

圖11顯示了實施例5中水迷宮行為學(xué)評價測試期內(nèi)各組小鼠第一次找到平臺的潛伏期。如圖所示，空白對照組小鼠的潛伏期最短，方差分析結(jié)果顯示，模型組、ACh溶液組及RT溶液組潛伏期明顯長于空白對照組(P<0.05)，而HSA-ACh納米粒組及HSA-RT納米粒組與空白對照組無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。

圖12顯示了實施例5中水迷宮行為學(xué)評價測試期內(nèi)各組小鼠在60s內(nèi)穿越平臺的次數(shù)。如圖所示，空白對照組小鼠穿臺次數(shù)明顯多于模型組、ACh溶液組及RT溶液組(P<0.01)，而與HSA-ACh納米粒組及HSA-RT納米粒組無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。

圖13顯示了實施例5中水迷宮行為學(xué)評價測試期內(nèi)各組小鼠在目標(biāo)象限游泳的時間。如圖所示，模型組及ACh溶液組與空白對照組相比具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，而其他組與空白對照組無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。

圖14為實施例6中各組小鼠左半腦H.E.染色病理切片照片，圖A-L分別對應(yīng)空白對照組海馬(A)、皮層(B)，模型組海馬(C)、皮層(D)，ACh溶液組海馬(E)、皮層(F)，HSA-ACh納米粒組海馬(G)、皮層(H)，RT溶液組海馬(I)、皮層(J)，HSA-RT納米粒組海馬(K)、皮層(L)。

圖15為實施例7中的激光共聚焦顯微鏡照片。圖A-C分別對應(yīng)心臟注射生理鹽水組(對照組)、乙酰膽堿納米粒組和利斯的明納米粒組。從圖中可以明顯觀察到，正常斑馬魚體內(nèi)無熒光分布；對于乙酰膽堿納米粒組和利斯的明納米粒組，雖經(jīng)過心臟注射，但在斑馬魚的腦部出現(xiàn)了明顯的綠色熒光，因此證明藥物可順利通過血腦屏障進(jìn)入中樞。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1：裝載乙酰膽堿(Ach)的納米粒的制備

本實施例以人血清白蛋白(HSA)為納米載體材料，包裹裝載乙酰膽堿。所使用的活性成分為氯化乙酰膽堿，選用的良溶劑為10mmol/L的氯化鈉溶液，選用的不良溶劑為乙醇，選用的交聯(lián)劑為10％戊二醛，選用的靶向分子為吐溫-80，以人血清白蛋白(HSA)納米粒作為載體材料。制備過程如下。

步驟(1)：利用反溶劑法制備HSA載藥納米粒：將20mg HSA與10mg ACh溶解于1mL氯化鈉溶液(10mmol/L)中，以0.22μm水系濾膜過濾后，在600rpm轉(zhuǎn)速下，將此溶液以50μL/min滴速滴加于10mL乙醇中；滴加結(jié)束后，加大攪拌速度為800rpm，加入10％戊二醛20μL，避光反應(yīng)24h。反應(yīng)樣品以13600rpm速度離心10min，去除上清，收集沉淀，等量生理鹽水離心樣品3遍，收集沉淀，得到裝載乙酰膽堿(Ach)的HSA納米粒，4℃保存。

利用差量法測定產(chǎn)物質(zhì)量，計算納米藥物包封率及載藥率，方法如下：

將步驟(1)所制樣品中的溶劑旋干，固體粉末重新分散于8mL生理鹽水，以13600rmp速度離心10min，吸取1mL上清液于8mL生理鹽水中，搖勻，堿性羥胺比色法(或紫外分光光度法)測定上清未被包裹的藥量，通過總藥量與上清未被包裹的藥量的差值，計算納米藥物包封率及載藥率，公式如下：

包封率＝(m_總藥量-m_上清藥量)/m_總藥量×100％；

載藥率＝(m_總藥量-m_上清藥量)/m_{產(chǎn)物}×100％。

測量一定時間內(nèi)的上清未被包裹的藥量。經(jīng)過24小時，上清未被包裹的藥量達(dá)到穩(wěn)定。計算得到，裝載Ach的HSA納米粒的包封率為46.14±1.13％，載藥率為21.95±1.26％。

使用掃描電鏡對HSA載藥納米粒進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖3所示。未修飾的納米粒呈球形，直徑為200nm左右。

步驟(2)：HSA載藥納米粒的表面修飾：將步驟(1)中制備得到的納米粒分散于1mL生理鹽水中，加入0.1％的吐溫-80生理鹽水溶液1mL，800rpm轉(zhuǎn)速攪拌30min，超聲15min，最終得到修飾有吐溫-80并負(fù)載Ach的HSA納米粒(HSA-ACh NPs)。

使用掃描電鏡對修飾后的HSA載藥納米粒進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖4和圖5所示。修飾后的載藥納米粒呈規(guī)則正方體，邊長為200nm左右。

使用動態(tài)光散射粒徑儀(帶有zeta電位測試功能)對修飾有吐溫-80的HSA載藥納米粒進(jìn)行測定，平均粒徑約為198.5nm，粒徑均一穩(wěn)定，zeta電位約為-28.4mV。測試結(jié)果如表1所示。

表1

實施例2：裝載利斯的明(RT)的納米粒的制備

本實施例以人血清白蛋白(HSA)納米粒作為藥物載體，制備了裝載利斯的明(RT)的納米粒。所使用的活性成分為重酒石酸利斯的明，選用的良溶劑為10mmol/L的氯化鈉溶液，選用的不良溶劑為無水乙醇(純度大于99.7％)，選用的交聯(lián)劑為10％戊二醛，選用的靶向分子為吐溫-80。制備過程如下。

(1)利用反溶劑法制備HSA載藥納米粒：將20mg HSA與10mg RT溶解于1ml氯化鈉溶液(10mmol/L)中，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為8.3，以0.22μm水系濾膜過濾后，在600rpm轉(zhuǎn)速下，將溶液以50μL/min滴速滴加于10mL無水乙醇中；滴加結(jié)束后，加大攪拌速度為800rpm，加入10％戊二醛20μL，避光反應(yīng)24h。反應(yīng)樣品以13600rpm速度離心10min，去除上清，收集沉淀，等量生理鹽水離心樣品3遍，收集沉淀，得到球形HSA載藥納米粒，4℃保存。

(2)HSA載藥納米粒的表面修飾：將步驟(1)中制備得到的納米粒分散于1mL生理鹽水中，加入0.1％的吐溫-80的生理鹽水溶液1mL，800rpm轉(zhuǎn)速攪拌30min，超聲15min，最終得到修飾有吐溫-80的負(fù)載RT的HSA納米粒(HSA-RT NPs)，其為正方體。

使用動態(tài)光散射粒徑儀(帶有zeta電位測試功能)對修飾有吐溫-80的載藥HSA納米粒進(jìn)行測定，平均粒徑約為198.6nm，粒徑均一穩(wěn)定，zeta電位約為+17.4mV。測試結(jié)果如表1所示。

實施例3：納米粒的結(jié)構(gòu)表征

(1)紫外吸收光譜分析

分別對ACh水溶液、HSA水溶液、未裝載活性成分且未修飾吐溫-80的空白HSA納米粒(制備過程參考實施例1的步驟(1))，以及實施例1的步驟(1)制備的未修飾吐溫-80的HSA-ACh納米粒進(jìn)行紫外吸收光譜分析，樣品的紫外吸收曲線如圖6所示。HSA溶液在280nm附近有明顯特征吸收峰(曲線1)，而Ach溶液在280nm附近沒有吸收(曲線2)。HSA形成空白納米粒后，280nm附近的吸收峰仍明顯可見(曲線3)；而裝載了Ach的HSA納米粒，280nm附近的吸收峰明顯降低(曲線4)。所以，當(dāng)HSA納米粒中摻雜包裹了藥物分子(ACh)后，與藥物分子之間相互影響，HSA自身的紫外特征吸收峰會降低或消失。結(jié)果表明，藥物分子成功摻雜包裹在納米載體之中。

(2)XRD分析

對以下樣品進(jìn)行XRD測試：1.未裝載活性成分且未修飾吐溫-80的空白HSA納米粒(制備過程參考實施例1的步驟(1))，2.實施例1的步驟(1)制備的未修飾吐溫-80的HSA-Ach納米粒，3.吐溫-80修飾的未裝載活性成分的HSA納米粒(過程參考實施例1的步驟(1)和步驟(2))，4.實施例1制備的吐溫-80修飾的HSA-Ach納米粒。各樣品的XRD譜圖如圖7所示。

圖中，經(jīng)吐溫-80修飾后的HSA納米粒，在2θ＝31.6°可見明顯尖峰(曲線3和曲線4)，而未修飾的納米粒在此處無峰值(曲線1和曲線2)。結(jié)果證明，靶向分子吐溫-80已成功修飾于納米粒表面。

實施例4：裝載多柔比星的人血清白蛋白納米粒的制備及體外釋放效果評價

本實施例采用紫外光譜法來定量測定納米粒的釋放量。由于乙酰膽堿無紫外吸收峰，而利斯的明在263nm處有明顯紫外吸收峰(HSA自身的特征吸收峰在280nm附近，兩者相互重合)，故無法利用紫外光譜法進(jìn)行精確定量分析。因此，需要選用模擬替代藥物來表征納米粒的釋放效果。

本實施例選用的模擬替代藥物為多柔比星，一方面，是由于多柔比星具有和乙酰膽堿和利斯的明等藥物相似的溶解性(均為水溶性良好的小分子藥物)，另一方面，是由于多柔比星具有合適的紫外吸收峰。根據(jù)2010年版藥典二部附錄Ⅳ，多柔比星在233nm、252nm、288nm、480nm、495nm與530nm的波長處有較大吸收峰，其中480nm處吸收峰強度最大且雜質(zhì)干擾小。因此，本實施例以裝載多柔比星的人血清白蛋白納米粒作為體外釋藥模型，采用紫外分光光度法，以480nm處吸收值作為定量指標(biāo)，評價本申請的納米粒的體外釋藥效果。

以鹽酸多柔比星(Dox)代替目標(biāo)藥物進(jìn)行納米粒的制備，合成操作步驟與實施例1相同。

測試過程：首先，用梯度稀釋法制備一系列濃度梯度的多柔比星標(biāo)準(zhǔn)液，波長480nm下測定其紫外吸收值，制備多柔比星標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖8所示(y＝0.020x-0.000，R²＝0.998)。

設(shè)置多柔比星溶液組和裝載有多柔比星的載藥納米粒組。按照納米粒載藥率為10％計算，多柔比星溶液組濃度為0.5mg/mL(共4mL，相當(dāng)于多柔比星2mg)，載藥納米粒組濃度為5mg/mL(共4mL，相當(dāng)于多柔比星2mg)。兩組分別固定于分子量為3000的半透膜中，并分別置于900mL的生理鹽水釋放體系中，200rpm轉(zhuǎn)速下持續(xù)釋放。每隔一定時間分別取2mL釋放液，測定480nm處的紫外吸收值，并重新補充等量生理鹽水。

圖9顯示了釋放結(jié)果。多柔比星溶液組在10h左右達(dá)到累計釋放率最大值，回收率達(dá)90％以上，證明多柔比星已完全釋放；而多柔比星載藥納米粒組在80h內(nèi)的累計釋放率穩(wěn)定持續(xù)上升，且在中性生理鹽水溶液中的累計釋放率僅為載藥率的30％。由此推斷，載藥納米粒在體液運輸中可保持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，保證了進(jìn)入中樞的納米粒仍能維持較高的載藥率。

實施例5：納米粒對D-半乳糖致認(rèn)知障礙小鼠行為學(xué)評價

5.1實驗分組與飼養(yǎng)

昆明小鼠，♂，按體重隨機分為6組，每組各10只動物，包括空白對照組(不建模不給藥)、模型組(只建模不給藥)、ACh水溶液對照組(建模后給予乙酰膽堿水溶液)、HSA-ACh納米粒組(建模后給予吐溫-80修飾的裝載乙酰膽堿的人血清白蛋白納米粒)、RT溶液組對照組(建模后給予利斯的明水溶液)、HSA-RT納米粒組(建模后給予吐溫-80修飾的裝載利斯的明的人血清白蛋白納米粒)。

飼養(yǎng)環(huán)境為：溫度為(24±2)℃；濕度為(60±10)％；每日光照/黑暗各12h；自由攝食及飲水。

5.2動物建模及給藥治療

①動物建模：除空白對照組，其他5組每天皮下注射D-半乳糖溶液100mg/kg/d，灌胃注射氯化鋁溶液20mg/kg/d；正常對照組給予等量的水。建模周期為90天。

②給藥治療方案：建模60天后，ACh溶液組給予乙酰膽堿水溶液(1mg/kg)，HSA-ACh納米粒組給予吐溫-80修飾的裝載乙酰膽堿的納米粒(10mg/kg，裝載ACh的含量相當(dāng)于1mg/kg)，RT溶液組給予利斯的明水溶液(1.25mg/kg)，HSA-RT納米粒組給予吐溫-80修飾的裝載利斯的明納米粒(12.5mg/kg，裝載RT的含量相當(dāng)于1.25mg/kg)；給藥周期為每周2次，連續(xù)4周。

5.3Morris水迷宮行為學(xué)評價方法

①Morris水迷宮(MWM)試驗周期為5天，前4天為訓(xùn)練期，第5天為測試期；

②游泳池直徑為1m，分為4個象限，并在4個象限中分別固定4個入水點；游泳池水深約0.6m，水溫為22±2℃；

③訓(xùn)練期內(nèi)，將直徑為0.1m的黑色平臺放于第3象限，且低于水面約2cm；每只小鼠每天接受四次訓(xùn)練，具體過程如下：首先，將小鼠面朝池壁，放入第一象限固定入水點，自由游泳1min。若1min內(nèi)，小鼠找到平臺位置并停留至少3s，時間立即停止，記錄潛伏期、游泳速度等數(shù)據(jù)；若1min內(nèi)，小鼠未能找到平臺或找到平臺后未能停留3s，人工輔助小鼠找到平臺并停留15s，此時，記錄的潛伏期為60s。一次游泳后立即擦干小鼠，待所有小鼠游泳后，依次進(jìn)行2、3、4象限的訓(xùn)練。

④測試期內(nèi)，將平臺移去，固定入水點，小鼠自由游泳1min，記錄小鼠第一次找到平臺位置的潛伏期、穿臺次數(shù)及在目標(biāo)象限游泳時間等數(shù)據(jù)。

實驗結(jié)果：

各組小鼠找到平臺時間如圖10所示。訓(xùn)練期內(nèi)，各組小鼠在第1天時找到平臺時間沒有較大差異；而在第3天及第4天時，空白對照組找到平臺時間為20s，模型組、ACh溶液組及RT溶液組找到平臺時間明顯長于空白對照組，而HSA-ACh納米粒組及HSA-RT納米粒組找到平臺時間與空白對照組相比無明顯差異，且明顯低于模型組。實驗證明，在分別給予HSA-ACh納米粒及HSA-RT納米粒后，小鼠的短期空間學(xué)習(xí)能力得到改善。

測試期內(nèi)，小鼠找到原平臺位置的時間進(jìn)一步縮短，但各組之間已存在明顯統(tǒng)計學(xué)差異，如圖11所示，空白對照組小鼠的潛伏期最短，方差分析結(jié)果顯示，模型組、ACh溶液組及RT溶液組潛伏期明顯長于空白對照組(P<0.05)，而HSA-ACh納米粒組及HSA-RT納米粒組與空白對照組無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。

穿臺次數(shù)及目標(biāo)象限游泳時間是判斷小鼠長期空間記憶能力的另外兩個指標(biāo)。穿臺次數(shù)是實驗動物在60s內(nèi)穿越原平臺區(qū)域次數(shù)，動物穿臺次數(shù)越多，說明其空間學(xué)習(xí)記憶能力越好。如圖12所示，空白對照組小鼠穿臺次數(shù)明顯多于模型組、ACh溶液組及RT溶液組(P<0.01)，而與HSA-ACh納米粒組及HSA-RT納米粒組無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。

目標(biāo)象限游泳時間是實驗動物在原平臺及周邊區(qū)域活動的時間之和，時間越長，說明其空間學(xué)習(xí)記憶能力越好，如圖13所示，模型組及ACh溶液組與空白對照組相比具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，而其他組與空白對照組無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。

以上MWM實驗數(shù)據(jù)證明：模型組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯低于正常組小鼠，D-半乳糖致認(rèn)知障礙小鼠模型建模成功；給予乙酰膽堿水溶液或利斯的明水溶液后，認(rèn)知障礙沒有得到改善；而給予HSA-ACh納米?；騂SA-RT納米粒后，小鼠的短期學(xué)習(xí)能力及長期空間記憶能力均得到顯著改善，證明HSA-ACh納米粒及HSA-RT納米粒達(dá)到了緩解認(rèn)知障礙并長效釋放的目的。

實施例6：納米粒對D-半乳糖致認(rèn)知障礙小鼠腦生化指標(biāo)的影響

6.1樣品前處理

①準(zhǔn)確稱量實施例5的6組小鼠的體重并記錄；

②拔眼球取血，收集于5mL肝素鈉抗凝采血管中，置于冰浴中保存；

③斷頭取腦，去除腦干后，精確稱量腦重并記錄；在冰盒上切開左右半腦，左半腦浸泡于4％中性甲醛溶液中；右半腦以濾紙壓碎去除血液及微血管，加入20倍重量的膽堿酯酶提取液勻漿；膽堿酯酶提取液在4℃，5000rpm下離心10min，收集上清，置于4℃保存。

6.2腦乙酰膽堿酯酶(AChE)活力的測定

①準(zhǔn)確吸取10μL腦上清液稀釋于0.5mL PBS中，反復(fù)沖洗槍頭后渦旋混勻；

②加板，每個樣品設(shè)置4個復(fù)孔，每孔加入20μL樣品，前兩個復(fù)孔加入80μL PBS，后兩個復(fù)孔加入50μL PBS和30μL碘化硫代乙酰膽堿(ATCH)；

③離心1min除去氣泡，置于37℃恒溫水浴箱中孵育30min；

④取出后，每孔加入20μL 5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，震蕩30s，412nm下測量吸收值。

6.3腦乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)活力的測定

①ChAT的測定采用試劑盒進(jìn)行(南京建成，貨號：A079-1)，依次加入試劑1至試劑6，混勻，37℃水浴預(yù)溫5min；

②測定管內(nèi)加入25μl組織勻漿上清液，與之對應(yīng)的對照管加入等量煮沸的勻漿上清液，混勻，37℃水浴20min，100℃沸水水浴2min終止反應(yīng)；

③每管反應(yīng)體系中加入425μl蒸餾水，混勻，4000rpm離心10min后取上清500μL，加入10μL試劑7顯色劑，混勻后，靜置15min，在324nm處，1cm光徑，2mm內(nèi)徑的石英比色皿，蒸餾水調(diào)零，測定各管的吸光度值。

6.4乙酰膽堿(ACh)含量的測定

①ACh含量的測定采用堿性羥胺比色法，樣品首先加入膽堿酯酶抑制劑，阻止膽堿酯酶對乙酰膽堿的分解作用，之后立刻加入三氯乙酸沉淀蛋白；

②測定管及標(biāo)準(zhǔn)管中分別加入樣品上清及ACh標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入堿性羥胺溶液后37℃恒溫水浴30min，加入鹽酸終止反應(yīng)，最后加入三氯化鐵顯示；對照管及空白管中分別加入樣品上清及水，37℃恒溫水浴30min，加入鹽酸及三氯化鐵，最后加入堿性羥胺；

③加板，每孔加入200μL，在540nm處測定其吸光度值。

6.5丙二醛(MDA)含量的測定

①MDA的測定采用試劑盒進(jìn)行(南京建成，貨號A003-1)，測定管加入0.1mL勻漿上清液，空白管加入等量無水乙醇，標(biāo)準(zhǔn)管加入等量10nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品，依次加入0.1mL試劑1，3mL試劑2應(yīng)用液，1mL試劑3應(yīng)用液，渦旋混勻；

②試管口用保鮮膜扎緊，用針頭刺一小孔，95℃水浴40min，取出后流水冷卻，4000rpm離心10min，取上清532nm處，1cm光徑，雙蒸水調(diào)零，測定各管吸光度值。

6.6總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力的測定

①T-SOD的測定采用試劑盒進(jìn)行(南京建成，貨號A001-1)，依次加入試劑1至試劑4及樣品，渦旋混勻，置于37℃恒溫水浴40min；

②加入顯色劑，混勻，室溫放置10min，于波長550nm處，1cm光徑比色杯，雙蒸水調(diào)零，測定各管吸光度值。

6.7腦組織病理學(xué)檢測

4％中性甲醛液固定的左半腦經(jīng)過洗滌、脫水、浸蠟、包埋、切片與粘片、脫蠟、蘇木精-伊紅染色、脫水、透明、封片等步驟，最終獲得細(xì)胞核藍(lán)染、胞質(zhì)紅染的腦組織切片。

實驗結(jié)果：

膽堿能系統(tǒng)相關(guān)酶活及腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平是評價認(rèn)知能力的重要腦生化指標(biāo)。各指標(biāo)的測定結(jié)果如表2所示。

表2

^*p<0.05,^**p<0.01,^***p<0.001,與空白對照組比較。

^#p<0.05,^##p<0.01,^###p<0.001,與模型組比較；n＝8。

由表2可知，在正常腦組織中，ChAT、ACh及AChE的活力與含量維持在相對穩(wěn)定的水平；模型組中，ChAT活力顯著升高(p<0.05)，而HSA-ACh納米粒組、HSA-RT納米粒組及RT溶液組仍維持在正常值水平，證明本發(fā)明的納米粒有效維持了腦膽堿能系統(tǒng)中ChAT、ACh及AChE的活力與含量的相對平衡。從氧化應(yīng)激實驗結(jié)果可知，與空白對照組比較，模型組及ACh溶液組MDA的含量明顯升高(p<0.001)，而HSA-ACh納米粒組、HSA-RT納米粒組及RT溶液組仍維持在正常值水平，證明本發(fā)明的納米粒可有效降低腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平，保護(hù)神經(jīng)元。

圖14顯示了腦組織病理學(xué)檢測結(jié)果。正常海馬CA2區(qū)及額顳葉皮層神經(jīng)元細(xì)胞呈圓形或橢圓形，核漿比值大，細(xì)胞核核膜明顯，呈圓形或橢圓形，著色均勻為淺藍(lán)紫色(圖14A、圖14B)；而模型組及ACh溶液組小鼠海馬神經(jīng)元排列疏松，海馬及皮層區(qū)可見較多的神經(jīng)元胞體縮小，胞漿濃縮，核固縮，整個細(xì)胞深染成紫紅色(圖14C、圖14D、圖14E、圖14F)；在給予HSA-ACh納米粒、HSA-RT納米?；騌T溶液后，上述現(xiàn)象明顯改善，額顳葉皮層神經(jīng)元核固縮顯著減少(圖14G、圖14H、圖14I、圖14J、圖14K、圖14L)。實驗證明，本發(fā)明的納米粒對神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用顯著。

實施例7：納米粒的中樞靶向性及穿透血腦屏障研究

將異硫氰酸熒光素(FITC)修飾到人血清白蛋白上，按照實施例1和2的方法，制備吐溫-80修飾的負(fù)載乙酰膽堿的納米粒，以及吐溫-80修飾的負(fù)載利斯的明的納米粒，從而得到帶有FITC的納米粒。將各組帶有FITC的納米粒稀釋至0.1mg/mL后，取10nL心臟注射于斑馬魚體內(nèi)，選擇注射成功且存活的斑馬魚，固定于凝膠中，利用激光共聚焦顯微鏡觀察斑馬魚體內(nèi)熒光的分布。

圖15A-15C分別為心臟注射生理鹽水組(對照組)、乙酰膽堿納米粒組和利斯的明納米粒組的激光共聚焦顯微鏡照片。FITC是一種水溶性熒光染料，其通過化學(xué)鍵牢固的鍵合在了納米粒內(nèi)，因為是化學(xué)鍵結(jié)合，該熒光素不能自由的從納米粒上脫離為自由小分子進(jìn)入體系中，因此在顯微鏡下觀察到的熒光均來自納米粒，體系內(nèi)不存在游離的FITC小分子。從圖中可以明顯觀察到，正常斑馬魚體內(nèi)無熒光分布(圖15A)；對于乙酰膽堿納米粒組和利斯的明納米粒組，雖經(jīng)過心臟注射，但在斑馬魚的腦部出現(xiàn)了明顯的綠色熒光，因此證明藥物可順利通過血腦屏障進(jìn)入中樞。

以上實施例多角度全面評價了本申請的納米粒對小鼠認(rèn)知能力的改善效果，既在整體水平上觀測小鼠行為學(xué)的變化，又進(jìn)行了腦生化指標(biāo)的測定及病理學(xué)檢測。綜合以上實驗結(jié)果可以得出：本申請的納米?？梢詫⒃静荒苓M(jìn)入中樞的乙酰膽堿輸運至中樞后緩慢釋放，以實現(xiàn)長期低劑量補充外源性神經(jīng)遞質(zhì)的目的；將原本易迅速分解的利斯的明輸運至中樞后緩慢釋放，實現(xiàn)長效給藥的目的。

盡管本發(fā)明的具體實施方式已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解：根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和變動，并且這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。