技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明總體上涉及用于治療增生性疾病(proliferative disease)尤其是癌癥的新型化學(xué)組合和方法。

背景技術(shù)：

癌癥通常用化學(xué)療法和/或放射療法進(jìn)行治療。盡管經(jīng)常有效用于破壞大量的腫瘤細(xì)胞，但是這樣的療法經(jīng)常遺留對(duì)治療有抗性的大量腫瘤細(xì)胞。這些抗性細(xì)胞能夠增殖而形成對(duì)治療也有抗性的新腫瘤。使用化療藥物的已知組合已導(dǎo)致多藥抗性(“MDR”)腫瘤細(xì)胞。

增生性疾病如癌癥的模式是多因子的。例如，對(duì)過(guò)去四十年的研究已導(dǎo)致認(rèn)識(shí)到，細(xì)胞毒性劑(或抗增生劑)包括干擾微管組成(microtubule formulation)的抗代謝劑、能夠交聯(lián)DNA的烷基化劑、通過(guò)阻斷DNA復(fù)制而能夠干擾DNA烷基化的基于鉑的試劑、抗腫瘤抗生素劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(topoisomerase inhibitor)等。在這樣的疾病的治療中，具有不同機(jī)制的藥物可以進(jìn)行組合(即，聯(lián)合療法)，具有有益的效果，包括有效治療MDR腫瘤細(xì)胞以及最小化副作用如不期望的細(xì)胞毒性。然而，這里的困難在于，不是所有已知的抗增生劑的組合提供有用或有益的效果，并且相應(yīng)地在許多實(shí)驗(yàn)室的研究目前集中在開(kāi)發(fā)新的且有用的抗增生組合伴侶(聯(lián)合配體，combination partner)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種用于治療增生性疾病的藥物組合(藥物組合物或藥物聯(lián)用，pharmaceutical combination)，包括：(a)微管蛋白聚合抑制劑，和(b)mTOR(雷帕霉素的哺乳動(dòng)物靶標(biāo))抑制劑。

本發(fā)明還提供一種用于治療增生性疾病的方法，包括向需要其的患者給予(a)微管蛋白聚合抑制劑、和(b)mTOR抑制劑的步驟。

本發(fā)明還提供(a)微管蛋白聚合抑制劑、和(b)mTOR抑制劑在制備用于治療增生性疾病的藥劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供聯(lián)合(b)mTOR抑制劑使用的(a)微管蛋白聚合抑制劑在制備用于治療增生性疾病的藥劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供聯(lián)合(a)微管蛋白聚合抑制劑使用的(b)mTOR抑制劑在制備用于治療增生性疾病的藥劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明進(jìn)一步提供一種藥物組合物，包含(a)微管蛋白聚合抑制劑、和(b)mTOR抑制劑。

令人驚訝地，已發(fā)現(xiàn)在利用包含(a)微管蛋白聚合抑制劑、和(b)mTOR抑制劑的組合來(lái)治療增生性疾病中的效果大于單獨(dú)利用(a)或(b)能夠?qū)崿F(xiàn)的效果。即，已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的組合具有加合或協(xié)同效應(yīng)。

附圖說(shuō)明

圖1是示出了本發(fā)明的組合的提出效果的示意圖。

圖2是示出了對(duì)于實(shí)例2化合物(Example 2compound)與替西羅莫司(temsirolimus)的組合對(duì)于各種癌細(xì)胞系的聯(lián)合指數(shù)值(combination index value)的圖表。CI＝0.1-0.9協(xié)同作用的；CI＝0.9-1.1加合的；CI＝>1.1無(wú)加合益處。

圖3是示出了利用實(shí)例2(化合物)處理的人腎異種移植物的免疫化學(xué)分析的照片。

圖4示出了與CA4P和本發(fā)明的化合物實(shí)例2(化合物)之間的血管性衰竭(腫瘤灌注減少)的比較水平有關(guān)的％灌注對(duì)照相對(duì)于化合物的量(mg/kg)的曲線圖(血管阻斷測(cè)定，單次彈丸注射：給藥后24小時(shí))。

圖5示出了與化合物實(shí)例2(化合物)在帶有MDA-MB-231原位乳腺實(shí)性腫瘤的Balb/c nu/nu小鼠中的腫瘤生長(zhǎng)抑制有關(guān)的腫瘤體積比(天*/第1天)相對(duì)于時(shí)間(天)的曲線圖。

圖6示出了用實(shí)例2(化合物)和mTOR抑制劑雷帕霉素(rapamycin)(+/-SEM)處理的Caki-1異種移植物的腫瘤體積(mm³)相對(duì)于時(shí)間(天)的曲線圖。

圖7示出了對(duì)于用實(shí)例2(化合物)和mTOR抑制劑雷帕霉素處理的具有Caki-1異種移植物的小鼠的存活的百分比存活相對(duì)于時(shí)間(天)的曲線圖。

具體實(shí)施方式

在整個(gè)本說(shuō)明書(shū)及所附權(quán)利要求書(shū)中，除非上下文有其他要求，術(shù)語(yǔ)“包括”及變形如“包含”和“含有”應(yīng)被理解為，暗示包括所述的整數(shù)或步驟、或整數(shù)或步驟的組，但不排除任何其他的整數(shù)或步驟、或整數(shù)或步驟的組。

本說(shuō)明書(shū)中對(duì)任何現(xiàn)有公開(kāi)(或來(lái)源其的信息)、或?qū)σ阎娜魏问虑榈奶峒?，不是并且不?yīng)被視為承認(rèn)或表示或任何形式的啟示，該現(xiàn)有公開(kāi)(或來(lái)源于其的信息)或已知的事情形成本說(shuō)明書(shū)所涉及的研究領(lǐng)域中的公知常識(shí)的一部分。

組合伴侶(a)：微管蛋白聚合抑制劑(TPI)

如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“微管蛋白聚合抑制劑”是指這樣的任何和所有化合物，其直接與微管蛋白相互作用并抑制微管蛋白聚合，并由此干擾微管的生理功能。微管蛋白抑制劑(TPI)經(jīng)常被稱(chēng)為微管“不穩(wěn)定(destabilising)”劑。這樣的化合物應(yīng)與微管蛋白相互作用化合物如紫杉烷類(lèi)和愛(ài)博霉素類(lèi)(epothilones)(其使微管蛋白聚合物穩(wěn)定并抑制微管蛋白解聚(即微管穩(wěn)定劑))形成對(duì)照。

合適TPI的實(shí)例包括：

(i)合成化合物

·ABT-751(E7010，Abbott)

·MPC-6827(Azixa^TM，Myriad Pharmaceuticals)

·AEZS-112(ZEN-012，Eterna Zentaris)

·CYT997(Cytopia)

·MN-029(Denibulin，MediciNova/Angiogene)

·EPC2407(EpiCept)

·ZIO-301(Indibulin，Ziopharm Oncology)

(ii)天然產(chǎn)物衍生物

·長(zhǎng)春氟寧(vinflunine)(Javlor，Pierre Fabre Medicament)以及其他長(zhǎng)春花生物堿類(lèi)(vinca alkaloids)(例如長(zhǎng)春滅瘟堿(vinblastin)、長(zhǎng)春新堿(vincristine)和長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine))

·考布他汀(combretastatin)

·CA4(Zybrestat^TM，OXiGENE)

·Oxi4503(OXiGENE)

·AVE8062(AC7700，Sanofi Aventis)

·甲磺酸艾日布林(Eribulin Mesylate)(E7389，Eisai)

·多拉司他汀10(Dolastatin 10)(NCI)

·他西多丁(Tasidotin)(synthadotin，Genzyme)

·2-甲氧雌甾二醇(2-methoxyestradiol)(2ME2或EntreMed)

·E7974(Eisai)

·NPI-2358(Nereus Pharmaceuticals)

微管是絲狀聚合物，其是細(xì)胞骨架的關(guān)鍵成分。它們是在聚合和解聚的狀態(tài)之間波動(dòng)的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)。這種性能使得微管能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞形狀、粘附、遷移和增殖。TPI直接中斷(破壞，disrupt)微管聚合過(guò)程并相應(yīng)地具有實(shí)現(xiàn)(招致或達(dá)到，effect)細(xì)胞形狀改變和抑制細(xì)胞增殖的能力。這些性能對(duì)于TPI作為用于治療癌癥的治療劑以及在本發(fā)明的組合中的應(yīng)用是很重要的。

主要由于它們的選擇性地關(guān)閉(停止或衰竭，shut down)通過(guò)腫瘤的血流的能力，TPI化合物在癌癥治療中很重要。通過(guò)化療用TPI劑的開(kāi)發(fā)和新的廣泛臨床使用，靶向微管蛋白聚合抑制已經(jīng)成為一種非常良好有效的抗癌途徑。

TPI可以基于它們的特定微管蛋白結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分類(lèi)。

長(zhǎng)春花生物堿類(lèi)與微管蛋白的結(jié)合定義(限定，define)利用這些化合物觀察到的介導(dǎo)微管蛋白不穩(wěn)定化活性的位點(diǎn)。該“長(zhǎng)春花”位點(diǎn)已被證實(shí)直接結(jié)合實(shí)現(xiàn)微管蛋白不穩(wěn)定的大量化合物。

秋水仙堿(秋水仙素，colchicine)與微管蛋白的結(jié)合限定與“長(zhǎng)春花”位點(diǎn)情形一樣的引起微管蛋白不穩(wěn)定的獨(dú)立結(jié)合位點(diǎn)。盡管TPI與“長(zhǎng)春花”位點(diǎn)的結(jié)合作為抗癌化療劑已成功，但是“秋水仙堿”位點(diǎn)結(jié)合劑相對(duì)被忽視，可能是由于缺少由秋水仙堿提供的治療空白。然而，最近，已經(jīng)描述了大量“秋水仙堿”位點(diǎn)結(jié)合劑，其具有引起實(shí)性腫瘤內(nèi)的血管阻斷的能力。這些TPI被稱(chēng)為血管阻斷劑(VDA)。表現(xiàn)出VDA能力的“秋水仙堿”位點(diǎn)結(jié)合劑中的許多是基于天然產(chǎn)物如考布他汀(CA4P，OXi-4503，AVE-8062)、秋水仙堿(ZD6126)和脫氫苯基阿夕斯丁(phenylahistin)(NPI-2358)，盡管其他的是合成化合物(MN-029和EPC2407)。

TPI由于干擾微管完整性而充當(dāng)VDA，導(dǎo)致內(nèi)襯(line)腫瘤的血管的內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞骨架改變。作為結(jié)果，這些通常是扁平的細(xì)胞變?yōu)楦鼒A形的，并失去它們的細(xì)胞之間的接觸。這些事件導(dǎo)致腫瘤血管變窄并最終堵塞通過(guò)這些血管的血流。與這些試劑相關(guān)的腫瘤選擇性起因于這樣的事實(shí)，即腫瘤血管系統(tǒng)比正常血管系統(tǒng)更弱并且更趨于瓦解。然而，大量與VDA相關(guān)的劑量受限毒性是由于健康組織中血流的減少。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，TPI是通過(guò)結(jié)合于微管蛋白的秋水仙堿位點(diǎn)而起作用的TPI。能夠用來(lái)確定TPI是否在微管蛋白的秋水仙堿位點(diǎn)處起作用的測(cè)定在本領(lǐng)域是已知的，如在Ma,R et al,Cancer Chemother.Pharmacol.,2008,Sept 62(4)559-68中。

在另一實(shí)施方式中，TPI是在秋水仙堿結(jié)合位點(diǎn)處起作用且是基于有環(huán)呋喃類(lèi)(annulated furans)(例如苯并呋喃，呋喃并[2,3-d]嘧啶-2(1H)-酮等)、苯并噻吩和吲哚結(jié)構(gòu)骨架的TPI，如在US 7,456,214、US 7,429,681、US 7,071,190、US 6,849,656、US 5,886,025、US 6,162,930、US 6,350,777、US 5,340,062、WO 06/084338、WO 02/060872、WO 07/087684和WO 08/070908中公開(kāi)的那些。

在一個(gè)實(shí)施方式中，TPI選自在WO 06/084338、WO 07/087684或WO 08/070908中公開(kāi)的TPI。

在一個(gè)實(shí)施方式中，TPI選自下式(I)的化合物及其鹽：

其中：

X表示O、S、SO、SO₂、Se、SeO、SeO₂或NR，其中R選自H、O、可選取代的酰基、可選取代的烯基、可選取代的烷基、可選取代的芳基、可選取代的環(huán)烯基、可選取代的環(huán)烷基、可選取代的雜芳基、可選取代的雜環(huán)基、以及可選取代的磺酰基；

R^1A和R^1B各自獨(dú)立地表示H、羧基、氰基、二鹵代甲氧基、鹵素、羥基、硝基、五鹵代乙基、磷酰氨基(phosphorylamino)、膦?；?phosphono)、氧膦基(phosphinyl)、磺基(硫代，sulfo)、三鹵代乙烯基、三鹵代甲硫基(trihalomethanethio)、三鹵代甲氧基、三鹵代甲基、可選取代的?；?、可選取代的酰氨基(acylamino)、可選取代的酰亞氨基(acylimino)、可選取代的酰亞氨氧基(acyliminoxy)、可選取代的酰氧基、可選取代的芳烷基、可選取代的芳烷氧基、可選取代的烯基、可選取代的烯氧基、可選取代的烷氧基、可選取代的烷基、可選取代的炔基、可選取代的炔氧基、可選取代的氨基、可選取代的氨?；?、可選取代的氨酰氧基、可選取代的氨磺?；⒖蛇x取代的氨硫?；?aminothioacyl)、可選取代的芳基、可選取代的芳氧基、可選取代的環(huán)烯基、可選取代的環(huán)烷基、可選取代的雜芳基、可選取代的雜環(huán)基、可選取代的氧酰基、可選取代的氧酰氨基、可選取代的氧酰氧基、可選取代的氧酰亞氨基、可選取代的氧亞磺酰氨基(oxysulfinylamino)、可選取代的氧磺酰氨基、可選取代的氧硫?；?oxythioacyl)、可選取代的氧硫酰氧基、可選取代的亞磺?；?sulfinyl)、可選取代的亞磺酰氨基、可選取代的磺酰基、可選取代的磺酰氨基、可選取代的硫基(巰基，thio)、可選取代的硫?；?thioacyl)、可選取代的硫酰氨基(thioacylamino)，或者R^1A和R^1B一起形成可選取代的芳基、可選取代的雜環(huán)基、可選取代的雜芳基、可選取代的環(huán)烷基、或可選取代的環(huán)烯基；

R^1C表示C_1-3烷氧基、C_1-3烷硫基(alkylthio)、C_1-3烷氨基、或C_1-3二烷氨基；

R^1D表示羥基或氨基；

L表示C＝O、O、S、SO、SO₂、Se、SeO、SeO₂、C＝NZ′、或NR′，其中Z′是H、可選取代的烷基、可選取代的芳基或可選取代的氨基；并且其中R′選自H、O、可選取代的?；?、可選取代的烯基、可選取代的烷基、可選取代的芳基、可選取代的環(huán)烯基、可選取代的環(huán)烷基、可選取代的雜芳基、可選取代的雜環(huán)基、或可選取代的磺?；?；

R^2A-R^2E各自獨(dú)立地表示H、羧基、氰基、二鹵代甲氧基、鹵素、羥基、硝基、五鹵代乙基、磷酰氨基、膦酰基、氧膦基、磺基、三鹵代乙烯基、三鹵代甲硫基、三鹵代甲氧基、三鹵代甲基、可選取代的酰基、可選取代的酰氨基、可選取代的酰亞氨基、可選取代的酰亞氨氧基、可選取代的酰氧基、可選取代的芳烷基、可選取代的芳烷氧基、可選取代的烯基、可選取代的烯氧基、可選取代的烷氧基、可選取代的烷基、可選取代的炔基、可選取代的炔氧基、可選取代的氨基、可選取代的氨?；?、可選取代的氨酰氧基、可選取代的氨磺?；?、可選取代的氨硫酰基、可選取代的芳基、可選取代的芳氧基、可選取代的環(huán)烯基、可選取代的環(huán)烷基、可選取代的雜芳基、可選取代的雜環(huán)基、可選取代的氧酰基、可選取代的氧酰氨基、可選取代的氧酰亞氨基、可選取代的氧酰氧基、可選取代的氧亞磺酰氨基、可選取代的氧磺酰氨基、可選取代的氧硫?；?、可選取代的氧硫酰氧基、可選取代的亞磺?；⒖蛇x取代的亞磺酰氨基、可選取代的磺?；?、可選取代的磺酰氨基、可選取代的硫基、可選取代的硫酰基、可選取代的硫酰氨基，或可選取代的硫酰氧基；或者R^2A和R^2B、R^2B和R^2C、R^2C和R^2D、以及R^2D和R^2E中的任一個(gè)(任何)一起形成可選取代的芳基、可選取代的雜環(huán)基、可選取代的雜芳基、可選取代的環(huán)烷基、或可選取代的環(huán)烯基；以及

Q表示H、CN、鹵素、三烷基硅烷基、可選取代的烷基、可選取代的烯基、可選取代的炔基、可選取代的?；?、可選取代的氧?；?、可選取代的酰氨基、可選取代的氨酰氨基、OR"、SR"或NR"R"，其中各個(gè)R"獨(dú)立地表示H、可選取代的烷基、可選取代的烯基、可選取代的炔基、可選取代的芳基、可選取代的雜芳基、可選取代的雜環(huán)基、可選取代的?；涂蛇x取代的氧酰基，或者NR"′N(xiāo)R"′，其中各個(gè)R"′獨(dú)立地表示H、可選取代的烷基、可選取代的烯基、可選取代的炔基、可選取代的芳基和可選取代的雜芳基。

在一些實(shí)施方式中，R^1A-R^1B和R^2A-R^2E獨(dú)立地選自以下基團(tuán)：

烷基，優(yōu)選甲基和乙基；

取代烷基，優(yōu)選1-羥乙基，1-巰乙基，甲氧基亞氨基甲基，乙氧基亞氨基甲基，1-(羥基亞氨基)乙基，1-(羥基亞氨基)丙基，1-肼基乙基(1-hydrazinoethyl)，1-肼基丙基，羥基亞氨基甲基，2-氧丙基，2-氧丁基，3-氧戊基，硝基甲基，1-硝基甲基和2-硝基甲基；

?；?，優(yōu)選甲?；阴；?，丙酰基，苯甲?；?可選地被甲基、甲氧基、鹵素、硝基、三氟甲基或氰基取代)；

烷氧基，優(yōu)選甲氧基和乙氧基；

氧?；瑑?yōu)選甲氧基羰基，乙氧基羰基，丙氧基羰基，丁氧基羰基，異丁氧基羰基；

酰氧基，優(yōu)選乙酰氧基和丙酰氧基；

取代的芳烷基，優(yōu)選1-羥基芐基，和1-巰芐基；

亞磺?；?，優(yōu)選甲基亞磺酰基，乙基亞磺酰基，苯亞磺?；?可選地被甲基、甲氧基、鹵素、硝基、三氟甲烷或氰基取代)，甲氧基亞磺?；已趸鶃喕酋；?/p>

磺?；?，優(yōu)選甲磺?；?，乙磺?；?，苯磺?；?可選地被甲基、甲氧基、鹵素、硝基、三氟甲烷或氰基取代)，甲氧基碳(methoxycarbo)，三氟甲烷；

氧酰氨基，優(yōu)選甲氧羰基氨基(甲氧酰胺基，methoxycarbonylamido)和乙氧羰基氨基；

氧硫?；瑑?yōu)選甲氧硫羰基和乙氧硫羰基；

硫酰氧基，優(yōu)選硫乙酰氧基(thionoacetoxy)和硫丙酰氧基(thionopropionoxy)；

亞磺酰氨基，優(yōu)選甲亞磺酰氨基，乙亞磺酰氨基和苯亞磺酰氨基(可選地被甲基、甲氧基、鹵素、硝基、三氟甲烷或氰基取代)；

氨基；

取代氨基，優(yōu)選L-纈氨酸、D-纈氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、天冬氨酸和丙氨酰絲氨酸的殘基，N-甲氨基，以及N,N′-二甲氨基；

磺酰氨基，優(yōu)選甲磺酰氨基，乙磺酰氨基和苯磺酰氨基(可選地被甲基、甲氧基、鹵素、硝基、三氟甲烷或氰基取代)；

氧亞磺酰氨基，優(yōu)選甲氧基亞磺酰氨基和乙氧基亞磺酰氨基；

氧磺酰氨基，優(yōu)選甲氧基磺酰氨基和乙氧基磺酰氨基；

可選取代的烯基，優(yōu)選1-丙烯基，乙烯基，硝基乙烯基，氰基乙烯基，或三氟乙烯基和苯乙烯基(可選地被甲基、甲氧基、鹵素、硝基、三氟甲烷或氰基取代)；

炔基，優(yōu)選1-丙炔基，乙炔基或三甲基硅烷基乙炔基。

在一個(gè)實(shí)施方式中，R^2D、R^2C和R^2B是甲氧基并且L是羰基(C＝O)。

相應(yīng)地，在這個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的TPI由下式(Ia)表示：

其中：

X表示O、S、SO、SO₂、Se、SeO、SeO₂或NR，其中R選自H、O、可選取代的?；?、可選取代的烯基、可選取代的烷基、可選取代的芳基、可選取代的環(huán)烯基、可選取代的環(huán)烷基、可選取代的雜芳基、可選取代的雜環(huán)基、和可選取代的磺?；?；

R^1A和R^1B各自獨(dú)立地表示H、羧基、氰基、二鹵代甲氧基、鹵素、羥基、硝基、五鹵代乙基、磷酰氨基、膦?；?、氧膦基、磺基、三鹵代乙烯基、三鹵代甲硫基、三鹵代甲氧基、三鹵代甲基、可選取代的酰基、可選取代的酰氨基、可選取代的酰亞氨基、可選取代的酰亞氨氧基、可選取代的酰氧基、可選取代的芳烷基、可選取代的芳烷氧基、可選取代的烯基、可選取代的烯氧基、可選取代的烷氧基、可選取代的烷基、可選取代的炔基、可選取代的炔氧基、可選取代的氨基、可選取代的氨?；⒖蛇x取代的氨酰氧基、可選取代的氨磺酰基、可選取代的氨硫酰基、可選取代的芳基、可選取代的芳氧基、可選取代的環(huán)烯基、可選取代的環(huán)烷基、可選取代的雜芳基、可選取代的雜環(huán)基、可選取代的氧?；?、可選取代的氧酰氨基、可選取代的氧酰氧基、可選取代的氧酰亞氨基、可選取代的氧亞磺酰氨基、可選取代的氧磺酰氨基、可選取代的氧硫?；⒖蛇x取代的氧硫酰氧基、可選取代的亞磺?；⒖蛇x取代的亞磺酰氨基、可選取代的磺?；⒖蛇x取代的磺酰氨基、可選取代的硫基、可選取代的硫?；?、可選取代的硫酰氨基，或者R^1A和R^1B一起形成可選取代的芳基、可選取代的雜環(huán)基、可選取代的雜芳基、可選取代的環(huán)烷基、或可選取代的環(huán)烯基；

R^1C表示C_1-3烷氧基、C_1-3烷硫基、C_1-3烷氨基、或C_1-3二烷氨基；

R^1D表示羥基或氨基；

R^2A和R^2E獨(dú)立地表示H、羧基、氰基、二鹵代甲氧基、鹵素、羥基、硝基、五鹵代乙基、磷酰氨基、膦?；?、氧膦基、磺基、三鹵代乙烯基、三鹵代甲硫基、三鹵代甲氧基、三鹵代甲基、可選取代的酰基、可選取代的酰氨基、可選取代的酰亞氨基、可選取代的酰亞氨氧基、可選取代的酰氧基、可選取代的芳烷基、可選取代的芳烷氧基、可選取代的烯基、可選取代的烯氧基、可選取代的烷氧基、可選取代的烷基、可選取代的炔基、可選取代的炔氧基、可選取代的氨基、可選取代的氨酰基、可選取代的氨酰氧基、可選取代的氨磺酰基、可選取代的氨硫?；?、可選取代的芳基、可選取代的芳氧基、可選取代的環(huán)烯基、可選取代的環(huán)烷基、可選取代的雜芳基、可選取代的雜環(huán)基、可選取代的氧?；?、可選取代的氧酰氨基、可選取代的氧酰氧基、可選取代的氧酰亞氨基、可選取代的氧亞磺酰氨基、可選取代的氧磺酰氨基、可選取代的氧硫酰基、可選取代的氧硫酰氧基、可選取代的亞磺?；?、可選取代的亞磺酰氨基、可選取代的磺?；?、可選取代的磺酰氨基、可選取代的硫基、可選取代的硫?；⒖蛇x取代的硫酰氨基、或可選取代的硫酰氧基；以及

Q表示H、CN、鹵素、三烷基硅烷基、可選取代的烷基、可選取代的烯基、可選取代的炔基、可選取代的酰基、可選取代的氧?；?、可選取代的酰氨基、可選取代的氨酰氨基、可選取代的氨酰氨基、OR"、SR"或NR"R"，其中各個(gè)R"獨(dú)立地表示H、可選取代的烷基、可選取代的烯基、可選取代的炔基、可選取代的芳基、可選取代的雜芳基、可選取代的雜環(huán)基、可選取代的酰基和可選取代的氧?；蛘逳R"′N(xiāo)R"′，其中各個(gè)R"′獨(dú)立地表示H、可選取代的烷基、可選取代的烯基、可選取代的炔基、可選取代的芳基和可選取代的雜芳基。

在另一實(shí)施方式中，R^1A、R^1B、R^2A和R^2E表示H，并且R^1C表示C_1-3烷氧基。

相應(yīng)地，在這個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的TPI由下式(Ib)表示：

其中：

X表示O、S、SO、SO₂、Se、SeO、SeO₂或NR，其中R選自H、O、可選取代的酰基、可選取代的烯基、可選取代的烷基、可選取代的芳基、可選取代的環(huán)烯基、可選取代的環(huán)烷基、可選取代的雜芳基、可選取代的雜環(huán)基、和可選取代的磺酰基；

R^1C表示C_1-3烷氧基；

R^1D表示羥基或氨基；

Q表示H、CN、鹵素、三烷基硅烷基、可選取代的烷基、可選取代的烯基、可選取代的炔基、可選取代的?；?、可選取代的氧酰基、可選取代的酰氨基、可選取代的氨酰氨基、OR"、SR"或NR"R"，其中各個(gè)R"獨(dú)立地表示H、可選取代的烷基、可選取代的烯基、可選取代的炔基、可選取代的芳基、可選取代的雜芳基、可選取代的?；涂蛇x取代的氧?；?，或者NR"′N(xiāo)R"′，其中各個(gè)R"′獨(dú)立地表示H、可選取代的烷基、可選取代的烯基、可選取代的炔基、可選取代的芳基和可選取代的雜芳基。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，R^1C表示甲氧基。

對(duì)于由式I、Ia和Ib表示的化合物，X優(yōu)選選自O(shè)、S和NR。更優(yōu)選地，X是O或NR，并最優(yōu)選地X是O。

相應(yīng)地，在另一實(shí)施方式中，該TPI由下式II表示：

其中：

R^1A和R^1B各自獨(dú)立地表示H、羧基、氰基、二鹵代甲氧基、鹵素、羥基、硝基、五鹵代乙基、磷酰氨基、膦?；?、氧膦基、磺基、三鹵代乙烯基、三鹵代甲硫基、三鹵代甲氧基、三鹵代甲基、可選取代的酰基、可選取代的酰氨基、可選取代的酰亞氨基、可選取代的酰亞氨氧基、可選取代的酰氧基、可選取代的芳烷基、可選取代的芳烷氧基、可選取代的烯基、可選取代的烯氧基、可選取代的烷氧基、可選取代的烷基、可選取代的炔基、可選取代的炔氧基、可選取代的氨基、可選取代的氨?；⒖蛇x取代的氨酰氧基、可選取代的氨磺?；?、可選取代的氨硫?；?、可選取代的芳基、可選取代的芳氧基、可選取代的環(huán)烯基、可選取代的環(huán)烷基、可選取代的雜芳基、可選取代的雜環(huán)基、可選取代的氧?；?、可選取代的氧酰氨基、可選取代的氧酰氧基、可選取代的氧酰亞氨基、可選取代的氧亞磺酰氨基、可選取代的氧磺酰氨基、可選取代的氧硫?；?、可選取代的氧硫酰氧基、可選取代的亞磺?；?、可選取代的亞磺酰氨基、可選取代的磺?；⒖蛇x取代的磺酰氨基、可選取代的硫基、可選取代的硫?；⒖蛇x取代的硫酰氨基，或者R^1A和R^1B一起形成可選取代的芳基、可選取代的雜環(huán)基、可選取代的雜芳基、可選取代的環(huán)烷基、或可選取代的環(huán)烯基；

R^1C表示C_1-3烷氧基、C_1-3烷硫基、C_1-3烷氨基、或C_1-3二烷氨基；

R^1D表示羥基或氨基；

L表示C＝O、O、S、SO、SO₂、Se、SeO、SeO₂、C＝NZ′、或NR′，其中Z′是H、可選取代的烷基、可選取代的芳基或可選取代的氨基；并且其中R′選自H、O、可選取代的?；?、可選取代的烯基、可選取代的烷基、可選取代的芳基、可選取代的環(huán)烯基、可選取代的環(huán)烷基、可選取代的雜芳基、可選取代的雜環(huán)基、或可選取代的磺?；?/p>

R^2A-R^2E各自獨(dú)立地表示H、羧基、氰基、二鹵代甲氧基、鹵素、羥基、硝基、五鹵代乙基、磷酰氨基、膦?；⒀蹯⒒?、磺基、三鹵代乙烯基、三鹵代甲硫基、三鹵代甲氧基、三鹵代甲基、可選取代的?；⒖蛇x取代的酰氨基、可選取代的酰亞氨基、可選取代的酰亞氨氧基、可選取代的酰氧基、可選取代的芳烷基、可選取代的芳烷氧基、可選取代的烯基、可選取代的烯氧基、可選取代的烷氧基、可選取代的烷基、可選取代的炔基、可選取代的炔氧基、可選取代的氨基、可選取代的氨?；?、可選取代的氨酰氧基、可選取代的氨磺?；⒖蛇x取代的氨硫?；⒖蛇x取代的芳基、可選取代的芳氧基、可選取代的環(huán)烯基、可選取代的環(huán)烷基、可選取代的雜芳基、可選取代的雜環(huán)基、可選取代的氧酰基、可選取代的氧酰氨基、可選取代的氧酰亞氨基、可選取代的氧酰氧基、可選取代的氧亞磺酰氨基、可選取代的氧磺酰氨基、可選取代的氧硫酰基、可選取代的氧硫酰氧基、可選取代的亞磺?；⒖蛇x取代的亞磺酰氨基、可選取代的磺酰基、可選取代的磺酰氨基、可選取代的硫基、可選取代的硫?；⒖蛇x取代的硫酰氨基、或可選取代的硫酰氧基；或者R^2A和R^2B、R^2B和R^2C、R^2C和R^2D以及R^2D和R^2E中的任一個(gè)一起形成可選取代的芳基、可選取代的雜環(huán)基、可選取代的雜芳基、可選取代的環(huán)烷基、或可選取代的環(huán)烯基；以及

Q表示H、CN、鹵素、三烷基硅烷基、可選取代的烷基、可選取代的烯基、可選取代的炔基、可選取代的?；?、可選取代的氧酰基、可選取代的酰氨基、可選取代的氨酰氨基、OR"、SR"或NR"R"，其中各個(gè)R"獨(dú)立地表示H、可選取代的烷基、可選取代的烯基、可選取代的炔基、可選取代的雜環(huán)基、可選取代的芳基、可選取代的雜芳基、可選取代的酰基和可選取代的氧?；?，或者NR"′N(xiāo)R"′，其中各個(gè)R"′獨(dú)立地表示H、可選取代的烷基、可選取代的烯基、可選取代的炔基、可選取代的芳基和可選取代的雜芳基。

在該實(shí)施方式中，優(yōu)選L是羰基(C＝O)。而且，優(yōu)選R^2D、R^2C或R^2B中的至少一個(gè)表示羥基或C_1-3烷氧基。更優(yōu)選地，當(dāng)X＝O時(shí)，L是羰基并且R^2D、R^2C和R^2B表示甲氧基。甚至更優(yōu)選地，當(dāng)X＝O時(shí)，L是羰基，R^2D、R^2C和R^2B表示甲氧基，并且R^1A、R^1B、R^2A、R^2E是H。

此外，對(duì)于式(I)、(Ia)、(Ib)和(II)的化合物，優(yōu)選Q表示H、CN、可選取代的C_2-4炔基、可選取代的C_2-6烯基、可選取代的C_1-4烷基、羥基、可選取代的氧?；R"R"、SR"(其中各個(gè)R"獨(dú)立地是H、可選取代的C_1-4烷基、可選取代的雜環(huán)基、可選取代的雜芳基)、NR"′N(xiāo)R"′(其中各個(gè)R"′獨(dú)立地是H、C_1-3烷基)、可選取代的酰氨基、或鹵素。

在一些實(shí)施方式中，Q獨(dú)立地選自以下基團(tuán)：

H；

CN；

鹵素，優(yōu)選Br或Cl；

烷基，優(yōu)選甲基、乙基、丙基、丁基；

取代烷基，優(yōu)選氨基、氧酰氨基烷基和氧磺酰氨基烷基；

可選取代的烯基，優(yōu)選乙烯基，2-烷基乙烯基、2-氧?；蚁┗?、2-氨?；蚁┗?/p>

可選取代的炔基，優(yōu)選乙炔基、2-烷基乙炔基；

可選取代的氧?；?/p>

OR"，優(yōu)選羥基、甲氧基、乙氧基；

NR"R"，優(yōu)選NH₂、烷氨基、二烷氨基、雜芳氨基、氨烷氨基、羥基烷氨基、烷氧基烷氨基、氧酰基烷氨基、氧酰氨基烷氨基、胍基烷氨基；

SR"，優(yōu)選烷硫基、氨基烷硫基、雜芳硫基、氨烷硫基、羥基烷硫基、烷氧基烷硫基、氧?；榱蚧?、氧酰氨基烷硫基、胍基烷硫基；

肼。

化學(xué)定義

“烷基”是指一價(jià)烷基，其可以是直鏈的或支鏈的，并且優(yōu)選具有1至10個(gè)碳原子或更優(yōu)選1至6個(gè)碳原子，并且甚至更優(yōu)選1至3個(gè)碳原子。這樣的烷基的實(shí)例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、正己基等。

“亞烷基”是指二價(jià)烷基，優(yōu)選具有1至10個(gè)碳原子并且更優(yōu)選1至6個(gè)碳原子，并且甚至更優(yōu)選1至3個(gè)碳原子。這樣的亞烷基的實(shí)例包括亞甲基(-CH₂-)、亞乙基(-CH₂CH₂-)、以及亞丙基異構(gòu)體(例如，-CH₂CH₂CH₂-和-CH(CH₃)CH₂-)等。

“芳基”是指具有單個(gè)環(huán)的不飽和芳族碳環(huán)基(例如苯基)或多個(gè)稠合環(huán)的不飽和芳族碳環(huán)基(例如萘基或蒽基)，優(yōu)選具有6至14個(gè)碳原子。芳基的實(shí)例包括苯基、萘基等。

“亞芳基”是指二價(jià)芳基，其中的芳基是如上所述的。

“芳氧基”是指基團(tuán)芳基-O-，其中的芳基是如上所述的。

“芳烷基”是指–亞烷基-芳基，優(yōu)選在亞烷基部分具有1至10個(gè)碳原子而在芳基部分具有6至10個(gè)碳原子。這樣的芳烷基例如是芐基、苯乙基等。

“芳烷氧基”是指基團(tuán)芳烷基-O-，其中的芳烷基是如上所述的。這樣的芳烷氧基例如是芐氧基等。

“烷氧基”是指基團(tuán)烷基-O-，其中的烷基是如上所述的。實(shí)例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、正己氧基、1,2-二甲基丁氧基等。

“烯基”是指一價(jià)烯基，其可以是直鏈的或支鏈的，并且優(yōu)選具有2至10個(gè)碳原子并且更優(yōu)選2至6個(gè)碳原子，并且具有至少一個(gè)并且優(yōu)選1-2個(gè)碳碳雙鍵。實(shí)例包括乙烯基(-CH＝CH₂)、正丙烯基(-CH₂CH＝CH₂)、異丙烯基(-C(CH₃)＝CH₂)、丁-2-烯基(-CH₂CH＝CHCH₃)等。

“烯氧基”是指基團(tuán)烯基-O-，其中的烯基是如上所述的。

“亞烯基”是指二價(jià)烯基，優(yōu)選具有2至8個(gè)碳原子并且更優(yōu)選2至6個(gè)碳原子。實(shí)例包括亞乙烯基(-CH＝CH-)和亞丙烯基異構(gòu)體(例如-CH₂CH＝CH-和–C(CH₃)＝CH-等。

“炔基”是指這樣的炔基，優(yōu)選具有2至10個(gè)碳原子并且更優(yōu)選2至6個(gè)碳原子，并且具有至少一個(gè)并且優(yōu)選1-2個(gè)碳碳三鍵。炔基的實(shí)例包括乙炔基(-C≡CH)、炔丙基(-CH₂C≡CH)、戊-2-炔基(-CH₂C≡CCH₂-CH₃)等。

“炔氧基”是指基團(tuán)炔基-O-，其中的炔基是如上所述的。

“亞炔基”是指二價(jià)炔基，優(yōu)選具有2至8個(gè)碳原子并且更優(yōu)選2至6個(gè)碳原子。實(shí)例包括亞乙炔基(-C≡C-)、亞丙炔基(-CH₂-C≡C-)等。

“酰基”是指基團(tuán)H-C(O)-、烷基-C(O)-、環(huán)烷基-C(O)-、芳基-C(O)-、雜芳基-C(O)-和雜環(huán)基-C(O)-，其中的烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基是如本文中所描述的。

“氧?；笔侵富鶊F(tuán)HOC(O)-、烷基-OC(O)-、環(huán)烷基-OC(O)-、芳基-OC(O)-、雜芳基-OC(O)-、和雜環(huán)基-OC(O)-，其中的烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基是如本文中所描述的。

“氨基”是指基團(tuán)–NR*R*，其中各個(gè)R*獨(dú)立地是氫、烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、和雜環(huán)基，并且其中烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基中的每一個(gè)是如本文中所描述的。

“氨?；笔侵富鶊F(tuán)–C(O)NR*R*，其中各個(gè)R*獨(dú)立地是氫、烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、和雜環(huán)基，并且其中烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基中的每一個(gè)是如本文中所描述的。

“氨酰基氨基”是指基團(tuán)–NR*C(O)NR*R*，其中各個(gè)R*獨(dú)立地是氫、烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、和雜環(huán)基，并且其中烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基中的每一個(gè)是如本文中所描述的。

“酰氨基”是指基團(tuán)–NR*C(O)R*，其中各個(gè)R*獨(dú)立地是氫、烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基，并且其中烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、和雜環(huán)基中的每一個(gè)是如本文中所描述的。

“酰氧基”是指基團(tuán)-OC(O)-烷基、-OC(O)-芳基、-C(O)O-雜芳基、和-C(O)O-雜環(huán)基，其中烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基是如本文中所描述的。

“氨酰氧基”是指基團(tuán)-OC(O)NR*-烷基、-OC(O)NR*-芳基、-OC(O)NR*-雜芳基、和-OC(O)NR*-雜環(huán)基，其中R*獨(dú)立地是氫、烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基，并且其中烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基中的每一個(gè)是如本文中所描述的。

“氧酰氨基”是指基團(tuán)–NR*C(O)O-烷基、-NR*C(O)O-芳基、-NR*C(O)O-雜芳基、和NR*C(O)O-雜環(huán)基，其中R*獨(dú)立地是氫、烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、和雜環(huán)基，其中烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基中的每一個(gè)是如本文中所描述的。

“氧酰氧基”是指基團(tuán)–OC(O)O-烷基、-O-C(O)O-芳基、-OC(O)O-雜芳基、和–OC(O)O-雜環(huán)基，其中烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、和雜環(huán)基是如本文中所描述的。

“酰亞氨基”是指基團(tuán)–C(NR*)-R*，其中各個(gè)R*獨(dú)立地是氫、烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基，并且其中烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、和雜環(huán)基中的每一個(gè)是如本文中所描述的。

“酰亞氨氧基”是指基團(tuán)–O-C(NR*)-R*，其中各個(gè)R*獨(dú)立地是氫、烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基，并且其中烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、和雜環(huán)基中的每一個(gè)是如本文中所描述的。

“氧酰亞氨基”是指基團(tuán)–C(NR*)-OR*，其中各個(gè)R*獨(dú)立地是氫、烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基，并且其中烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、和雜環(huán)基中的每一個(gè)是如本文中所描述的。

“環(huán)烷基”是指具有單個(gè)環(huán)狀環(huán)或多個(gè)稠合環(huán)的環(huán)狀烷基，優(yōu)選整合(具有)3至8個(gè)碳原子。這樣的環(huán)烷基的實(shí)例包括單環(huán)結(jié)構(gòu)如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)辛基等，或多環(huán)結(jié)構(gòu)如金剛烷基等。

“環(huán)烯基”是指具有單個(gè)環(huán)狀環(huán)和至少一個(gè)內(nèi)部不飽和點(diǎn)的環(huán)狀烯基，優(yōu)選整合(具有)4至8個(gè)碳原子。合適環(huán)烯基的實(shí)例包括例如環(huán)丁-2-烯基、環(huán)戊-3-烯基、環(huán)己-4-烯基、環(huán)辛-3-烯基等。

“鹵代”或“鹵素”是指氟代(氟基)、氯代(氯基)、溴代(溴基)和碘代(碘基)。

“雜芳基”是指一價(jià)芳族雜環(huán)狀基團(tuán)，其滿(mǎn)足用于芳香性的休克爾規(guī)則(Hückel criteria)(即包含4n+2π個(gè)電子)，并且優(yōu)選環(huán)內(nèi)具有2至10個(gè)碳原子和1至4個(gè)選自氧、氮、硒和硫的雜原子(以及包括硫、硒和氮的氧化物)。這樣的雜芳基可以具有單個(gè)環(huán)(例如，吡啶基，吡咯基或它們的N-氧化物，或呋喃基)或多個(gè)稠合環(huán)(例如，吲哚嗪基(indolizinyl)，苯并咪唑基，香豆?；?coumarinyl)，喹啉基，異喹啉基或苯并噻吩基)。

“雜環(huán)基”是指一價(jià)飽和或不飽和基團(tuán)，具有單個(gè)環(huán)或多個(gè)稠合環(huán)，優(yōu)選環(huán)內(nèi)具有1至8個(gè)碳原子和1至4個(gè)選自氮、硫、氧、硒或磷的雜原子。最優(yōu)選的雜原子是氮。

雜環(huán)基和雜芳基的實(shí)例包括但不限于噁唑、吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、噠嗪、吲哚嗪、異吲哚、吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、異喹啉、喹啉、酞嗪、萘基吡啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、菲咯啉、異噻唑、吩嗪、異噁唑、異噻唑、吩噁嗪、吩噻嗪、咪唑啉啶、咪唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚啉、酞亞胺、1,2,3,4-四氫異喹啉、4,5,6,7-四氫苯并[b]噻吩、噻唑、噻二唑、噁二唑、噁三唑、四唑、四氫噻唑、噻吩、苯并[b]噻吩、嗎啉代、哌啶基、吡咯啉、四氫呋喃基、三唑等。

“亞雜芳基”是指二價(jià)雜芳基，其中的雜芳基是如上所描述的。

“亞雜環(huán)基”是指二價(jià)雜環(huán)基，其中的雜環(huán)基是如上所述的。

“硫基(巰基，thio)”是指基團(tuán)H-S-、烷基-S-、環(huán)烷基-S-、芳基-S-、雜芳基-S-、和雜環(huán)基-S-，其中的烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基是如本文中所描述的。

“硫?；?thioacyl)”是指基團(tuán)H-C(S)-、烷基-C(S)-、環(huán)烷基-C(S)-、芳基-C(S)-、雜芳基-C(S)-、和雜環(huán)基-C(S)-，其中的烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基是如本文中所描述的。

“氧硫?；?oxythioacyl)”是指基團(tuán)HO-C(S)-、烷基O-C(S)-、環(huán)烷基O-C(S)-、芳基O-C(S)-、雜芳基O-C(S)-、和雜環(huán)基O-C(S)-，其中的烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基是如本文中所描述的。

“氧硫酰氧基(oxythoacyloxy)”是指基團(tuán)HO-C(S)-O-、烷基O-C(S)-O-、環(huán)烷基O-C(S)-O-、芳基O-C(S)-O-、雜芳基O-C(S)-O-、和雜環(huán)基O-C(S)-O-，其中的烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基是如本文中所描述的。

“磷酰氨基(phosphorylamino)”是指基團(tuán)–NR*-P(O)(R**)(OR***)，其中R*表示H、烷基、環(huán)烷基、烯基、或芳基、R**表示OR***或是羥基或氨基，并且R***是烷基、環(huán)烷基、芳基或芳烷基，其中的烷基、氨基、烯基、芳基、環(huán)烷基、和芳烷基是如本文中所描述的。

“硫酰氧基(thioacyloxy)”是指基團(tuán)H-C(S)-O-、烷基-C(S)-O-、環(huán)烷基-C(S)-O-、芳基-C(S)-O-、雜芳基-C(S)-O-、和雜環(huán)基-C(S)-O-，其中的烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、和雜環(huán)基是如本文中所描述的。

“亞磺?；?sulfinyl)”是指基團(tuán)H-S(O)-、烷基-S(O)-、環(huán)烷基-S(O)-、芳基-S(O)-、雜芳基-S(O)-、和雜環(huán)基-S(O)-，其中的烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基是如本文中所描述的。

“磺?；?sulfonyl)”是指基團(tuán)H-S(O)₂-、alkyl-S(O)₂-、環(huán)烷基-S(O)₂-、芳基-S(O)₂-、雜芳基-S(O)₂-、和雜環(huán)基-S(O)₂-，其中的烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基是如本文中所描述的。

“亞磺酰氨基(sulfinylamino)”是指基團(tuán)H-S(O)-NR*-、烷基-S(O)-NR*-、環(huán)烷基-S(O)-NR*-、芳基-S(O)-NR*-、雜芳基-S(O)-NR*-、和雜環(huán)基-S(O)-NR*-，其中R*獨(dú)立地是氫、烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基，并且其中的烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基中的每一個(gè)是如本文中所描述的。

“磺酰氨基(sulfonylamino)”是指基團(tuán)H-S(O)₂-NR*-、烷基-S(O)₂-NR*-、環(huán)烷基-S(O)₂-NR*-、芳基-S(O)₂-NR*-、雜芳基-S(O)₂-NR*-、和雜環(huán)基-S(O)₂-NR*-，其中R*獨(dú)立地是氫、烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基，并且其中的烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基中的每一個(gè)是如本文中所描述的。

“氧亞磺酰氨基(oxysulfinylamino)”是指基團(tuán)HO-S(O)-NR*-、烷基O-S(O)-NR*-、環(huán)烷基O-S(O)-NR*-、芳基O-S(O)-NR*-、雜芳基O-S(O)-NR*-、和雜環(huán)基O-S(O)-NR*-，其中R*獨(dú)立地是氫、烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基，并且其中的烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基中的每一個(gè)是如本文中所描述的。

“氧磺酰氨基(oxysulfonylamino)”是指基團(tuán)HO-S(O)₂-NR*-、烷基O-S(O)₂-NR*-、環(huán)烷基O-S(O)₂-NR*-、芳基O-S(O)₂-NR*-、雜芳基O-S(O)₂-NR*-、和雜環(huán)基O-S(O)₂-NR*-，其中R*獨(dú)立地是氫、烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基，并且其中的烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基中的每一個(gè)是如本文中所描述的。

“氨硫?；?aminothioacyl)”是指基團(tuán)R*R*N-C(S)-，其中各個(gè)R*獨(dú)立地是氫、烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、和雜環(huán)，并且其中的烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基中每一個(gè)是如本文中所描述的。

“硫酰氨基(thioacylamino)”是指基團(tuán)H-C(S)-NR*-、烷基-C(S)-NR*-、環(huán)烷基-C(S)-NR*-、芳基-C(S)-NR*-、雜芳基-C(S)-NR*-、和雜環(huán)基-C(S)-NR*-，其中R*獨(dú)立地是氫、烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基，并且其中的烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基中的每一個(gè)是如本文中所描述的。

“氨亞磺?；?aminosulfinyl)”是指基團(tuán)R*R*N-S(O)-，其中各個(gè)R*獨(dú)立地是氫、烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、和雜環(huán)，并且其中的烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基中的每一個(gè)是如本文中所描述的。

“氨磺?；?aminosulfonyl)”是指基團(tuán)R*R*N-S(O)₂-，其中各個(gè)R*獨(dú)立地是氫、烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、和雜環(huán)，并且其中的烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基中的每一個(gè)是如本文中所描述的。

在本說(shuō)明書(shū)中，“可選取代的”用來(lái)表示，一個(gè)基團(tuán)可以被或可以不被一個(gè)或多個(gè)選自以下的基團(tuán)進(jìn)一步取代或稠合(以形成稠合多環(huán)基團(tuán))：羥基，?；?，烷基，烷氧基，烯基，烯氧基，炔基，炔氧基，氨基，氨?；蚧?，芳烷基，芳烷氧基，芳基，芳氧基，酰氨基，氰基，鹵素，硝基，磺基，膦?；柞０被?，氧膦基，雜芳基，雜芳氧基，雜環(huán)基，雜環(huán)氧基，氧?；?，肟，肟醚(oxime ether)，腙，-NHC(NH)NH₂，氧酰氨基，氧磺酰氨基，氨酰氧基，三鹵代甲基，三烷基硅烷基，五氟乙基，三氟甲氧基，二氟甲氧基，三氟甲硫基，三氟乙烯基，一-和二-烷氨基，一-和二-(取代烷基)氨基，一-和二-芳氨基，一-和二-雜芳氨基，一-和二-雜環(huán)氨基，以及具有選自烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基的不同取代基的不對(duì)稱(chēng)二-取代胺等。

可選取代的氨基也可以包括氨基酸和肽殘基。

式I、Ia、Ib或II的TPI化合物可以通過(guò)已知的方法制備，包括在WO 02/060872和WO 07/087684中披露的那些方法，將它們通過(guò)引用結(jié)合于本文中。

在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的聯(lián)合療法中使用的TPI是下式(III)的化合物或其鹽、溶劑化物或前藥：

式(III)的化合物(2-甲基-7-羥基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲?；?-6-甲氧基苯并呋喃)可以通過(guò)在PCT/AU2007/000101(WO 07/087684)中描述的合成方法制備。

已經(jīng)觀察到式I、Ia、Ib、II或III的化合物是有效的微管蛋白聚合抑制劑(TPI)。式I、Ia、Ib、II或III的化合物的一個(gè)重要方面是特定C-6連同C-7取代基連同C-2Q-基團(tuán)(尤其是C-2甲基)的組合，當(dāng)相比于其他結(jié)構(gòu)相關(guān)的TPI化合物時(shí)，這似乎賦予更大的效力和選擇性。在這些化合物中，當(dāng)用VDA進(jìn)攻時(shí)，選擇性不是簡(jiǎn)單地依賴(lài)于腫瘤血管系統(tǒng)朝向瓦解的趨向，而且依賴(lài)于VDA在腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞和正常內(nèi)皮細(xì)胞之間進(jìn)行區(qū)分的能力。在健康組織中存在的正常內(nèi)皮細(xì)胞處于“靜止(quiescent)”狀態(tài)，而腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞處于“活化(activated)”狀態(tài)。大多數(shù)VDA在這兩種狀態(tài)之間不進(jìn)行區(qū)分，例如考布他汀A4(CA4)對(duì)于靜止和活化的內(nèi)皮細(xì)胞是等效的。然而，式I、Ia、Ib、II并且尤其是III的化合物相對(duì)于正常內(nèi)皮細(xì)胞(靜止的)對(duì)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞(活化的)表現(xiàn)出選擇性。

應(yīng)理解，本發(fā)明的TPI和式I、Ia、Ib、II或III的化合物可以作為它們的藥用鹽給予主體。合適的藥用鹽包括但不限于藥學(xué)上可接受的無(wú)機(jī)酸如鹽酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、氨基磺酸(sulfamic acid)和氫溴酸的鹽，或藥學(xué)上可接受的有機(jī)酸如乙酸、丙酸、丁酸、酒石酸、馬來(lái)酸、羥基馬來(lái)酸、富馬酸、馬來(lái)酸、檸檬酸、乳酸、粘酸、葡糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯基乙酸、甲磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、水楊酸、氨基苯磺酸、天冬氨酸、谷氨酸、依他酸、硬脂酸、棕櫚酸、油酸、月桂酸、泛酸、單寧酸、抗壞血酸和戊酸的鹽。

堿鹽包括但不限于與藥學(xué)上可接受的陽(yáng)離子如鈉、鉀、鋰、鈣、鎂、銨和烷基銨形成的鹽。尤其是，本發(fā)明在其范圍內(nèi)包括陽(yáng)離子鹽例如磷酸根的鈉或鉀鹽、或烷基酯(例如甲基，乙基)。

還應(yīng)理解，作為本發(fā)明的TPI或式I、Ia、Ib、II或III的化合物的前藥的任何化合物也屬于本發(fā)明的范圍和精神。術(shù)語(yǔ)“前藥”以其最寬泛含義使用并且涵蓋體內(nèi)轉(zhuǎn)化為本發(fā)明的化合物(例如式I、Ia、Ib、II或III的化合物)的那些衍生物。這樣的衍生物對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員容易發(fā)生，并且包括例如，其中游離羥基(例如在C-7位置或R^1D處)轉(zhuǎn)化成酯如乙酸酯或磷酸酯的化合物，或其中游離氨基(例如在C-7位置或R^1D處)轉(zhuǎn)化成酰胺(例如α-氨基酸酰胺)的化合物。用于酯化例如乙?；@些化合物的程序步驟在本領(lǐng)域是熟知的并且可以包括在合適催化劑或堿存在下用適當(dāng)羧酸、酸酐或氯化物處理該化合物。特別優(yōu)選的前藥是磷酸二鈉酯。本發(fā)明的化合物的磷酸二鈉酯(尤其是式III的化合物的C-7磷酸二鈉酯)可以用于增大這些化合物的溶解性。這例如將可以允許該化合物在良性賦形劑如鹽水中遞送。該磷酸二鈉酯可以依據(jù)在Pettit,G.R.,et al,Anticancer Drug Des.,1995,10,299中描述的方法進(jìn)行制備。總體上描述前藥(及其制備)的其他文章包括：Design of Prodrugs,1985,H.Bundgaard(Elsevier)；The Practice of Medicinal Chemistry,1996,Camille G.Wermuth et al.,Chapter 31(Academic Press)；以及A Textbook of Drug Design and Development,1991,Bundgaard et al.,Chapter 5,(Harwood Academic Publishers)。

式I、Ia、Ib、II和III(或其鹽或前藥)可以是作為游離化合物或作為溶劑化物(例如水化物)的結(jié)晶形式，并且預(yù)計(jì)這兩種形式都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。溶劑化的方法在本領(lǐng)域中通常是已知的。

組合伴侶(b)：mTOR抑制劑

mTOR是一種細(xì)胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸激酶，主要涉及翻譯起始的控制。PI3K/Akt-依賴(lài)性磷酸化通過(guò)薯球蛋白(tuberin)(TSC1/TSC2復(fù)合物的蛋白產(chǎn)物)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致mTOR活化。mTOR隨后磷酸化下游靶標(biāo)，引起蛋白翻譯的起始。

因此，抑制mTOR的活化(引起其下游靶標(biāo)的下調(diào))的任何試劑被本文中所使用的“mTOR抑制劑”的含義所涵蓋。

合適mTOR抑制劑包括：

BEZ235(NVP-BEZ235)，地磷莫司(deforolimus)(AP 23573,MK-8669)，PI-103，雷帕霉素(rapamycin)(西羅莫司(Sirolimus)，雷帕鳴(Rapamune))，替西羅莫司(temsirolimus)(Toricel，CCI-779)，依維莫司(everolimus)(Afinitor，RAD001，Certican)，ABT 578，SAR 543和AP 23841。

任何mTOR組合伴侶的適合性經(jīng)常取決于遞送模式。相比于雷帕霉素，替西羅莫司和依維莫司(其都是雷帕霉素的類(lèi)似物)已被開(kāi)發(fā)具有優(yōu)異的溶解性能，使得它們適用于靜脈內(nèi)給藥(替西羅莫司)和口服給藥(依維莫司)。

增生性疾病

如在本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“增生性疾病”廣泛地涵蓋任何腫瘤病，包括潛在惡性(癌前)或惡性(癌性)的那些。因此該術(shù)語(yǔ)涵蓋腫瘤的治療。

相應(yīng)地，術(shù)語(yǔ)“腫瘤”通常用來(lái)定義任何惡性癌性的或癌前的細(xì)胞生長(zhǎng)，并且可以包括白血病和惡性腫瘤如黑素瘤、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌、皮膚癌、乳腺癌、胰腺癌、咽喉癌、腦癌、前列腺癌、CNS癌和腎癌，以及其他癌癥。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述組合可以用于治療腫瘤并且尤其是用于以下腫瘤：乳腺癌、腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(brain glioblastoma)、結(jié)直腸腺癌、肺癌、卵巢腺癌、胰腺癌、前列腺癌、腎細(xì)胞腺癌、以及咽喉鱗狀細(xì)胞癌。

在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供一種(a)和(b)的組合，用于治療腎癌，并且尤其用于治療轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌。

(a)和(b)的組合

不希望受限于任何特定理論，認(rèn)為，伴侶(a)和(b)聯(lián)合起作用以更好地實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞死亡。如圖1中所示的，假定TPI在高度血管分布腫瘤中誘導(dǎo)缺氧/細(xì)胞毒性負(fù)荷，同時(shí)mTOR抑制伴隨地抑制HIF1a驅(qū)動(dòng)的血管形成/存活響應(yīng)，從而產(chǎn)生有益的加合或協(xié)同效應(yīng)。

因此，本發(fā)明提供一種治療腫瘤的方法，包括聯(lián)合有效量的(b)mTOR抑制劑給予有效量的(a)微管蛋白靶向劑(tubulin targeting agent)。

在實(shí)施方式中，以下組合是特別優(yōu)選的：

在以上實(shí)施方式中，優(yōu)選地，前藥形式是式III的化合物的C-7磷酸二鈉酯。

“有效量”用來(lái)表示，當(dāng)給予需要這樣的治療的哺乳動(dòng)物(尤其是人)時(shí)，各個(gè)組合伴侶足以實(shí)現(xiàn)對(duì)于具體增生性疾病的治療的量。因此，例如，組合伴侶(a)的化合物(或其藥用鹽、溶劑化物或前藥)的治療有效量是足以協(xié)同增強(qiáng)或加強(qiáng)mTOR抑制劑的活性(反之亦然)以使靶向的疾病被減少或減輕的量。

這可以包括至少部分地達(dá)到期望的效果，或延遲所治療的具體疾病(例如腫瘤)的發(fā)作、或抑制其進(jìn)展、或完全地?cái)r截或反轉(zhuǎn)其發(fā)作或進(jìn)展。

患有增生性疾病的患者的臨床研究如開(kāi)放標(biāo)簽(open-label)、劑量遞增(dose escalation)研究可以包括提高組合的活性成分的協(xié)同效應(yīng)的研究。有益和/或協(xié)同效應(yīng)可以通過(guò)這些研究的結(jié)果直接確定，這同樣是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些研究也能夠比較利用該活性成分的單一療法與本發(fā)明的組合的效果。優(yōu)選地，組合伴侶(a)的劑量可以逐步升高直至達(dá)到最大耐受量(MTD)，而試劑(b)作為固定劑量給予。可替換地，組合伴侶(a)以固定劑量給予而試劑(b)的劑量逐步升高。每個(gè)患者可以每天或間歇地接受試劑(a)的劑量。治療的效力可以每9周通過(guò)評(píng)價(jià)癥狀評(píng)分例如在6、12、18或24周之后在這樣的研究中確定。

本發(fā)明的藥物組合的給予可以不僅導(dǎo)致有益效果，例如加合或協(xié)同治療效應(yīng)，例如對(duì)于癥狀的減輕、延遲進(jìn)展或抑制，而且導(dǎo)致進(jìn)一步的令人驚訝的有益效果。這樣的其他效果可以包括，相比于僅施用在本發(fā)明的組合中使用的藥學(xué)活性成分之一的單一療法，較少的副作用、改善的生活質(zhì)量或降低的發(fā)病率。

本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的益處在于，能夠使用所述組合的活性成分的更低劑量。劑量不僅需要更小而且也可以更低頻率施用，這可以減少副作用的發(fā)生率或嚴(yán)重性。

術(shù)語(yǔ)“給予(給藥)”涉及將組合伴侶共給予(co-administration)單個(gè)患者，并且計(jì)劃包括治療方案，其中這些試劑不必需通過(guò)相同給藥途徑或同時(shí)進(jìn)行給予。相應(yīng)地，組合伴侶(a)和(b)可以在一個(gè)組合的單位劑型或在兩個(gè)單獨(dú)的單位劑型中一起、依次或單獨(dú)地進(jìn)行給予。單位劑型也可以是固定的組合如藥物組合物，其包含伴侶(a)(或其鹽、溶劑化物或前藥)和伴侶(b)二者。

尤其是，本發(fā)明的組合的組合伴侶中的每一個(gè)的治療有效量可以同時(shí)或依次以及以任何順序進(jìn)行給予，并且這些成分可以單獨(dú)地或作為固定組合進(jìn)行給予。例如，根據(jù)本發(fā)明的預(yù)防或治療增生性疾病的方法可以包括：(i)給予游離形式或藥用鹽形式的伴侶(a)；以及(ii)同時(shí)或以任何順序依次地給予游離形式或藥用鹽形式的伴侶(b)，其中以聯(lián)合治療有效量，優(yōu)選以協(xié)同有效量，例如以對(duì)應(yīng)于本文中所描述的量的每天或間歇?jiǎng)┝?。本發(fā)明的組合的單個(gè)組合伴侶，可以以分開(kāi)或單個(gè)組合形式，在治療過(guò)程期間的不同時(shí)間點(diǎn)單獨(dú)地或同時(shí)地進(jìn)行給予。此外，術(shù)語(yǔ)給予還涵蓋使用在體內(nèi)同樣轉(zhuǎn)化成所述組合伴侶的組合伴侶的前藥。因此，本發(fā)明應(yīng)理解為包括所有這樣的同時(shí)或交替治療方案，并且術(shù)語(yǔ)“給予”應(yīng)被相應(yīng)地進(jìn)行解釋。

同樣，應(yīng)當(dāng)理解，組合伴侶可以作為用于治療增生性疾病(例如腫瘤治療)中的“多部分的試劑盒(kit of parts)”提供。該試劑盒可以包括其中組合伴侶單獨(dú)地提供用于共給予的包裝與具體治療使用的說(shuō)明書(shū)。

在本發(fā)明的組合中采用的組合伴侶的每一個(gè)的有效劑量可以根據(jù)所采用的具體化合物或藥物組合物、給予模式、待治療的病癥、待治療的病癥的嚴(yán)重度而變化。因此，本發(fā)明的組合的劑量方案依據(jù)各種各樣的因素進(jìn)行選擇，包括給予途徑以及患者的腎和肝功能。普通技能的醫(yī)生能夠容易地確定和開(kāi)處方對(duì)于減輕、對(duì)抗或停止該病癥進(jìn)展所需的單個(gè)活性成分的有效量。

當(dāng)然，組合伴侶(a)和(b)的日劑量將依據(jù)各種各樣的因素而變化，例如所選的化合物、待治療的具體病癥以及期望的效果。然而，一般地，作為單個(gè)劑量或分開(kāi)的劑量，在以約0.05至20mg/kg/天，特別是1至20mg/kg/天，例如0.4至16mg/kg/天的日劑量率給予試劑(a)后獲得滿(mǎn)意的結(jié)果。組合伴侶(a)和伴侶(b)可以通過(guò)任何常規(guī)途徑，尤其是腸內(nèi)地，例如口服地，例如以片劑、膠囊、口服液，或非腸道地，例如以注射液或懸液形式進(jìn)行給予。合適的用于口服給予的單位劑型包括例如約0.02至50mg活性成分，通常0.1至30mg以及2至25mg、4至20mg的組合伴侶(a)或(b)，連同用于其的一種或多種藥用稀釋劑或載體。

組合伴侶(b)可以以0.5至1000mg的日劑量范圍給予人。用于口服給予的合適單位劑型包括約0.1至500mg活性成分，優(yōu)選5-50mg/天，更優(yōu)選5-20mg/天，并且更優(yōu)選約7-12mg/天，連同用于其的一種或多種藥用稀釋劑或載體。用于遞送已知的mTOR抑制劑的方法和給予方案對(duì)于醫(yī)師是已知的。

例如，給予方案可以包括在mTOR抑制劑作為口服日劑量(例如約100mg/天)給予的情況下，在(21天周期的)第1天和第8天通過(guò)靜脈內(nèi)(I.V.)以指定劑量水平添加TPI(例如式III的化合物)。在這個(gè)實(shí)施方式中，式(III)的化合物可以以4至16mg/m²的水平給藥。

本發(fā)明的藥物組合的給予不僅導(dǎo)致有益效果，例如加合或協(xié)同治療效應(yīng)，例如對(duì)于抑制腫瘤的生長(zhǎng)，而且導(dǎo)致進(jìn)一步令人驚訝的有益效果，例如更少的副作用、改善的生活質(zhì)量或降低的發(fā)病率(相比于僅施用在本發(fā)明的組合中使用的藥學(xué)活性成分中的一種的單一療法)。

一個(gè)進(jìn)一步的益處在于，可以使用低劑量的本發(fā)明的組合的活性成分，例如，劑量不僅經(jīng)常需要更小而且也以更低頻率施用，或者可以使用以便消除副作用發(fā)生率。這依據(jù)待治療患者的期望和要求。

伴侶(a)和(b)的組合可以獨(dú)立地或一起地與一種或多種藥用載體和可選地一種或多種其他常規(guī)藥學(xué)佐劑進(jìn)行組合，并腸內(nèi)地，例如口服地以片劑、膠囊、囊片等形式給予，或者非腸道地，例如腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)地以無(wú)菌注射液或懸液形式給予。腸內(nèi)和非腸道組合物可以通過(guò)常規(guī)方式制備。

根據(jù)本發(fā)明，用于組合伴侶(a)和伴侶(b)的分開(kāi)給予或用于以固定組合(即組合物)給予的藥物組合物可以以本領(lǐng)域已知的方式制備，并且是適于腸內(nèi)，如口服或直腸以及非腸道給予哺乳動(dòng)物(溫血?jiǎng)游?，尤其是人的那些，包括單獨(dú)的(例如如上所指出的)或聯(lián)合一種或多種藥用載體或稀釋劑，尤其是適于腸內(nèi)或非腸道施用的治療有效量的至少一種藥理學(xué)活性組合伴侶。

合適藥物組合物包含，例如約0.1％至約99.9％，優(yōu)選約1％至約60％的活性成分。

組合物可以包含任何合適載體、稀釋劑或賦形劑。這些包括所有常規(guī)的溶劑、分散介質(zhì)、填料、固體載體、包衣、抗真菌劑和抗菌劑、透皮劑、表面活性劑、等滲劑和吸附劑等。應(yīng)當(dāng)了解，本發(fā)明的組合物也可以包括其他補(bǔ)充性生理活性試劑。

載體必須在與組合物的其他成分相容且對(duì)于主體不是有害的意義上是藥學(xué)上“可接受的”。組合物包括適于口服、直腸、鼻道、局部(包括含服和舌下)、陰道或非腸道(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮內(nèi))給予的那些。組合物可以方便地以單位劑型提供并且可以通過(guò)制藥領(lǐng)域熟知的任何方法制備。這樣的方法包括使活性成分與載體(其構(gòu)成一種或多種助劑)聯(lián)合的步驟。一般地，組合物通過(guò)均勻地并且緊密地使活性成分與液體載體或細(xì)分的固體載體或這二者聯(lián)合，然后如果需要使該產(chǎn)物成型，而制備。

適用于口服給予的本發(fā)明的組合物可以作為離散單位如膠囊、香囊或片劑(各自包含預(yù)定量的活性成分)、作為粉末或顆粒、作為在水性或非水性液體中的溶液或懸液、或作為水包油液體乳液或油包水液體乳液提供。活性成分也可以作為大藥丸、藥糖劑(electuary)或糊劑提供。

片劑可以通過(guò)壓制或模制(可選地與一種或多種助劑)來(lái)制備。壓制的片劑可以通過(guò)在合適機(jī)器中將活性成分壓制成自由流動(dòng)形式如粉末或顆粒進(jìn)行制備，可選地混合粘結(jié)劑(例如，惰性稀釋劑)、防腐崩解劑(例如羥基乙酸淀粉鈉，交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮，交聯(lián)羧甲基纖維素鈉)表面活性劑或分散劑。模制的片劑可以通過(guò)在合適機(jī)器中模制用惰性液體稀釋劑增濕的粉狀化合物的混合物而制備。片劑可以可選地被涂覆或劃紋(scored)，并且可以利用例如各種比例的羥丙基甲基纖維素(以提供期望的釋放分布)進(jìn)行配制，以提供其內(nèi)的活性成分的緩慢或受控釋放。片劑可以可選地提供有腸溶衣，以提供在不同于胃的內(nèi)臟部位中的釋放。

適用于在嘴中局部給予的組合物包括包含在增味基質(zhì)(通常為蔗糖和阿拉伯樹(shù)膠或黃蓍膠)中的活性劑的錠劑；包含在惰性基質(zhì)如明膠和甘油、或蔗糖和阿拉伯樹(shù)膠中的活性成分的軟錠劑；以及包含在合適液體載體中的活性成分的漱口水。

適用于局部給予至皮膚的組合物可以包含溶解或懸浮在任何合適載體或基質(zhì)中的化合物并且可以為洗劑、凝膠、霜?jiǎng)?、糊劑、軟膏等形式。合適載體包括礦物油、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、乳化蠟、山梨醇酐單硬脂酸酯60、鯨蠟酯蠟、鯨蠟硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。皮膚貼也可以用來(lái)給予本發(fā)明的化合物。

用于直腸給予的組合物可以作為栓劑提供，具有合適基質(zhì)，包括例如可可油、甘油、明膠或聚乙二醇。

適用于陰道給予的組合物可以作為陰道栓劑、棉球、霜?jiǎng)⒛z、糊劑、泡沫劑或噴霧制劑(除了活性成分外，還包含如本領(lǐng)域已知為合適的那些載體)提供。

適用于非腸道給予的組合物包括水性和非水等滲無(wú)菌注射液，其可以包含抗氧化劑、緩沖劑、殺菌劑和溶質(zhì)(其使該組合物與預(yù)計(jì)受體的血液等滲)；以及水性和非水無(wú)菌懸液，其可以包括懸浮劑和增稠劑。組合物可以提供在單位劑量或多劑量密封容器例如安剖瓶和小瓶中，并且可以?xún)?chǔ)存在冷凍干燥(凍干)條件下，僅要求在即將使用之前添加無(wú)菌液體載體例如水以進(jìn)行注射。即時(shí)注射液和懸液可以由之前描述的各種無(wú)菌粉末、顆粒和片劑制備。

優(yōu)選的單位劑量組合物是包含活性成分的日劑量或單位、日子劑量(如本文中上述的)、或其合適部分的那些。

應(yīng)當(dāng)理解，除了以上特別提及的活性成分外，本發(fā)明的組合物可以包括對(duì)于所討論的組合物類(lèi)型的本領(lǐng)域中常規(guī)的其他試劑，例如適用于口服給予的那些可以包括這樣的進(jìn)一步試劑，如粘結(jié)劑、增甜劑、增稠劑、增味劑、崩解劑、涂覆劑、防腐劑、潤(rùn)滑劑和/或延時(shí)劑。合適增甜劑包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴特(aspartame)或糖精。合適崩解劑包括玉米淀粉、甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮、黃原膠(xanthan gum)、膨潤(rùn)土(bentonite)、褐藻酸或瓊脂。合適增味劑包括薄荷油(peppermint oil)、冬青(wintergreen)的油、草莓、桔子或木霉(raspberry)增味劑。合適涂覆劑包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它們的酯的聚合物或共聚物、石蠟、脂肪醇、玉米朊(zein)、蟲(chóng)膠(shellac)或谷朊(gluten)。合適防腐劑包括苯甲酸鈉、維生素E、α-生育酚、抗壞血酸、羥苯甲酸甲酯、羥苯甲酸丙酯或亞硫酸氫鈉。合適潤(rùn)滑劑包括硬脂酸鎂、硬脂酸、油酸鈉、氯化鈉或滑石。合適延時(shí)劑包括單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本文中描述的發(fā)明可以進(jìn)行不同于具體描述的那些的變形和改變。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明包括落入所述精神和范圍內(nèi)的所有這樣的變形和改變。本發(fā)明還包括單個(gè)地或集中地在本說(shuō)明書(shū)中提及或指出的所有步驟、特征、組合物或化合物，以及所述步驟或特征中的任何兩個(gè)或更多個(gè)的任意和所有組合。

現(xiàn)在將參考以下實(shí)例來(lái)描述本發(fā)明的某些實(shí)施方式，這些實(shí)例僅用于舉例說(shuō)明的目的而不用于限制上文描述的一般性的范圍。

實(shí)例

合成方案

2-溴-7-乙酰氧基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-6-甲氧基苯并呋喃的制備。

步驟1：2-叔丁基二甲基硅烷基-3-(叔丁基二甲基硅烷基氧亞甲基)-6-甲氧基-7-異丙氧基苯并呋喃(Larock偶聯(lián))。

在100℃下，將2-異丙氧基-3-甲氧基-5-碘苯酚(4.41mmol)、1-(叔丁基二甲基硅烷基)-3-(叔丁基二甲基硅烷基氧)丙炔(1.5g，5.28mmol)、氯化鋰(189mg，4.45mmol)和碳酸鈉(2.34g，22.08mmol)在干燥二甲基甲酰胺(5mL)中的懸液通過(guò)抽真空，然后回填氮?dú)舛パ?。加入醋酸鈀(135mg，0.60mmol)并用氮?dú)馐狗磻?yīng)器脫氣兩次。然后將反應(yīng)混合物在這個(gè)溫度下攪拌4小時(shí)(tlc(薄層色譜))并通過(guò)在真空蒸餾而除去溶劑。將殘留物溶解在乙酸乙酯(75mL)中，良好攪拌，過(guò)濾并用三乙胺(5mL)處理。在硅膠(10g)上濃縮該溶液并通過(guò)快速層析(硅膠，洗脫劑＝己烷/二乙醚/三乙胺；95:5:1％)純化而獲得黃色油狀物的標(biāo)題化合物(1.45g，96％)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.24(d,1H,J＝8.45Hz)，6.88(d,1H,J＝8.47Hz)，4.80(s,2H,CH₂)，4.73(m,1H)，3.88(s,3H,OMe)，1.36(d,6H,J＝6.17Hz)，0.94(s,9H)，0.92(s,9H)，0.35(s,6H)，0.12(s,6H)。

步驟2：2-叔丁基二甲基硅烷基-3-甲?；?6-甲氧基-7-異丙氧基苯并呋喃

向2-叔丁基二甲基硅烷基-3-(叔丁基二甲基硅烷基氧亞甲基)-6-甲氧基-7-異丙氧基苯并呋喃(2.69mmol)在甲醇(100mL)中的溶液中加入濃鹽酸(200μL)并攪拌反應(yīng)30分鐘(通過(guò)tlc監(jiān)控)，用三乙胺(2mL)淬滅并且溶劑通過(guò)在真空下蒸餾而除去。將殘留物溶解在二氯甲烷(20mL)中，用水(10mL)洗滌，在硫酸鎂上干燥，在真空下濃縮并用甲苯(20mL)共蒸餾。將粗產(chǎn)物溶解在干燥二氯甲烷(4mL)中并加入到科林試劑(Collin′s reagent)(三氧化鉻(1.01g)，吡啶(1.65mL)，在干燥二氯甲烷(30mL)中)的攪拌溶液中。攪拌該懸液10分鐘，過(guò)濾并用二乙醚(20mL)洗滌殘留物。濾液在二氧化硅(10g)上濃縮并通過(guò)快速層析(硅膠，洗脫劑＝己烷/二乙醚/三乙胺(90:9:1))純化而獲得淺黃色油狀物的標(biāo)題化合物(503mg，48％)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ10.25(s,1H,CHO)，7.79(d,1H,J＝8.45Hz)，6.98(d,1H,J＝8.46Hz)，4.65(m,1H)，3.89(s,3H,OMe)，1.35(d,6H,J＝6.17Hz)，0.97(s,9H)，0.45(s,6H)。

步驟3：2-叔丁基二甲基硅烷基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲?；?-6-甲氧基-7-異丙氧基苯并呋喃

在氮?dú)庀?，?78℃向3,4,5-三甲氧基碘苯(377mg，1.27mmol)在干燥四氫呋喃(1mL)中的攪拌溶液中加入正丁基鋰(795μL，1.59mmol，在環(huán)己烷中的2M溶液)，并將反應(yīng)混合物在該溫度下攪拌40分鐘。在這個(gè)時(shí)間之后，經(jīng)由注射器吸液管逐滴地向反應(yīng)中加入2-叔丁基二甲基硅烷基-3-甲?；?6-甲氧基-7-異丙氧基苯并呋喃(1.07mmol)在干燥四氫呋喃(1mL)中的溶液。反應(yīng)混合物在-60℃下攪拌20分鐘，然后允許升溫至0℃，攪拌10分鐘，用飽和氯化銨溶液(2mL)淬滅并用乙酸乙酯(20mL)稀釋。有機(jī)層用水(10mL)洗滌，在硫酸鎂上干燥并在真空下除去溶劑而獲得與甲苯共蒸餾的殘留物。粗產(chǎn)物(908mg)溶解在干燥四氫呋喃(10mL)中并加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(900mg，1.59mmol)進(jìn)行處理。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌16小時(shí)(通過(guò)tlc監(jiān)控)，然后加載到二氧化硅(10g)上并通過(guò)快速層析(硅膠，洗脫劑＝己烷/二乙醚/三乙胺，90:9:1)純化而獲得淺黃色油狀物的標(biāo)題化合物(498mg，69％)；H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.14(s,2H,苯甲?；鵋s)，6.81(d,1H,J＝8.64Hz)，6.77(d,1H,J＝8.64Hz)4.74(m,1H)，3.93(s,3H,OMe)，3.86(s,3H,OMe)，3.78(s,6H,2x OMe)，1.39(d,6H,J＝6.14Hz)，1.01(s,9H)，0.26(s,6H)。

步驟4：2-(叔丁基二甲基硅烷基氧)-7-乙酰氧基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲?；?-6-甲氧基苯并呋喃

在氮?dú)庀拢谑覝叵?，?-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)-7-異丙氧基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲?；?-6-甲氧基-苯并呋喃(160mg，0.31mmol)在干燥DCM(2mL)中的溶液中加入固體三氯化鋁(83mg，0.62mmol)并將反應(yīng)混合物攪拌15分鐘(通過(guò)tlc監(jiān)控)。反應(yīng)用氯化銨的飽和溶液淬滅，用二氯甲烷萃取并在硫酸鎂上干燥。通過(guò)蒸餾除去溶劑并且通過(guò)水與甲苯的共沸除去而干燥殘留物。粗產(chǎn)物溶解在吡啶(2mL)中，加入乙酸酐(1mL)并在室溫下攪拌反應(yīng)混合物2小時(shí)。溶劑在真空下蒸餾并將殘留物加載到硅膠(1g)上并通過(guò)柱層析(硅膠，洗脫劑，己烷:二乙醚；80:20)純化(134mg，84％)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.14(s,2H,苯甲酰基Hs)，6.98(d,1H,J＝8.72Hz)，6.85(d,1H,J＝8.72Hz)，3.93(s,3H,OMe)，3.86(s,3H,OMe)，3.80(s,6H,2x OMe)，2.41(s,3H)，0.99(s,9H)，0.25(s,6H)。

步驟5：2-溴-7-乙酰氧基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲?；?-6-甲氧基苯并呋喃

在氮?dú)庀拢谑覝叵?，?-叔丁基二甲基硅烷基-7-乙酰氧基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲?；?-6-甲氧基苯并呋喃(120mg，0.44mmol)在1,2-二氯乙烷(1mL)中的溶液中逐滴加入溴(12μl，0.44mmol)并將反應(yīng)混合物在這個(gè)溫度下攪拌10分鐘。在這個(gè)時(shí)間之后，用飽和硫代硫酸鈉溶液淬滅反應(yīng)，用乙酸乙酯(20mL)萃取，在硫酸鎂上干燥，并通過(guò)在真空下蒸餾而除去溶劑。粗產(chǎn)物通過(guò)硅膠柱層析(洗脫劑＝己烷:二乙醚；8:2-7:3)純化而獲得無(wú)色結(jié)晶固體的標(biāo)題化合物(91mg，81％)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.40(d,1H,J＝8.70Hz)，7.14(s,2H,苯甲?；?Hs)，6.98(d,1H,J＝8.75Hz)，3.94(s,3H,OMe)，3.89(s,3H,OMe)，3.86(s,6H,2x OMe)，2.43(s,3H)；¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ187.95(CO)，167.71,152.75,149.54,147.49,142.59,131.92,131.80,123.91,121.84,119.89,117.72,109.89,106.92,60.69,56.61,56.00,20.09。

實(shí)例1

2-甲基-7-羥基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-6-甲氧基苯并呋喃的制備

制備A

在90℃下，向2-溴-7-乙酰氧基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲?；?-6-甲氧基苯并呋喃(20mg，0.042mmol)、甲基-硼酸(40mg，0.67mmol)在1,4-二噁烷(2mL)中的攪拌溶液中加入四-三苯基膦鈀(11mg，0.01mmol)，隨后加入在蒸餾水(0.5mL)中的碳酸氫鈉溶液。反應(yīng)混合物在5分鐘之后變紅。在2小時(shí)(tlc)之后，使反應(yīng)混合物達(dá)到室溫并加入飽和氯化銨(2mL)并用二氯甲烷(20mL)稀釋。分離有機(jī)層并用水洗滌，在硫酸鎂上干燥并通過(guò)在真空下蒸餾除去溶劑。殘留物通過(guò)PTLC(洗脫劑＝二氯甲烷/甲醇，1:1)純化而獲得絨毛狀白色固體(fluffy white solid)的標(biāo)題化合物(反應(yīng)期間分解的乙酸酯)；(3mg，19％)。

制備B(Negishi偶聯(lián))

在0℃下，向在干燥THF(1.5mL)中的溴化鋅(592mg，2.63mmol)的攪拌溶液中加入甲基鋰(在二乙醚中的1.6M溶液，2.6mL，4.15mmol)的溶液，并將反應(yīng)混合物攪拌2小時(shí)。加入固體2-溴-7-乙酰氧基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲?；?-6-甲氧基-苯并呋喃(300mg，0.63mmol)并在真空下除去醚，并向剩余懸液中加入二氯二(三苯基膦)鈀催化劑(21mg)和催化量的碘化銅(I)。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌36小時(shí)(通過(guò)tlc監(jiān)控)，用飽和氯化銨溶液淬滅并用二氯甲烷(10mL)萃取，在硫酸鎂上干燥并在真空下蒸餾溶劑，并且產(chǎn)物通過(guò)硅膠柱(洗脫劑＝己烷/乙酸乙酯；8:2)純化。產(chǎn)物在甲醇(106mg，46％)中結(jié)晶；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.09(s,2H,苯甲?；鵋s)，6.93(d,1H,J＝8.54Hz)，6.83(d,1H,J＝8.56Hz)，5.70(bs,1H,OH)，3.93(s,3H,OMe)，3.92(s,3H,OMe)，3.83(s,6H,2x OMe)，2.54(s,3H,2-Me)。

實(shí)例2

6-甲氧基-2-甲基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲?；?苯并呋喃-7-基磷酸二鈉的制備

步驟1：6-甲氧基-2-甲基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)苯并呋喃-7-基磷酸二芐基酯：

在氮?dú)夥障?，?℃，向0.081g(0.22mmol)的(7-羥基-6-甲氧基-2-甲基苯并呋喃-3-基)(3,4,5-三甲氧基苯基)甲酮、0.086g(0.261mmol)的四溴化碳和0.063ml(0.283mmol)的亞磷酸二芐酯在2.5ml無(wú)水乙腈中的混合物中，逐滴加入0.046ml的無(wú)水三乙胺。所得混合物在室溫下攪拌2h，然后用乙酸乙酯稀釋至20ml，用鹽水洗滌，在無(wú)水硫酸鎂上干燥，過(guò)濾并在減壓下蒸發(fā)至干。殘留物通過(guò)快速柱層析(二氯甲烷/乙酸乙酯，9:1)純化而獲得無(wú)色泡沫狀的標(biāo)題化合物(0.13g，94％)；¹H NMR(CDCl₃)δ2.42(s,3H,Me-2)；3.83(s,1H,OMe)；3.93(s,3H,OMe)；5.33(m,4H,CH₂Ph)；6.89(d,CH芳香,J＝8.7Hz)；7.21(dd,1H,CH芳香,J＝8.72Hz；J＝1.2Hz)；7.08(s,2H,CH芳香)；7.29–7.43(m,10H,CH芳香)。

步驟2：6-甲氧基-2-甲基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲?；?苯并呋喃-7-基磷酸二鈉：

在氮?dú)夥障?，在–5℃，向0.122g(0.193mmol)來(lái)自步驟1的產(chǎn)物在1ml無(wú)水乙腈中的攪拌溶液中，加入0.075ml(0.58mmol)的溴三甲基硅烷。所得混合物在0℃下攪拌1h，然后真空下蒸發(fā)至干。殘留物用無(wú)水甲醇稀釋至5ml并通過(guò)加入甲醇鈉使該溶液的pH達(dá)到約10。在減壓下蒸發(fā)所得混合物之后，固體殘留物用無(wú)水異丙醇(4x1.5ml)和無(wú)水乙醇(3x1.5ml)洗滌，并在真空下干燥而獲得0.062g(65％收率)的無(wú)色固體的標(biāo)題化合物；¹H NMR(D₂O)δ2.37(s,3H,Me-2)；3.76(s,6H,OMe)；3.79(s,3H,OMe)；3.82(s,3H,OMe)；4.66(s,H₂O)；6,93(d,1H,CH芳香,J＝8.6Hz)；7.04(d,1H,CH芳香,J＝8.6Hz)；7.10(s,2H,CH芳香)。

生物學(xué)數(shù)據(jù)

(A)(i)對(duì)于組合伴侶(a)的體外研究

表1：對(duì)于化合物的體外數(shù)據(jù)：這些是利用磺基羅丹明B(Sulforhodamine B)(SRB)或Systmex細(xì)胞計(jì)數(shù)(CC)測(cè)定對(duì)化合物的生長(zhǎng)抑制研究的結(jié)果。IC₅₀是抑制50％的凈細(xì)胞生長(zhǎng)所需的濃度。

^a除非另有指明，癌細(xì)胞系是MCF-7。

^b癌細(xì)胞系是MDA-MB-231。

^c人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)腫瘤型活化的內(nèi)皮細(xì)胞(Tum)和正常靜止型內(nèi)皮細(xì)胞(Norm)。

生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的概述：

微管蛋白聚合測(cè)定：微管蛋白聚合抑制測(cè)定利用基于熒光的檢測(cè)試劑盒(#BK011，Cytoskeleton(細(xì)胞骨架))根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。試驗(yàn)化合物加入到含有20％甘油在1x緩沖液1中的1mM GTP的2mg/ml微管蛋白溶液中(緩沖液1：80mM哌嗪-N,N’-二[2-乙磺酸]倍半鈉鹽；2mM氯化鎂；0.5mM乙二醇-二(b-氨基-乙基醚)N,N,N’,N’-四乙酸，pH 6.9，10uM熒光報(bào)道分子(fluorescent reporter))。以1分鐘的間隔在42分鐘期間測(cè)量熒光。增加的熒光表明微管蛋白聚合增加。相比于單體微管蛋白亞單位，熒光報(bào)道分子對(duì)于聚合的微管蛋白的親和力增加十倍。該結(jié)果是在緊接微管蛋白聚合后的熒光信號(hào)。

增生測(cè)定–靜止內(nèi)皮(quiescent endothelium)：將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(CC-2519，Clonetics)一式三份地在96孔板中以15000個(gè)細(xì)胞/孔鋪放在EBM2(CC-3156，Clonetics)+0.5％FBS(CC-4101A，Clonetics)+GA-1000(CC-4381A，Clonetics)中。細(xì)胞在37℃5％CO₂下培養(yǎng)過(guò)夜。介質(zhì)隨后用包括所述化合物或陰性對(duì)照的新鮮介質(zhì)置換。細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)48h時(shí)間。進(jìn)行MTT測(cè)定以測(cè)量細(xì)胞數(shù)量的變化。簡(jiǎn)而言之，將20μl的MTT試劑加入到含有100μl的EBM2+0.5％FBS的細(xì)胞中并在37℃孵育2小時(shí)。測(cè)量在492nm的吸光度。

增生測(cè)定—活化的內(nèi)皮：將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(CC-2519，Clonetics)一式三份地在96孔板中以2500個(gè)細(xì)胞/孔鋪放在EGM2(CC-3162，Clonetics)中。細(xì)胞在37℃5％CO₂下培養(yǎng)過(guò)夜。介質(zhì)隨后用包括所述化合物或陰性對(duì)照的新鮮介質(zhì)置換。細(xì)胞培養(yǎng)48h的時(shí)間。進(jìn)行MTT測(cè)定以測(cè)量細(xì)胞數(shù)量的變化。簡(jiǎn)而言之，將20μl的MTT試劑加入到含有100μl的EBM2的細(xì)胞中并在37℃孵育2小時(shí)。測(cè)量在492nm的吸光度。

(ii)對(duì)于組合伴侶(a)的體內(nèi)研究

血管阻斷測(cè)定(Vascular Disruption Assay)：將雌性無(wú)胸腺BALB/c-nu/nu小鼠(裸小鼠)用于這個(gè)研究。小鼠為6-8周齡并且購(gòu)自澳大利亞西部佩思的動(dòng)物資源中心(Animal Resource Centre)并允許進(jìn)行馴化多天。所有動(dòng)物在無(wú)病原體條件下圈養(yǎng)并依據(jù)南澳大利亞費(fèi)林德斯大學(xué)(Flinders University of South Australia)和NH&MRC指南以及對(duì)于用于科學(xué)目的的動(dòng)物的照料和使用的澳大利亞實(shí)踐法典(Australian Code of Practice)進(jìn)行照料。將人乳腺癌MDA MB 231作為原位異種移植物在裸小鼠的乳房脂肪墊中生長(zhǎng)。每只小鼠在右前肢下方，所述乳房脂肪墊正上方皮下地注射在50μl達(dá)爾貝科PBS(Dulbecco’s PBS)中的2x10⁶個(gè)細(xì)胞。當(dāng)腫瘤達(dá)到100-150mm³的直徑(植入后3周)時(shí)，選取腫瘤進(jìn)行處理。將試驗(yàn)化合物(實(shí)例2)溶解在鹽水中并在總體積400ul中以范圍為150mg/kg–1mg/kg的濃度靜脈內(nèi)注射。腫瘤攜帶動(dòng)物在注入該試驗(yàn)化合物之后24小時(shí)，靜脈內(nèi)地注入10mg/kg Hoechst 33342。在Hoechst 33342注射之后1分鐘使動(dòng)物安樂(lè)死?；厥漳[瘤以進(jìn)行組織化學(xué)分析。通過(guò)評(píng)估沿整個(gè)腫瘤橫截面染色的Hoechst 33342的量進(jìn)行腫瘤灌注分析。在紫外光過(guò)濾器下觀察10微米的冷凍腫瘤活組織的切片。使用4x物鏡，成功獲取8-位單色照片，表示腫瘤切片的總面積?？傮w腫瘤切片的復(fù)合照片通過(guò)疊加單色照片的共有面積而生成。進(jìn)行同一腫瘤切片的蘇木素(Hematoxylin)和薯紅-Y(Eosin-Y)染色以確定非腫瘤區(qū)域。在Hoechst 33342復(fù)合照片上使非腫瘤區(qū)域成圖并從定量分析中排除。通過(guò)測(cè)量Hoechst 33342染色的像素面積和腫瘤區(qū)域的總像素面積進(jìn)行定量。灌注表示為Hoechst 33342染色面積對(duì)總腫瘤面積的百分比(參見(jiàn)圖4)。

腫瘤生長(zhǎng)抑制：將帶有MDA-MB-231實(shí)性原位腫瘤的Balb/c nu/nu小鼠用化合物實(shí)例2以40mg/kg進(jìn)行處理。動(dòng)物用總共兩個(gè)循環(huán)的實(shí)例2處理靜脈內(nèi)給藥。每個(gè)循環(huán)在第1天和第8天給藥，接著是三周無(wú)藥期。表示為相對(duì)于初始腫瘤體積的比值的腫瘤生長(zhǎng)在總共72天上顯示。

腫瘤生長(zhǎng)以及動(dòng)物健康在治療后第1天檢測(cè)直至72天。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中觀察到的結(jié)果(參見(jiàn)圖5)清楚地顯示在用兩個(gè)周期的實(shí)例2治療的動(dòng)物中的腫瘤生長(zhǎng)抑制。在實(shí)例2治療的(n＝64)和賦形劑治療的(n＝20)動(dòng)物之間的腫瘤生長(zhǎng)的顯著差異在第4天(p<0.001；不成對(duì)的t-試驗(yàn)(unpaired t-test)；analysis)直至第70天被清晰地觀察到。

(B)(i)對(duì)于(a)和(b)的組合的體外研究

微管蛋白靶向VDA試劑的臨床前評(píng)價(jià)已經(jīng)證實(shí)，這些化合物能夠阻斷(破壞)腫瘤血流，增加腫瘤缺氧和壞死。這些作用導(dǎo)致動(dòng)物模型中腫瘤生長(zhǎng)的一定減少。從通過(guò)VDA作用引起的血管損傷的腫瘤恢復(fù)在治療后48小時(shí)內(nèi)發(fā)生。此外，血管阻斷使腫瘤塊的外部細(xì)胞外緣多余，其看起來(lái)由圍繞腫瘤被膜并且通過(guò)VDA作用保持未受影響的正常血管所支持?？梢院侠淼丶僭O(shè)，其存活的外緣隨后支持腫瘤血管重建并從VDA試劑的作用恢復(fù)。我們假設(shè)腫瘤從VDA作用的影響的恢復(fù)受支持癌癥細(xì)胞存活和誘導(dǎo)血管發(fā)生的分子途徑驅(qū)動(dòng)。我們進(jìn)行了大量組織學(xué)分析以評(píng)估由實(shí)例2對(duì)腫瘤微環(huán)境的成分的完整性所引起的損傷并獲得可能涉及腫瘤恢復(fù)的蛋白質(zhì)上調(diào)的信息。我們的分析包括VEGF、磷酸化mTOR、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hif-1α)和缺氧誘導(dǎo)因子-2α(Hif-2α)的表達(dá)的評(píng)價(jià)，細(xì)胞凋亡的水平、內(nèi)皮細(xì)胞和基膜蛋白層粘連蛋白的完整性的評(píng)價(jià)。我們的觀察結(jié)果表明，在用實(shí)例2治療后24-30h，存在利用內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物、和CD31的染色的減少，證實(shí)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的破壞，以及層粘連蛋白染色的顯著減少，這是基膜完整性降解的證據(jù)。此外，我們的分析顯示，腫瘤內(nèi)的壞死細(xì)胞的數(shù)量顯著增大。最重要地，利用抗-人類(lèi)VEGF抗體的染色的顯著增加是明顯的。在存活邊緣區(qū)域周?chē)?如由箭頭指示的)增加的磷酸化mTOR(ser 2448)、Hif-1α和Hif-2α的表達(dá)以及壞死區(qū)(如圖3中箭頭指示的)中內(nèi)皮細(xì)胞的喪失在實(shí)例2治療的腫瘤中觀察到。

在圍繞實(shí)例2誘導(dǎo)的壞死腫瘤區(qū)域的存活邊緣(viable rim)中磷酸化mTOR上調(diào)的新發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致目前的假設(shè)，即實(shí)例2(以及類(lèi)似的，TPI試劑)與mTOR蛋白的抑制劑的聯(lián)合治療在遞送延長(zhǎng)的血管關(guān)閉效應(yīng)(將腫瘤暴露于更長(zhǎng)缺氧期并導(dǎo)致增加的腫瘤生長(zhǎng)的抑制)中是協(xié)同作用的。

此外，微管蛋白靶向試劑抑制癌細(xì)胞增生的固有性能提供對(duì)于這類(lèi)試劑的第二抗癌機(jī)制。我們已經(jīng)證實(shí)，用實(shí)例2和mTOR抑制劑替西羅莫司對(duì)大量細(xì)胞系的聯(lián)合治療在體外抑制癌細(xì)胞系增生中產(chǎn)生加合效應(yīng)。除了其在誘導(dǎo)血管發(fā)生中已證實(shí)的作用外，mTOR也是一種癌細(xì)胞代謝和存活的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)物。mTOR的抑制劑誘導(dǎo)白細(xì)胞郁積(cytostasis)并且大量已被批準(zhǔn)用于大量癌癥情形下的臨床使用。因此，微管蛋白和mTOR的協(xié)作靶向可能產(chǎn)生改善的治療益處。

通過(guò)破壞腫瘤血管支持以及直接地通過(guò)抑制癌細(xì)胞增生，mTOR與TPI試劑的潛在治療相容性的雙重模式對(duì)于TPI類(lèi)的微管蛋白靶向化合物是獨(dú)特的。相反，具有VDA活性的非-TPI試劑例如DMXAA或ASA404(5,6-二甲基占噸酮-4-乙酸)對(duì)于癌細(xì)胞不施加直接的抗增生性作用。

免疫組織學(xué)分析—方法(圖3)

將6至8周的雌性BALB/c nu/nu小鼠皮下(s.c.)注射人癌細(xì)胞系Caki-1(代表腎癌)。細(xì)胞再懸浮在達(dá)爾貝科PBS(Sigma-Aldrich)中并且皮下注射5×10⁶個(gè)細(xì)胞。在治療之前，腫瘤生長(zhǎng)至700mm³的平均尺寸。實(shí)例2治療由以32mg/kg的劑量水平的單個(gè)靜脈內(nèi)(i.v.)注射構(gòu)成。包括鹽水治療作為賦形劑對(duì)照。在給藥后24小時(shí)，使動(dòng)物安樂(lè)死并切除腫瘤以用于組織學(xué)檢查。制備腫瘤的冰凍切片并用磷酸化mTOR(ser 2448)、Hif-1α、Hif-2α和CD31特異性抗體進(jìn)行探測(cè)。利用3,3’-二氨基聯(lián)苯胺(褐色染色)使抗體染色可視化并且切片用Myers蘇木素反染色。

利用體外增生測(cè)定來(lái)評(píng)估聯(lián)合實(shí)例2與mTOR抑制劑

使用人類(lèi)癌細(xì)胞系來(lái)評(píng)價(jià)對(duì)于與實(shí)例2的聯(lián)合合適的試劑。

分析是基于在待評(píng)價(jià)的化合物存在下體外細(xì)胞增生的測(cè)量結(jié)果。將細(xì)胞以平均500-2000個(gè)細(xì)胞/孔接種在96孔板中，在添加試驗(yàn)化合物之前允許粘附整夜。在試驗(yàn)物質(zhì)存在下在培養(yǎng)48-72h之后評(píng)估細(xì)胞增生。細(xì)胞用實(shí)例2和待評(píng)價(jià)的化合物的組合進(jìn)行處理、或者單獨(dú)用這些試劑的每一個(gè)進(jìn)行處理。增生測(cè)量通過(guò)基于四唑的比色測(cè)定(MTS)進(jìn)行。代謝活性細(xì)胞利用CellTiterAqueous One Solution(一種水溶液)(Promega Corp.Madison WI,USA)根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)量并獲取492nm處的吸光度值。將對(duì)于各個(gè)化合物濃度的吸光度值標(biāo)準(zhǔn)化成對(duì)應(yīng)的賦形劑對(duì)照培養(yǎng)物。S形劑量響應(yīng)曲線擬合于這些數(shù)據(jù)，并且增生降低50％的濃度利用Graph Pad Prism 4軟件(San Diego，USA)進(jìn)行計(jì)算。

聯(lián)合指數(shù)值(Combination Index Value)

使用人類(lèi)癌細(xì)胞系(列舉細(xì)胞系：Caki-1，A498，Calu-6，SKOV-3，A4549)來(lái)評(píng)價(jià)在體外的聯(lián)合治療。細(xì)胞用實(shí)例2與替西羅莫司協(xié)同治療72小時(shí)并利用定量軟件CalcuSyn分析來(lái)自單個(gè)試劑和所述組合二者的ED50和ED75數(shù)據(jù)以確定聯(lián)合指數(shù)(CI)和效果(分為協(xié)同作用的、加合的或無(wú)加合益處的組合)(Chou TC.Theoretical basis,experimental design,and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies.Pharmacol Rev.2006Sep；58(3):621-81)。結(jié)果在圖2中以表格顯示。

細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞系

癌細(xì)胞系包括Calu-6、A549、A498、Caki-1和Sk-OV-3(ATCC,Manassas,VA,USA)。Calu-6細(xì)胞在MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基具有10％FCS、2mM青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺10mM Hepes(乙基哌嗪乙磺酸)緩沖液1mM丙酮酸鈉溶液(sodium pyruvate solution)和0.1mM非必需氨基酸溶液SK-OV-3細(xì)胞在DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基具有10％FCS、2mM青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺和10mM Hepes緩沖液。A549細(xì)胞在F 12K培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基具有10％FCS和2mM青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺。A498細(xì)胞在MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基具有10％FCS和2mM青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺。Caki-1細(xì)胞在McCoys5a培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基具有0％FCS和2mM青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺。

利用體內(nèi)(小鼠)測(cè)定評(píng)估聯(lián)合實(shí)例2與mTOR

6-8周的雌性BALB/c nu/nu小鼠用來(lái)源于腎癌的人類(lèi)細(xì)胞系caki-1皮下接種以建立實(shí)性腫瘤。腫瘤在接受治療之前生長(zhǎng)至150mm³的平均尺寸。每周對(duì)腫瘤體積(立方厘米)測(cè)量2至3次。動(dòng)物在28天循環(huán)的第1天和第8天以32mg/kg的靜脈內(nèi)給藥和/或在每周循環(huán)的第2天和第5天以1mg/kg腹膜內(nèi)(ip)給予雷帕霉素。在研究期間監(jiān)控腫瘤生長(zhǎng)和動(dòng)物健康。

腫瘤生長(zhǎng)表示為平均腫瘤體積(mm³)并且做成曲線直至其中90％的賦形劑治療的動(dòng)物仍然活著的時(shí)間點(diǎn)。存活顯示為仍然活著的動(dòng)物的百分比并且數(shù)據(jù)顯示為直到研究結(jié)束。

在這種試劑時(shí)間安排下，相比于單獨(dú)的單一療法(實(shí)例2或雷帕霉素)或賦形劑對(duì)照，朝向減小的腫瘤體積(圖6)和增大的存活(圖7)的趨勢(shì)在聯(lián)合療法組(實(shí)例2+雷帕霉素)中觀察到。