本發(fā)明屬于藥物新的藥理作用和疾病防治領(lǐng)域。具體涉及丹皮酚(Paeonol)抑制T-LAK細(xì)胞起源的蛋白激酶(TOPK)的生物活性，以及丹皮酚通過調(diào)節(jié)TOPK活性異常增高預(yù)防和/或治療炎癥和腫瘤的應(yīng)用，包括紫外線(UV)誘發(fā)的光線性皮膚病，如日曬傷和慢性光化性皮膚病。

背景技術(shù)：

臨床流行病學(xué)調(diào)查顯示，人體長期暴露在太陽光紫外線(SUV)下可產(chǎn)生皮膚炎癥和皮膚腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。太陽光中的紫外線輻射根據(jù)波長的大小可以分為三類，波長為315～400nm的長波紫外線(UVA)，波長為280～315nm的中波紫外線(UVB)，和波長為200～280nm的短波紫外線(UVC)。但是經(jīng)過臭氧層時，幾乎全部的UVC，多達(dá)90％的UVB和10％的UVA都被吸收(Bode AM，and Dong Z.Mitogen-activated protein kinase activation in UV-induced signal transduction.2003；Sci.STKE：RE2.doi：10.1126/stke.2003.167.re2)。長時間的UVA暴露，會產(chǎn)生過氧化物，造成DNA的損傷，UVB則可引起皮膚細(xì)胞DNA光加合物丁烷嘧啶二聚體的形成，影響皮膚細(xì)胞損傷后的修復(fù)，引起DNA的突變，導(dǎo)致皮膚癌的發(fā)生(Kielbassa C，Roza L，and Epe B.Wavelength dependence of oxidative DNA damage induced by UV and visible light.Carcinogenesis.1997；18：811-816.doi：10.1093/carcin/18.4.811)。因此，UVA和UVB被認(rèn)為是引起皮膚光損傷以及皮膚癌的主要因素。到達(dá)地球表面的紫外線主要是UVA(占到達(dá)地表SUV總量的95％)和少量的UVB(占到達(dá)地表SUV總量的5％)。雖然，人們對于UVA及UVB作用機(jī)理做了大量研究，但是，人們對紫外線誘導(dǎo)的病理變化理解還不夠充分。紫外線輻射可導(dǎo)致氧化應(yīng)激，引起一系列的皮膚炎癥，諸如光線性皮膚病、銀屑病，甚至是皮膚癌(Svobodova A，Walterova D，and Vostalova J.Ultraviolet light induced alteration to the skin.Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub.2006；150：25-38)。因此，如若可以抑制引起光損傷的炎癥信號通路，就可以有效的防治紫外線輻射導(dǎo)致的皮膚光損傷。p38、JNK通路是細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯的主要通路(Kaminska B.MAPK signaling pathways as molecular targets for anti-inflammatory therapy--from molecular mechanisms to therapeutic benefits.Biochim.Biophys.Acta.2005；1754：253-262.doi：10.1016/j.bbapap.2005.08.017；Schindler JF，Monahan JB，Smith WG.p38pathway kinases as anti-inflammatory drug targets.J Dent Res.2007；86：800-811.doi：10.1177/154405910708600902；Huang P，Han J，Hui L.MAPK signaling in inflammation-associated cancer development.Protein Cell.2010；1：218-226.doi：10.1007/s13238-010-0019-9)，紫外線輻照可激活此通路，導(dǎo)致皮膚炎癥的發(fā)生(Hwang BM，Noh EM，Kim JS，Kim JM，You YO，Hwang JK，Kwon KB，Lee YR.Curcumin inhibits UVB-induced matrix metalloproteinase-1/3 expression by suppressing the MAPK-p38/JNK pathways in human dermal fibroblasts.Exp Dermatol.2013；22：371-374.doi：10.1111/exd.12137)。

TOPK，又名PBK，即PDZ連接激酶及淋巴因子激活的殺傷性T淋巴細(xì)胞源性蛋白激酶，是一種絲-蘇氨酸激酶(Abe Y，Matsumoto S，Kito K，et al.Cloning and expression of a novel MAPKK-like protein kinase，lymphokine-activated killer T-cell-originated protein kinase，specificallyexpressed in the testis and activated lymphoid cells.J Biol Chem 2000；275：21525-21531；Gaudet S，Branton D，Lue RA.Characterization of PDZ-binding kinase，a mitotickinase.Proc NatlAcad Sci 2000；97：5167-5172)，屬于MAPKK(Mitogen-ativated protein kinase kinase)分子家族的新成員。它是p38和JNKs的上游激酶(Abe Y，Matsumoto S，Kito K，Ueda N.Cloning and expression of a novel MAPKK-like protein kinase，lymphokine-activated killer T-cell-originated protein kinase，specifically expressed in the testis and activated lymphoid cells.J Biol Chem.2000；275：21525-21531.doi：10.1074/jbc.M909629199；Oh SM，Zhu F，Cho YY，Lee KW，Kang BS，Kim HG，Zykova T，Bode AM，Dong Z.T-lymphokine-activated killer cell-originated protein kinase functions as a positive regulator of c-Jun-NH2-kinase 1 signaling and H-Ras-induced cell transformation.Cancer Res.2007；67：5186-5194.doi：10.1158/0008-5472)。TOPK可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，導(dǎo)致DNA的損傷，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移以及機(jī)體炎癥的發(fā)生(Gaudet S，Branton D，and Lue RA.Characterization of PDZ-binding kinase，a mitotic kinase.Proc Natl Acad Sci USA.2000；97：5167-5172.doi：10.1073/pnas.090102397)。有研究表明，TOPK可參與紫外線誘導(dǎo)的DNA損傷，激活P38，磷酸化JNK(Liu K，Yu D，Cho YY，Bode AM，Ma W，Yao K，Li S，Li J，Bowden GT，Dong Z，Dong Z.Sunlight UV-induced skin cancer relies upon activation of the p38αsignaling pathway.Cancer Res.2013；73：2181-2188.doi：10.1158/0008-5472)。TOPK可以磷酸化Ser139位點的H2AX，而磷酸化的H2AX則是檢測DNA損傷的生物標(biāo)志(Zykova TA，Zhu F，Lu C，Higgins L，Tatsumi Y，Abe Y，Bode AM，Dong Z.Lymphokine-activated killer T-cell-originated protein kinase phosphorylation of histone H2AX prevents arsenite-induced apoptosis in RPMI7951 melanoma cells.Clin Cancer Res.2006；12：6884-6893.doi：10.1158/1078-0432；Kuo LJ，Yang LX.Gamma-H2AX-a novel biomarker for DNA double-strand breaks.In Vivo.2008；22：305-309)。因此，通過找到一種藥物阻斷TOPK途徑，可以為防治紫外線引起的DNA損傷及皮膚炎癥和腫瘤的防治提供了新的可能。

目前，人們只發(fā)現(xiàn)了兩種TOPK抑制劑，HI032和OTS514(Kim DJ，Li Y，Reddy K，Lee MH，Kim MO，Cho YY，Lee SY，Kim JE，Bode A，Dong Z.Novel TOPK inhibitor HI-TOPK-032 effectively suppresses colon cancer growth.Cancer Res.2012；15：3060-3068.doi：10.1158/0008-5472；Matsuo Y，Park JH，Miyamoto T，Yamamoto S，Hisad S，Alachkar H，Nakamura Y.TOPK inhibitor induces complete tumor regression in xenograft models of human cancer through inhibition of cytokinesis.Sci.Transl.Med.2014；6：259ra145.doi：10.1126/scitranslmed.3010277)。但是這些藥物副作用明顯，不能被有效的臨床應(yīng)用。在本發(fā)明中，我們應(yīng)用基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選來篩選FDA批準(zhǔn)的藥物。頭孢拉定作為被FDA批準(zhǔn)第一代廣譜抗生素，可以用來阻斷TOPK通路，抑制UV誘導(dǎo)的皮膚光損傷反應(yīng)。

丹皮酚(Paeonol)，亦稱芍藥醇，是從傳統(tǒng)中草藥中分離的藥物活性成分，如牡丹皮(Lau，C.H.，Chan，C.M.，Chan，Y.W.，Lau，T.W.，Lam，F(xiàn).C.，Lau，C.B.S.，2007.Pharmacological investigatiohs of the anti-diabetic effect of Cortex Moutan and its active component paeonol.Phytomedicine 14，778-784)，白芍藥(Nizamutdinova，I.，Oh，H.M.，Min，Y.N.，Park，S.H.，Lee，M.J.，Chang，K.C.，Kim，H.J.，2007.Paeonol suppresses intercellular adhesion molecule-1 expression in tumor necrosis factor-a-stimulated human umbilical vein endothelial cells by blocking p38，ERK and nuclear factor-κB signaling pathways.International Immunopharmacology 7，343-350)和薯蕷根(Miyazawa，M.，Shimamura，H.，Nakamura，S.，Kameoka，H.，1996.Antimutagenic activity of b-Eudesmol and paeonol from Dioscorea japonica.Journal of Agricultural and Food Chemistry 44，1647-1650)，已在中國傳統(tǒng)醫(yī)藥領(lǐng)域使用數(shù)千年。丹皮酚具有廣泛的生物學(xué)作用，而且MTS試驗表明其不具有細(xì)胞毒性，包括抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化作用(Sun，G.P.，Wang，H.，Xu，S.P.，Shen，Y.X.，Wu，Q.，Chen，Z.D.，et al.(2008).Anti-tumor effects of paeonol in a HepA-hepatoma bearing mouse model via induction of tumor cell apoptosis and stimulation of IL-2 and TNFalpha production.Eur.J.Pharmacol.584，246-252.doi：10.1016/j.ejphar.2008.02.016；Jin，X.，Wang，J.，Xia，Z.-M.，Shang，C.-H.，Chao，Q.-L.，Liu，Y.-R.，et al.(2016).Anti-inflammatory and Anti-oxidative activities of paeonol and its metabolites through blocking MAPK/ERK/p38 signaling Pathway.Inflammation 39，434-446.doi：10.1007/s10753-015-0265-3)。丹皮酚是治療各種疾病包括阿爾茨海默病(Zhou A，Wu H，Pan J，Wang X，Li J，Wu Z，Hui A.Synthesis and evaluation of paeonol derivatiyes as potential multifunctional agents for the treatment of Alzheimer’s disease.Molecules.2015 Jan14；20(1)：1304-18.doi：10.3390/molecules 20011304)、動脈粥樣硬化的傳統(tǒng)藥物和食品添加劑(Zhou J，Zhou L，Hou D，Tang J，Sun J，Bondy SC.Paeonol increases levels of cortical cytochrome oxidase and vascular actin and improves behavior in a rat model of Alzheimer’s？disease.Brain Res.2011May 4；1388：141-7.doi：10.1016/j.brainres.2011.02.064.Epub 2011 Mar 4；Li，H.，Dai，M.，Jia，W.，2009.Paeonol attenuates high-fat-diet-induced atherosclerosis in rabbits by anti-inflammatory activity.Planta Medica 75，7-11)。最近報道，丹皮酚抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子和抑制小鼠模型氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性(N.Chen，D.Liu，L.W.Soromouetal.Paeonol suppresses lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokines in macrophage cells and protects mice from lethal endotoxin shock.Fundamental&Clinical Pharmacology，vol.28，no.3，pp.268-276，2014.；Q.Du，G.Feng，L.Shen，J.Cui，andJ.Cai.Paeonol attenuates airway inflammation and hyper-responsiveness in a murine model of ovalbumin-induced asthma.Canadian Journal of Physiology and Pharmacology，vol.88，no.10，pp.1010-1016，2010)。我們據(jù)此推測，丹皮酚是一種可用于治療太陽紫外線引起的皮膚炎癥的一種潛在藥物。在這項發(fā)明中，我們發(fā)現(xiàn)，丹皮酚能夠通過結(jié)合并調(diào)節(jié)TOPK活性，抑制紫外線誘發(fā)的皮膚炎癥的動物及細(xì)胞模型，因此丹皮酚是紫外線誘發(fā)的皮膚炎癥的有效預(yù)防和治療藥物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是：

1.發(fā)現(xiàn)丹皮酚可直接與TOPK相結(jié)合。

2.發(fā)現(xiàn)丹皮酚抑制TOPK活性，降低TOPK及下游信號傳導(dǎo)通路中p38、JNK和HA2X的磷酸化水平及炎癥因子IL-6和TNF-α的分泌。

3.發(fā)現(xiàn)UV導(dǎo)致的光線性皮膚病中TOPK及下游激酶及炎癥因子表達(dá)增高。

4.確定丹皮酚通過作用于TOPK，預(yù)防和/或治療UV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，同時認(rèn)為丹皮酚是一種可用來治療由SUV誘導(dǎo)的炎癥性皮膚病的新型藥物。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的

1.丹皮酚結(jié)合TOPK并抑制其活性。

丹皮酚被鑒定為一個已知的1-(2-羥基-4-甲氧苯基)乙酮。用MTS法測定丹皮酚的毒性，HaCat和c141 JB6細(xì)胞分別用不同濃度的丹皮酚(0，50，100，200，400μm)進(jìn)行處理及不同時間(24，48，72h)。結(jié)果表明，丹皮酚對JB6 c141和HaCat細(xì)胞均沒有明顯的細(xì)胞毒性。

通過微量熱泳動實驗(Microscale thermophoresis，MST)，可以高靈敏量化蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用或小分子蛋白質(zhì)的相互作用。用MST實驗測試丹皮酚和TOPK之間的親和力。在本發(fā)明觀察中，丹皮酚具有相當(dāng)?shù)偷钠胶饨怆x常數(shù)(Kd)7670+/-690nm，表明與TOPK有很強(qiáng)的親和力。體外蛋白激酶測定表明，隨著丹皮酚的濃度從12.5um增加到50um，被活性TOPK催化的γ-H2AX水平逐漸降低。這些數(shù)據(jù)表明，丹皮酚能與TOPK結(jié)合并抑制其活性，而且無明顯的細(xì)胞毒性。

2.丹皮酚抑制SUV誘導(dǎo)的p38和JNK的激活過程。

JB6細(xì)胞在使用20kJ/m²的SUV照射下對丹皮酚預(yù)處理12小時，厚度從25um到100um，同時檢測p38磷酸化或JNKs水平。結(jié)果表明，水平逐漸降低。其次，在20kJ/m²的SUV照射下經(jīng)100um丹皮酚培養(yǎng)的JB6細(xì)胞隨培養(yǎng)時間從3小時增加到12小時，p38磷酸化或JNKs的水平也逐漸下降。HaCaT細(xì)胞中得到了相似的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)表明，丹皮酚能抑制SUV體外誘導(dǎo)的JNK或p38的激活。丹皮酚成時間和劑量依耐性下調(diào)SUV誘導(dǎo)的下游的TOPK信號通路，同時抑制JB6 c141和HaCaT細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的分泌。

3.丹皮酚降低TOPK相關(guān)的DNA損傷的標(biāo)志物組蛋白H2AX

TOPK是p38的上游蛋白激酶。在本發(fā)明觀察中，JB6細(xì)胞在使用20kJ/m²的SUV照射下對丹皮酚預(yù)處理12小時，厚度從25um到100um，MSKl的磷酸化水平、H2AX或TOPK逐漸減少。其次，在20kJ/m²的SUV照射下經(jīng)100um丹皮酚培養(yǎng)的JB6細(xì)胞隨培養(yǎng)時間從3小時增加到12小時，p38磷酸化或TOPK的水平也逐漸下降。類似的結(jié)果在HaCat的細(xì)胞中也可觀察到。

4.丹皮酚降低炎癥因子TNF-α和IL-6分泌

在本發(fā)明觀察中，在JB6或HaCat細(xì)胞內(nèi)，被20kJ/M²的SUV照射刺激TNF-α或IL-6的分泌過程被100um的丹皮酚抑制。表明丹皮酚能抑制SUV誘導(dǎo)的DNA損傷，通過抑制TOPK活性，同時丹皮酚抑制了體內(nèi)細(xì)胞因子的分泌。

5.丹皮酚抑制SUV誘導(dǎo)的動物皮膚炎癥反應(yīng)

在小鼠皮膚組織采用HE染色觀察中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)100KJ/m²的SUV照射后，表皮角化過度后，炎性細(xì)胞浸潤，多灶性間質(zhì)水腫。這些都是皮膚炎癥的跡象。其次，與對照組相比，小鼠組織經(jīng)照射后，TOPK，p38磷酸化水平、JNK、γH2AX均增加。第三，小鼠皮膚組織經(jīng)照射后，分泌的細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的濃度均增加，而且在小鼠皮膚照射前涂抹丹皮酚(60mg/kg)可有效抑制這一炎癥反應(yīng)。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

1.本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)丹皮酚可直接與TOPK相結(jié)合。

2.首次發(fā)現(xiàn)丹皮酚抑制TOPK活性，降低TOPK及下游信號傳導(dǎo)通路中p38、JNK和HA2X的磷酸化水平及炎癥因子IL-6和TNF-α的分泌。

3.首次確定丹皮酚預(yù)防和/或治療UV誘發(fā)TOPK活性異常增高導(dǎo)致的光線性皮膚病。

4.根據(jù)以上發(fā)明優(yōu)點推測，丹皮酚可以預(yù)防和/或治療UV誘發(fā)TOPK活性異常增高導(dǎo)致的其他炎癥(銀屑病、紅斑狼瘡等)和腫瘤(皮膚鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌等)。

附圖說明

圖1：在人類日光性中TOPK水平，p38磷酸化水平和JNKs水平均增加。A.日光性皮炎與正常皮膚組織HE染色下病理改變的對比B.C.D.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測人類日光性皮炎和正常皮膚組織中TOPK，磷酸化p38磷酸化JNK水平。

圖2：在JB6 c141和HaCat細(xì)胞中SUV照射誘導(dǎo)p38和JNK的磷酸化水平與照射劑量和時間的相關(guān)性。A.在JB6 c141細(xì)胞中SUV激活p38磷酸化或JNKs水平與SUV照射劑量的相關(guān)性。B.在在JB6 c141細(xì)胞中SUV激活p38磷酸化或JNKs水平與SUV照射時間的相關(guān)性。C.D.與用處理JB6 c141細(xì)胞方式處理HaCat細(xì)胞。細(xì)胞裂解液(25μG)選擇10％SDS-PAGE。用蛋白印跡法檢測蛋白條帶。數(shù)據(jù)顯示的是至少三次具有代表性實驗的研究成果。

圖3：丹皮酚結(jié)合并抑制TOPK活性。A丹皮酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)。B.丹皮酚對HaCat細(xì)胞JB6c141細(xì)胞無細(xì)胞毒性。用濃度50、100、200和400um丹皮酚處理HaCaT細(xì)胞和JB6細(xì)胞24h，48h和72h。細(xì)胞活力測定采用MTS法，步驟依據(jù)說明書進(jìn)行。定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)來自三個獨立實驗。C.丹皮酚和TOPK間的親和力均采用MST法檢測。用KD值7670+/-690nm顯示約束力曲線。D.在體外，丹皮酚以劑量依賴的方式抑制TOPK活性。Gst-h2ax蛋白，活性TOPK，及ATP被用于進(jìn)行體外激酶的測定。

圖4：丹皮酚抑制SUV誘導(dǎo)的p38和JNK的活化。A和B.經(jīng)丹皮酚預(yù)處理后的JB6c141細(xì)胞中依賴SUV照射劑量和時間誘導(dǎo)的p38磷酸化明顯減少C和D.對HaCat細(xì)胞采用了相同的方法進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)顯示的是至少三次具有代表性實驗的研究成果。

圖5：在JB6 c141和HaCaT細(xì)胞中，丹皮酚呈劑量和時間依賴性的抑制SUV誘導(dǎo)的TOPK下游信號通路，同時抑制一系列炎性細(xì)胞因子的分泌。A和B在JB6 c141細(xì)胞中SUV照射引起的Mskl磷酸化，H2AX，TOPK水平明顯與丹皮酚預(yù)處理呈劑量和時間依賴的方式減少。細(xì)胞預(yù)先用丹皮酚處理，然后用SUV進(jìn)行照射。C和D.HaCat細(xì)胞中用與JB6細(xì)胞相同的方式進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)顯示的是至少三次具有代表性實驗的研究成果。E.丹皮酚抑制SUV誘導(dǎo)的一系列炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的分泌。(###)表示與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，星號(***)表示與單用SUV處理組相比有顯著差異(P＜0.05)相比，

圖6：在體外丹皮酚抑制SUV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。A.在老鼠皮膚中丹皮酚可抑制SUV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，p38的磷酸化水平和JNKs，TOPK水平，以及γ-H2AX水平。B.丹皮酚治療后小鼠皮膚中炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的分泌明顯降低。定量數(shù)據(jù)都用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。(###)表示與對照組比較有顯著性差異(P＜0.001)。*表示與SUV刺激組比較有顯著性差異(***P＜0.01，**P＜0.05).

具體實施方式

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地說明。需要說明的是，本發(fā)明的實施例僅限于對本發(fā)明進(jìn)行說明，而沒有限制作用。實施例中所涉及的有關(guān)試驗方法和其它各種實驗操作，均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，文中沒有特別說明的部分，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以參照本發(fā)明申請日之前的各種常用工具書、科技文獻(xiàn)或相關(guān)的說明書、手冊等予以實施。

實施例一 本發(fā)明實施中包含的材料與方法

1、SUV設(shè)備、試劑和抗體

日光紫外線的設(shè)備購自Q-Lab公司(Cleveland，OH)。用紫外輻射計測量UVA和UVB的百分比，分別為92.5％和7.5％。丹皮酚(Paeonol)(純度＞99％)是購自成都瑞豐四生物科技有限公司(成都，中國)。PGEX-GST H2AX人類質(zhì)體購自addgene公司，活性TOPK購自Millippore(Billerica，MA，USA)。TNF-α和IL-6的ELISA試劑盒從達(dá)科為生物技術(shù)有限公司(深圳，中國)購買。總TOPK、總JNKs、總p38、H2AX抗體，磷酸化的TOPK(Thr9)、磷酸化的JNKs(Thr183/Tyr185)，磷酸化的p38(Thr180/Tyr182)，和磷酸化H2AX(Ser139)購自Cell Signaling Technology(USA)。β-actin抗體和辣根過氧化酶(HRP)的二抗購自Santa Cruz(USA)和Earth Ox life sciences company(San Francisco US)。

2、細(xì)胞培養(yǎng)

人類皮膚角朊細(xì)胞HaCat細(xì)胞和小鼠表皮JB6c141細(xì)胞均來自American Type Culture Collection(ATCC，USA)，對它們進(jìn)行體外培養(yǎng)，使用由ATCC提供的方法。HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基，含10％胎牛血清(FBS)而JB6c141細(xì)胞用MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，含5％胎牛血清(FBS)。這些細(xì)胞均在37℃下含加濕空氣和5％CO2的孵化器中進(jìn)行培養(yǎng)。

3、MTS法檢測細(xì)胞存活率。細(xì)胞接種于96孔板(1000/孔)過夜，然后用不同濃度的丹皮酚(0，50，100，200，400μm)和不同時間(24，48，或72小時)。用MTS檢測試劑盒測定細(xì)胞存活率(Promega公司，麥迪遜，WI)根據(jù)制造商的指示，在490nm處的吸光度讀取數(shù)據(jù)。

4、Western blot

HaCaT細(xì)胞或JB6c141首次接種于6cm的接種板中。經(jīng)過24小時的培養(yǎng)和12小時的饑餓，同時接受SUV的照射刺激。細(xì)胞接受不同劑量的SUV(0，10，20，30，40，50，60kJ/m²)照射或在不同延遲時間(0，5，15，30，60分鐘)后進(jìn)行收樣。為了研究丹皮酚的影響，第一步讓細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中饑餓12小時，然后在接受SUV照射前經(jīng)丹皮酚(25，50，3，6，100mm)進(jìn)行處理3，6，or 12小時。收樣后，在細(xì)胞裂解緩沖液中進(jìn)行破壞，超聲45秒，12000轉(zhuǎn)下離心10分鐘，用Bradford法測定細(xì)胞蛋白濃度。樣品(20-30μG)首先用5×SD的適當(dāng)比例緩沖液進(jìn)行稀釋，然后加熱到95℃10分鐘。樣品經(jīng)SDS-PAGE分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。膜用5％脫脂牛奶或5％的BSA TBST進(jìn)行阻斷。接下來，他們在4℃環(huán)境下與一個特定的初級抗體一起孵育一夜。利用ECL系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)對蛋白條帶進(jìn)行可視化測定。所有結(jié)果均來自至少三個獨立實驗。

5、Gst-h2ax融合蛋白的表達(dá)和純化

大腸桿菌被用來表達(dá)人Gst-h2ax融合蛋白。當(dāng)細(xì)菌生長在37℃恒溫培養(yǎng)混合器中同時接收在600nm0.8-0.9的吸光度，緊接著他們在37℃環(huán)境中用1mM的異丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)再誘導(dǎo)1-2小時，然后通過離心收樣。經(jīng)過反復(fù)凍融，細(xì)胞顆粒懸浮在磷酸鹽緩沖液(PBS)。細(xì)胞裂解液在最大強(qiáng)度的冰凍環(huán)境下進(jìn)行聲處理20分鐘，在轉(zhuǎn)速3000rpm下離心10分鐘。然后他取上清液在4℃谷胱甘肽瓊脂糖珠培養(yǎng)基(GE，美國)上培養(yǎng)過夜。PBS洗滌，用50毫米的谷胱甘肽反復(fù)沖洗3次。

6、微量熱泳動實驗(MST)

丹皮酚固體可溶于ddH₂O，然后用濃度為4mM緩沖液進(jìn)行稀釋，作為工作液I，檢測緩沖液是包含10(v/v)％DMSO。工作液I，所含濃度最高，以確保其親和力。將其與檢測緩沖液按照1∶2的比例進(jìn)行混合稀釋，分成12份，放在不同容器內(nèi)。將相同濃度相同體積的200nm重組TOPK加入到每份工作液中。使用微型熱泳動測試解離常數(shù)Kd值。

7、體外激酶測定

體外激酶的測定包括：Gst-h2ax蛋白，活性TOPK，和ATP。在1個含100μm ATP的蛋白激酶緩沖液可以檢測到反應(yīng)。在30℃孵育30分鐘后的反應(yīng)是有5×SDS組緩沖液停上混合，被SDS-PAGE分離。磷酸化組蛋白H2AX，總H2AX，總TOPK分別被檢測。

8、動物研究

30只雄性Balb/c小鼠(6周大)購于湖北疾病預(yù)防控制中心(湖北，中國)。飼養(yǎng)于12小時為周期的光/暗環(huán)境里，溫度可控，飼養(yǎng)1周，于實驗24小時前剃毛。將小鼠隨機(jī)分為3組：對照組(n＝10)，對照加SUV組(n＝10)，丹皮酚(60mg/kg)加SUV組(n＝10)。在對照組小鼠安樂死之前3小時于背部皮膚上抹上丙酮。對照加SUV組給予涂抹丙酮3小時后用100kJ/m²suv光進(jìn)行照射。在丹皮酚加SUV組給予用60mg/kg丹皮酚處理丙酮然后用100kJ/m²suv燈光進(jìn)行照射。SUV照射后24小時后處死小鼠，并取背部皮膚組織。一半的組織，立即進(jìn)行4％多聚甲醛蘇木精-伊紅(HE)染色和免疫組織化學(xué)(IHC)。其余均被冷凍在-80℃的冰箱待進(jìn)行酶聯(lián)免疫分析。所有動物實驗均按照華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心的規(guī)定完成。

9、免疫組織化學(xué)

抗原修復(fù)是將人類和小鼠的皮膚切片(5μm)放入枸櫞酸鈉緩沖液，10分鐘后用微波進(jìn)行脫蠟和水化。然后再用3％過氧化氫處理的切片，10分鐘。下一步，在室溫下部分用5％山羊血清被封鎖1小時。然后各部分在4℃下滴入相應(yīng)的初級抗體孵育一宿。利用生物素-鏈親和素和DAB系統(tǒng)進(jìn)行顯色反應(yīng)。所有的切片應(yīng)用蘇木精進(jìn)行反染色。應(yīng)用醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(MIA)對圖像進(jìn)行免疫組化分析。

10、統(tǒng)計分析

所有的定量數(shù)據(jù)都用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。進(jìn)行t檢驗或單因素方差分析。P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

實施例二 丹皮酚結(jié)合TOPK并抑制其活性。

基于全面的光譜分析和之前公布的數(shù)據(jù)，丹皮酚被鑒定為一個已知的1-(2-羥基-4-甲氧苯基)乙酮(圖3A)。用MTS法測定丹皮酚的毒性，HaCat和c141 JB6細(xì)胞分別用不同濃度的丹皮酚(0，50，100，200，400μm)進(jìn)行處理及不同時間(24，48，72h)。結(jié)果表明，丹皮酚對JB6 c141和HaCat細(xì)胞均沒有明顯的細(xì)胞毒性(圖3b)。

驗證丹皮酚能否與TOPK結(jié)合。MST法是一種光學(xué)的方法，其特點是非液相，而且樣品消耗低。它可以高靈敏的量化蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用或小分子蛋白質(zhì)的相互作用。用MST實驗測試丹皮酚和TOPK之間的親和力。在這項研究中，丹皮酚具有相當(dāng)?shù)偷钠胶饨怆x常數(shù)(Kd)7670+/-690nm，表明與TOPK有很強(qiáng)的親和力(圖3c)。體外蛋白激酶測定表明，隨著丹皮酚的濃度從12.5um增加到50um，被活性TOPK催化的γ-H2AX水平逐漸降低(圖3d)。這些數(shù)據(jù)表明，丹皮酚能與TOPK結(jié)合并抑制其活性，而且無明顯的細(xì)胞毒性。

實施例三 丹皮酚抑制SUV誘導(dǎo)的p38和JNK的激活過程。

JB6細(xì)胞在使用20kJ/m²的SUV照射下對丹皮酚預(yù)處理12小時，厚度從25um到100um，同時檢測p38磷酸化或JNKs水平。結(jié)果表明，水平逐漸降低(圖4A)。其次，在20kJ/m²的SUV照射下經(jīng)100um丹皮酚培養(yǎng)的JB6細(xì)胞隨培養(yǎng)時間從3小時增加到12小時，p38磷酸化或JNKs的水平也逐漸下降(圖4B)。HaCaT細(xì)胞中得到了相似的結(jié)果(圖4c、4d)。這些數(shù)據(jù)表明，丹皮酚能抑制SUV體外誘導(dǎo)的JNK或p38的激活。丹皮酚成時間和劑量依耐性下調(diào)SUV誘導(dǎo)的下游的TOPK信號通路，同時抑制JB6 c141和HaCaT細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的分泌。

實施例四 丹皮酚降低TOPK相關(guān)的DNA損傷的標(biāo)志物組蛋白H2AX

組蛋白H2AX是DNA損傷的標(biāo)志物質(zhì)，也是TOPK作用物之一，可以在ser-139(γ-H2AX)被TOPK磷酸化，γ-H2AX是DNA雙鏈斷裂的生物標(biāo)志物。Mskl是p38蛋白激酶的下游底物和DNA損傷相關(guān)。TOPK是p38的上游蛋白激酶。在本發(fā)明觀察中，JB6細(xì)胞在使用20kJ/m²的SUV照射下對丹皮酚預(yù)處理12小時，厚度從25um到100um，MSKl的磷酸化水平、H2AX或TOPK逐漸減少(圖5A)。其次，在20kJ/m²的SUV照射下經(jīng)100um丹皮酚培養(yǎng)的JB6細(xì)胞隨培養(yǎng)時間從3小時增加到12小時，p38磷酸化或TOPK的水平也逐漸下降(圖5b)。類似的結(jié)果在HaCat的細(xì)胞中也可觀察到(圖5c、5d)。

實施例五 丹皮酚降低炎癥因子TNF-α和IL-6分泌

在本發(fā)明觀察中，在JB6或HaCat細(xì)胞內(nèi)，被20kJ/M²的SUV照射刺激TNF-α或IL-6的分泌過程被100um的丹皮酚抑制(圖5e)。這些結(jié)果表明，丹皮酚能抑制SUV誘導(dǎo)的DNA損傷，通過抑制TOPK活性，同時丹皮酚抑制了體內(nèi)細(xì)胞因子的分泌。因此，體外和體內(nèi)實驗中，丹皮酚均可以抑制SUV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

實施例六 丹皮酚抑制SUV誘導(dǎo)的動物皮膚炎癥反應(yīng)

在小鼠皮膚組織采用HE染色觀察中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)100KJ/m²的SUV照射后，表皮角化過度后，炎性細(xì)胞浸潤，多灶性間質(zhì)水腫。這些都是皮膚炎癥的跡象。其次，與對照組相比，小鼠組織經(jīng)照射后，TOPK，p38磷酸化水平、JNK、γH2AX均增加(圖6a)。第三，小鼠皮膚組織經(jīng)照射后，分泌的細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的濃度均增加，而且在小鼠皮膚照射前涂抹丹皮酚(60mg/kg)可有效抑制這一炎癥反應(yīng)(圖6b)。這些數(shù)據(jù)表明，丹皮酚能抑制SUV引起的皮膚炎癥和DNA的損傷。

通過以上實施例，結(jié)合TOPK的生理、病理生理學(xué)方面的分子生物學(xué)功能，可以看出，除了在本發(fā)明中丹皮酚通過結(jié)合并抑制TOPK活性預(yù)防和/或治療TOPK活性異常增高的皮膚炎癥，如UV誘發(fā)的光線性皮膚病(日曬傷和慢性光化性皮炎)之外，推測丹皮酚也可以通過結(jié)合并抑制TOPK的活性預(yù)防和/或治療TOPK活性異常增高的其他皮膚炎癥和腫瘤，如各型銀屑病、紅斑狼瘡、日光角化癥、黑色素瘤、皮膚鱗癌等，以及人體其他系統(tǒng)器官組織TOPK活性異常增高的炎癥和腫瘤。同時，推測丹皮酚更大的用藥劑量，可能產(chǎn)生更好的效果。