本發(fā)明涉及藥物用途領(lǐng)域，具體地，涉及噻唑酰胺衍生物在制備抗骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

骨質(zhì)疏松癥(osteoprosis簡(jiǎn)稱op)是以骨量減少，骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致骨脆性增加和骨折危險(xiǎn)性增加為特征的一種系統(tǒng)性、全身性骨骼疾病。臨床表現(xiàn)和體征主要是疼痛，其次為身長(zhǎng)縮短、駝背、骨折及呼吸系統(tǒng)障礙。流行病學(xué)調(diào)研顯示，50歲以上的人群中，約有50％的女性和20％的男性有骨折的風(fēng)險(xiǎn)(rachner,khoslaetal.2011)。國(guó)家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)顯示：到2050年，我國(guó)50歲以上的人口將近全國(guó)人口的一半(49％)，約6.36億，預(yù)計(jì)到2050年我國(guó)骨質(zhì)疏松患者數(shù)目約為3億人。

破骨細(xì)胞(osteoclast)和成骨細(xì)胞(osteoblast)之間的比例失衡是骨質(zhì)疏松產(chǎn)生的病理基礎(chǔ)(rachner,khoslaetal.2011)。破骨細(xì)胞分化相對(duì)增多或成骨細(xì)胞分化相對(duì)減少，都會(huì)造成骨量流失，引起骨質(zhì)疏松。降低骨吸收、促進(jìn)骨合成是當(dāng)前臨床上治療骨質(zhì)疏松的主要治療手段。骨吸收抑制劑主要有雌激素受體調(diào)控劑如他莫昔芬，托瑞米芬，屈洛昔芬，雷洛昔芬，阿佐昔芬，巴多昔芬，依普黃酮等、雙磷酸酯/鹽類如乙醇酸膦酸鹽，氯膦酸鹽，帕米膦酸，鹵素磷酸鹽，磷酸艾倫，利塞膦酸鈉，磷酸唑來(lái)膦，伊班膦酸鈉等、以及降鈣素等。促進(jìn)骨合成藥物主要有wnt信號(hào)調(diào)控劑(amg785,bhq880)、甲狀旁腺激素parathyroidhormone(pth)、鈣敏感受體拮抗劑(如：atf936)，和他汀類藥物。還有既抑制骨吸收又促成骨的制劑，如阿法骨化醇，骨化三醇(alfacalcidol,calcitriol,ro-26-9228,ed-71)等。然而，上述藥物雖然能在一定程度上阻止骨密度下降，但不能顯著降低非典型性骨折的風(fēng)險(xiǎn)，而且存在著不同程度的副作用，尚未能滿足抗骨質(zhì)疏松治療的要求(siris,selbyetal.2009)。因此，目前迫切需要開(kāi)發(fā)一種新的抗骨質(zhì)疏松的特效藥，以解決當(dāng)前臨床用藥無(wú)法滿足治療需求的問(wèn)題。

破骨細(xì)胞是來(lái)源于骨髓巨噬細(xì)胞系的一種終末分化細(xì)胞，是目前所知唯一具有骨吸收作用的細(xì)胞。核受體活化因子配體(receptoractivatorofnuclearfactorkappabligand,rankl)是破骨細(xì)胞維持其結(jié)構(gòu)、功能和存活所必需的一種跨膜的可溶性蛋白。rank與其配體結(jié)合，激活下游nf-κb、akt，絲裂原激活蛋白激酶(mapk)，激活t細(xì)胞核受體(nfat)，鈣離子通道，和鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶信號(hào)通路，使得未分化的骨髓巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，進(jìn)而引起骨質(zhì)疏松(boyle,simonetetal.2003)。大量的研究證實(shí)，干擾rankl信號(hào)通路可抑制破骨細(xì)胞分化，產(chǎn)生抗骨質(zhì)疏松的藥理作用(kimandkim2016)。近年來(lái)，通過(guò)干擾rankl信號(hào)通路研發(fā)新型抗骨質(zhì)疏松藥物成為熱點(diǎn)。尋找具有抑制由rankl誘導(dǎo)產(chǎn)生的破骨細(xì)胞抑制活性的藥物，將有望解決當(dāng)前骨質(zhì)疏松治療藥物存在的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明基于新靶標(biāo)rankl信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)新的抗骨質(zhì)疏松藥物，以克服現(xiàn)有骨質(zhì)疏松治療藥物不能降低非典型性骨折的風(fēng)險(xiǎn)的問(wèn)題，提供一類噻唑酰胺衍生物在制備抗骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)上述目的：

本發(fā)明的設(shè)計(jì)思路是根據(jù)三維結(jié)構(gòu)相似度篩選的方法，以已知具有抗骨質(zhì)疏松或破骨細(xì)胞分化抑制劑為模板，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有化合物進(jìn)行篩選，獲得一系列化合物可能具有抗骨質(zhì)疏松作用的潛在活性化合物，然后在細(xì)胞水平對(duì)篩選獲得的化合物進(jìn)行破骨細(xì)胞分化抑制實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其中一類抑制活性高、細(xì)胞毒性低的噻唑酰胺衍生物可以有效抑制破骨細(xì)胞分化。所以，此類噻唑酰胺衍生物可安全用于制備治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松藥物。

本發(fā)明所選取的化合物均為現(xiàn)有的化合物。計(jì)算機(jī)篩選指的是運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)相關(guān)軟件，采用相似度檢索等技術(shù)手段對(duì)現(xiàn)有的化合物庫(kù)進(jìn)行篩選，篩選得到的化合物進(jìn)行生物活性測(cè)試。

噻唑酰胺衍生物在制備抗骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用，所述苯噻唑酰胺衍生物的結(jié)構(gòu)式如式(i)所示：

其中，r1為直鏈烷基或取代的直鏈烷基、環(huán)烷基、烯基或被取代的烯基、五元或六元雜環(huán)；r2為氫、烷基、不飽和烷基、苯基或取代苯基，r3為氫或烷基，n為0～4中任意一個(gè)整數(shù)。

優(yōu)選地，r1為c3～c10的環(huán)烷基、烯基或被取代的烯基、五元或六元雜環(huán)；r2為氫、c1～c6烷基、c1～c6不飽和烷基、苯基或取代苯基，r3為氫或c1～c6烷基。

術(shù)語(yǔ)“烷基”是用于表示飽和烷烴，c1～c6的烷基是指含有1～6個(gè)碳原子的飽和烴基?！安伙柡屯榛北硎臼怯糜诒硎咎肌鋬煞N原子的官能團(tuán)，可以看作是相應(yīng)的烷基失去1～4氫原子(h)后剩下的自由基。

優(yōu)選地，r1為2-乙硫基苯甲酸甲酯、乙烯苯并二茂、c3～c10的環(huán)烷基或取代的c3～c10的環(huán)烷基、六元含氧或含氮的雜環(huán)基或取代的六元含氧或含氮的雜環(huán)基，r2為氫、c1～c6烷基、苯基、被甲氧基、羥基、羧基、酯基取代的苯基，r3為氫或c1～c6烷基。

優(yōu)選地，r1為2-乙硫基苯甲酸甲酯、乙烯苯并二茂、環(huán)己烷甲酸、甲基呋喃，r2為氫、c1～c6烷基、苯基、甲基苯基或甲氧基苯基，r3為氫或c1～c6烷基。

優(yōu)選地，所述噻唑酰胺衍生物的結(jié)構(gòu)式為

最優(yōu)選地，所述噻唑酰胺衍生物的結(jié)構(gòu)式為

本發(fā)明所述藥物包括藥學(xué)上可接受的鹽、載體和/或賦形劑。

更近一步地，本發(fā)明所述苯內(nèi)酰烯酯酰胺類衍生物是作為破骨細(xì)胞分化抑制劑在制備抗骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明提供的噻唑酰胺衍生物均能一定程度上抑制破骨細(xì)胞分化，其中化合物1a活性最高，治療指數(shù)最高?；衔?c毒性最低。本發(fā)明提供的噻唑酰胺衍生物結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易合成；而且此類化合物毒性小，可安全用于制備治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松或骨量減少的藥物。

附圖說(shuō)明

圖1為1a細(xì)胞毒性和破骨細(xì)胞分化抑制曲線圖。

圖2為1b細(xì)胞毒性和破骨細(xì)胞分化抑制曲線圖。

圖3為1c細(xì)胞毒性和破骨細(xì)胞分化抑制曲線圖。

圖4為1d細(xì)胞毒性和破骨細(xì)胞分化抑制曲線圖。

圖5為1a～1d4個(gè)化合物的破骨細(xì)胞分化抑制曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。

實(shí)施例1：計(jì)算機(jī)藥物篩選

化合物庫(kù)預(yù)處理：化合物庫(kù)為自備化合物數(shù)據(jù)庫(kù)。化合物庫(kù)作如下處理：去除離子及絡(luò)合水分子、加電荷、質(zhì)子化、產(chǎn)生三維構(gòu)象。這些流程均在藥物設(shè)計(jì)軟件包discoverystudio2.5中完成。其中質(zhì)子化在ph6.5～8.5條件下進(jìn)行。準(zhǔn)備好的小分子庫(kù)用于虛擬篩選。

以已知抗骨質(zhì)疏松藥物和破骨細(xì)胞分化抑制劑進(jìn)行三維相似度檢索，找出相似度高于80％的化合物。本發(fā)明通過(guò)計(jì)算機(jī)藥物篩選程序?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)室自主研發(fā)程序wega，預(yù)測(cè)出本實(shí)驗(yàn)室化合物儲(chǔ)備庫(kù)擁有20個(gè)潛在活性的化合物。對(duì)該20個(gè)化合物進(jìn)行細(xì)胞水平的抑制骨質(zhì)疏松分化活性篩選，發(fā)現(xiàn)其中4個(gè)化合物(1a～1d)具有抑制破骨細(xì)胞分化的作用。這4個(gè)化合物均屬噻唑酰胺衍生物。

實(shí)施例2：化合物細(xì)胞的毒性測(cè)定

s1.細(xì)胞培養(yǎng)。

體外培養(yǎng)raw264.7細(xì)胞。使用含有10％胎牛血清，dmem高糖培養(yǎng)基，在37℃，5％二氧化碳濃度條件下進(jìn)行常規(guī)維持培養(yǎng)和傳代。

s2.化合物干預(yù)。

收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，將細(xì)胞懸液濃度配成1×10⁵個(gè)/ml，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液換成含有不同化合物濃度的培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)2天，于第3天檢測(cè)細(xì)胞毒性。使用dmso將待測(cè)化合物配置為不同濃度的溶液。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，并設(shè)不經(jīng)化合物處理的對(duì)照組進(jìn)行比較。

s3.測(cè)試方法。

采用mtt[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽]法測(cè)定經(jīng)化合物處理6天之后的細(xì)胞。應(yīng)用酶標(biāo)儀(檢測(cè)波長(zhǎng)570nm，參考波長(zhǎng)630nm)測(cè)定個(gè)孔吸光值(od值)。

s4.結(jié)果處理。

按下面的公式計(jì)算各個(gè)藥物對(duì)raw264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率：

以raw264.7細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為縱坐標(biāo)，化合物濃度得log值為橫坐標(biāo)繪制各化合物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制曲線圖，根據(jù)各化合物對(duì)細(xì)胞抑制率，求出半數(shù)毒性濃度cc50，即抑制細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)50％時(shí)藥物濃度。

另按照公式：選擇抑制常數(shù)(si)＝cc50/ic50計(jì)算各化合物的選擇抑制常數(shù)，以評(píng)價(jià)各化合物的用藥安全性。1a、1b、1c和1d四個(gè)化合物的選擇抑制常數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。1a、1b、1c和1d四個(gè)化合物對(duì)raw264.7細(xì)胞的毒性測(cè)定結(jié)果分別見(jiàn)圖1～圖4。

實(shí)施例3：破骨細(xì)胞分化抑制實(shí)驗(yàn)

s1.細(xì)胞培養(yǎng)。

體外培養(yǎng)raw264.7細(xì)胞。使用含有10％胎牛血清，dmem高糖培養(yǎng)基，在37℃，5％二氧化碳濃度條件下進(jìn)行常規(guī)維持培養(yǎng)和傳代。

s2.化合物干預(yù)。

收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，將細(xì)胞懸液濃度配成2×10⁴個(gè)/ml，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液換成含有100ng/mlrankl及不同化合物濃度的培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)5天，每2天換上相同rankl濃度和化合物濃度的培養(yǎng)基，于第5天檢測(cè)采用trap染色法對(duì)破骨細(xì)胞進(jìn)行染色。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，并設(shè)不經(jīng)化合物處理的對(duì)照組進(jìn)行比較。

s3.測(cè)試方法。

采用trap試劑盒對(duì)分化形成的破骨細(xì)胞進(jìn)行染色，計(jì)數(shù)≧3個(gè)細(xì)胞核融合的破骨細(xì)胞數(shù)目。

s4.結(jié)果處理。

按下面的公式計(jì)算各藥物對(duì)rankl誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化抑制率：

以破骨細(xì)胞分化抑制率為縱坐標(biāo)，化合物濃度的log值為橫坐標(biāo)繪制各化合物對(duì)破骨細(xì)胞分化抑制曲線圖，根據(jù)各化合物對(duì)破骨細(xì)胞分化的抑制率，求出半數(shù)有效率ic50，即抑制破骨細(xì)胞分化達(dá)50％時(shí)藥物濃度。

另按照公式：選擇抑制常數(shù)(si)＝cc50/ic50計(jì)算各化合物的選擇抑制常數(shù)，以評(píng)價(jià)各化合物的用藥安全性。1a、1b、1c和1d四個(gè)化合物的選擇抑制常數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。1a、1b、1c和1d四個(gè)化合物對(duì)宿主細(xì)胞的毒性測(cè)定結(jié)果分別見(jiàn)圖1～圖4。

根據(jù)選擇性指數(shù)si＝cc50/ic50值，按以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)化合物的抗骨質(zhì)疏松分化的效果。si<1.0表明化合物有毒無(wú)效，1.0≤si≤2.0表明化合物低效有毒即弱陽(yáng)性，2.0<si<10.0表明化合物有效低毒即陽(yáng)性，si≥10.0表明化合物高效低毒即強(qiáng)陽(yáng)性。

由表1和圖1～4的結(jié)果可見(jiàn)，本發(fā)明通過(guò)破骨細(xì)胞分化抑制實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)4個(gè)化合物對(duì)破骨細(xì)胞分化均有不同程度的抑制作用，其中1a活性最好，治療指數(shù)最高，ic50為3.98，si為42.59(見(jiàn)圖1、表1)；其次為1b，ic50為4.03，si為34.96(見(jiàn)圖2、表1)；活性次之的是1d，ic50為8.12，si為18.57(見(jiàn)圖4、表1)；與其它三個(gè)化合物相比，1c活性較差，ic50為12.99，si為28.93(見(jiàn)圖3、表1)。其中，圖5為綜合化合物1a、1b、1c和1d共4個(gè)化合物的破骨細(xì)胞分化抑制曲線圖。

表1藥物篩選獲得的化合物結(jié)構(gòu)及其對(duì)破骨細(xì)胞分化的抑制作用

本發(fā)明通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)相似度檢索的方法發(fā)現(xiàn)一類噻唑酰胺衍生物。并通過(guò)破骨細(xì)胞分化抑制實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞毒性(mtt)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)此類化合物中，1a、1b、1d對(duì)破骨細(xì)胞分化抑制活性均小于10μm，細(xì)胞毒性小，治療指數(shù)高。1a對(duì)破骨細(xì)胞分化半數(shù)抑制劑量(ic50)為3.98μm，細(xì)胞半致死劑量(cc50)為168.50μm，選擇抑制常數(shù)(si)為42.59(表1，圖1)；1b對(duì)破骨細(xì)胞分化半數(shù)抑制劑量(ic50)為4.03μm，細(xì)胞半致死劑量(cc50)為140.90μm，選擇抑制常數(shù)(si)為43.95(表1，圖2)；1c對(duì)破骨細(xì)胞分化半數(shù)抑制劑量(ic50)為12.99μm，細(xì)胞半致死劑量(cc50)為375.8μm，選擇抑制常數(shù)(si)為28.93(表1，圖3)；1d1c對(duì)破骨細(xì)胞分化半數(shù)抑制劑量(ic50)為8.12μm，選擇抑制常數(shù)(si)為18.57(表1，圖4)。結(jié)果表明，此類化合物對(duì)破骨細(xì)胞分化的抑制活性高、細(xì)胞毒性小，可作為一類破骨細(xì)胞抑制劑用于制備骨質(zhì)疏松或骨質(zhì)減少防治藥物。