本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域，具體涉及一種治療肝臟疾病的藥物組合物及應用。

背景技術：

葉綠素銅鈉（Sodium copper chlorophyllin）又稱銅葉綠素鈉，通過有機溶劑(如丙酮)提取蠶糞或植物葉子，經皂化(用氫氧化鈉的甲醇溶液除去甲基和葉綠基酯基)后用氧化銅銅化而成。其化學命名為Sodium copper chlorophyllin，分子式為C34H29CuN4Na3O6，分子量：722.13。CAS號：65963-40-8。葉綠素銅鈉為墨綠色粉末。易溶于水，略溶于醇和氯仿，微溶于乙醚，偏酸性 (pH6.5以下)，如有鈣離子存在時則有沉淀析出。

葉綠素銅鈉鹽、鐵鈉鹽、鈷鈉鹽是良好的造血細胞復合劑，對放療后及各種原因引起的血細胞減少癥和各種貧血有治療作用。有研究報道葉綠素銅鈉可以通過阻斷THP-1細胞中NF-kB信號通路抑制由瘡皰丙酸桿菌引起的IL-8和MCP-1分泌。在對大鼠肝細胞線粒體和pBR322質粒的體外實驗中證實葉綠素銅鈉能夠通過抗γ射線引起的氧化作用和DNA損害保護線粒體，還被證實能夠抑制HaCaT細胞中由UVB刺激引起的ROS積累。葉綠素銅鈉也被證實能夠通過端粒酶活性和COX-2表達抑制HT29細胞生長，使其阻礙于G1期。

據(jù)認為，葉綠素銅鈉有其多重雙鍵，可能會中和自由電子，拮抗致癌物質的作用。例如，有報道說葉綠素銅鈉可抑制黃曲霉毒素B1（AFB1）對-DNA的結合， 因此可能有抗癌變的作用。但是，還沒有嚴格的科學證據(jù)來證明葉綠素銅鈉的抗癌功能。葉綠素銅鈉被用于寵物飼料的添加劑，以及食品色素。至今，尚無關于以葉綠素銅鈉為活性成分的藥物治療肝病的研究報道，而葉綠素銅鈉存在不穩(wěn)定、容易降解的缺點，放置3個月后，其有效成分降解到20%。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的缺點，提供一種治療肝臟疾病的藥物組合物及應用，該藥物組合物對肝臟疾病的治療有顯著的作用，且得到的產品有效成分葉綠素銅鈉穩(wěn)定，不易降解。

本發(fā)明的目的通過以下技術方案來實現(xiàn)：一種治療肝臟疾病的藥物組合物，它由下述重量份的原料組成：

葉綠素銅鈉： 10～50； 微晶纖維素： 100～163；

乳糖： 110～155； 硫脲： 0.1～5；

羥丙纖維素： 8～25； 二氧化硅： 0.5～17。

進一步地，它由下述重量份的原料組成：

葉綠素銅鈉： 18～35； 微晶纖維素： 110～143；

乳糖： 127～145； 硫脲： 0.3～3.1；

羥丙纖維素： 10～17； 二氧化硅： 10～15。

作為優(yōu)選方案，它由下述重量份的原料組成：

葉綠素銅鈉： 22； 微晶纖維素： 135；

乳糖： 135； 硫脲： 0.58；

羥丙纖維素： 12； 二氧化硅： 2.92。

進一步地，所述治療肝臟疾病的藥物組合物的含水量為3～10%。

作為最優(yōu)方案，所述治療肝臟疾病的藥物組合物的含水量為3.8%。

進一步地，所述治療肝臟疾病的藥物組合物的劑型為膠囊劑、片劑或顆粒劑。

作為最優(yōu)方案，所述治療肝臟疾病的藥物組合物的劑型為膠囊劑。

所述的藥物組合物在治療肝臟疾病或其肝臟疾病引起的并發(fā)癥藥物中的應用。

進一步地，所述肝臟疾病為肝纖維化、肝硬化或肝炎。

所述的肝臟疾病具有如下單一或任意組合的癥狀：

（1）肝纖維化、肝硬化；由肝病引發(fā)的肝臟炎癥；系統(tǒng)性炎癥；

（2）肝硬化的代償期以及失代償期的癥狀。包括肝功損害，門脈高壓癥。肝硬化癥狀，包括全身癥狀為乏力、消瘦、面色晦暗，尿少、下肢水腫。也可能用于胃腸功能紊亂甚至吸收不良綜合征，肝源性糖尿病等癥狀；

（3）肝硬化晚期的輔助治療。包括緩解肝硬化病人出現(xiàn)門脈高壓，腹腔積液、胸腔積液、食管-胃底靜脈曲張，腹壁靜脈曲張；

（4）用于肝臟疾病，肝硬化而產生的腸道菌群紊亂；

（5）用于平衡腸組織炎癥的預防，治療。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：本發(fā)明的藥物組合物通過與其他成分的合理配伍，提高了葉綠素銅鈉的穩(wěn)定性，藥品放置3個月后基本不降解；且發(fā)現(xiàn)當產品的含水量為3.8%時，穩(wěn)定性最好；本發(fā)明的藥物組合物通過實驗證實能治療肝臟疾病，包括肝纖維化、肝硬化、肝炎以及肝臟疾病引起的并發(fā)癥。

附圖說明

圖1為本發(fā)明藥物組合物對小鼠肝臟外觀的恢復示意圖；

圖2為本發(fā)明藥物組合物對小鼠肝臟壞死的拮抗示意圖；

圖3為肝臟組織Massion’s Trichrome組織染色結果；

圖4為依據(jù)Batts-Ludwig肝臟纖維化分類標準的單盲測驗打分；

圖5為肝臟組織Sirius Red組織染色結果；

圖6為Sirius Red組織染色陽性面積統(tǒng)計；

圖7為肝臟組織a-SMA、I型膠原、III型膠原RT－PCR結果；

圖8為肝臟組織a-SMA、纖連蛋白、β-Actin、GAPDH蛋白質免疫印跡結果；

圖9為本發(fā)明的藥物組合物對小鼠肝臟炎癥因子的拮抗示意圖；

圖10為本發(fā)明藥物組合物對小鼠系統(tǒng)下炎癥的拮抗示意圖；

圖11為本發(fā)明藥物組合物對小鼠肝臟基質金屬蛋白酶及其抑制劑的再平衡示意圖。

具體實施方式

下面結合附圖及實施例對本發(fā)明做進一步的描述，本發(fā)明的保護范圍不局限于以下所述：

實施例1：一種治療肝臟疾病的藥物組合物，它由下述重量份的原料組成：

葉綠素銅鈉： 10； 微晶纖維素： 100；

乳糖： 110； 硫脲： 0.1；

羥丙纖維素： 8； 二氧化硅： 0.5。

所述治療肝臟疾病的藥物組合物的劑型為膠囊劑，含水量為3%。

實施例2：一種治療肝臟疾病的藥物組合物，它由下述重量份的原料組成：

葉綠素銅鈉： 50； 微晶纖維素： 163；

乳糖： 155； 硫脲： 5；

羥丙纖維素： 25； 二氧化硅： 17。

所述治療肝臟疾病的藥物組合物的劑型為顆粒劑，含水量為10%。

實施例3：一種治療肝臟疾病的藥物組合物，它由下述重量份的原料組成：

葉綠素銅鈉： 18； 微晶纖維素： 110；

乳糖： 127； 硫脲： 0.3；

羥丙纖維素： 10； 二氧化硅： 10。

所述治療肝臟疾病的藥物組合物的劑型為片劑，含水量為4%。

實施例4：一種治療肝臟疾病的藥物組合物，它由下述重量份的原料組成：

葉綠素銅鈉： 35； 微晶纖維素： 143；

乳糖： 145； 硫脲： 3.1；

羥丙纖維素： 17； 二氧化硅： 15。

所述治療肝臟疾病的藥物組合物的劑型為膠囊劑，含水量為3～10%。

實施例5：一種治療肝臟疾病的藥物組合物，它由下述重量份的原料組成：

葉綠素銅鈉： 22； 微晶纖維素： 135；

乳糖： 135； 硫脲： 0.58；

羥丙纖維素： 12； 二氧化硅： 2.92。

所述治療肝臟疾病的藥物組合物的劑型為片劑，含水量為3.8%。

以下通過試驗說明本發(fā)明的有益效果：

1.本發(fā)明藥物組合物對肝臟外觀恢復的影響

（1）材料與方法

雄性Balb/c小鼠、飼料均購自中國北京華阜康生物科技股份有限公司；本發(fā)明的藥物組合物由成都通德藥業(yè)有限公司生產，一抗（纖連蛋白、α-SMA、GAPDH和β-Actin）由美國Santa Cruz Biotech公司提供。4-6周齡的SPF級雄性Balb/c小鼠，體重為20-25克，室溫（約24 oC）條件下，給予小鼠自由飲水與進食，并接受12小時晝夜更替光照。

在對小鼠進行一定劑量四氯化碳腹腔注射條件下，小鼠產生肝纖維化的典型癥狀。一般認為四氯化碳經肝微粒體CYP450活化后產生三氯甲基自由基，引起細胞膜和細胞器膜的不飽和脂肪酸過氧化，從而改變膜的流動性和通透性，使膜的Ca²⁺—ATP酶失活，胞質內Ca²⁺濃度升高，破壞細胞骨架，激活磷脂酶，損傷細胞膜結構特別是線粒體呼吸鏈紊亂，引起細胞死亡。肝實質細胞受損后釋放信號分子激活肝臟內巨噬細胞炎癥信號通路，并釋放促炎因子如腫瘤壞死因子、白細胞介素-1B、白細胞介素-6和干擾素(IFN)等，從而導致炎性反應的發(fā)生，以利于機體清除有害因素，但過度的免疫炎性反應導致了大量肝細胞的損傷，引起肝細胞凋亡和壞死，并且使得處于靜息狀態(tài)的肝星狀細胞(hepatic stellate cells)轉分化(trans-differentiation)為激活狀態(tài)的成肌纖維細胞(myofibroblasts)，并分泌α-SMA、I型膠原，引起細胞外基質（ECM）沉積，并最終導致肝纖維化的發(fā)生。因此，我們采用該動物模型來測定本發(fā)明藥物組合物對肝纖維化、肝硬化的拮抗作用。

4-6周齡的SPF級雄性Balb/c小鼠先經過2周的正常飼料喂養(yǎng)，適應環(huán)境后，隨機分為3組，每組6只。

第1組，“正常對照組”：給予正常飼料(AIN93)和RO水喂養(yǎng)，8周。

第2組，“肝纖維化造模組”：給予四氯化碳腹腔注射，每周2次，8周。

第3組，“治療組”：給予四氯化碳腹腔注射，每周2次，8周，同時在飲用水中加入本發(fā)明藥物組合物，濃度為0.025mg/ml；每日總攝入量0.125mg.

（2）實驗結果：

在實驗喂養(yǎng)期間，每次注射前記錄一次實驗小鼠體重及毛色等生長情況，第8周終止實驗，處死小鼠，收集肝臟進行后續(xù)實驗。

肝臟外觀結果如圖1所示，相比于正常對照組小鼠，

（1）與正常對照組比較，“肝纖維化造模組”肝纖維化小鼠經過四氯化碳腹腔注射8周后產生肝臟纖維化，肝臟明顯縮?。粚挾扔?cm減少到不足2.5cm。

（2）治療組，經過本發(fā)明藥物組合物在喂養(yǎng)8周后，肝臟外觀顯著恢復，在治療后寬度下降恢復到接近正常水平；寬度由2.5g上升為2.8g。

如圖1所示，第一，經過8周注射，“肝纖維化造模組”的小鼠的肝臟寬度降低到2.5cm，明顯低于于正常對照。第二，在飲用水中添加本發(fā)明藥物組合物可以有效地恢復肝臟外觀，由2.5g上升為2.8g。經過8周處理后，小鼠肝臟寬度恢復了12%，接近正常對照的水平。

2.本發(fā)明藥物組合物對肝臟細胞壞死的拮抗

肝臟發(fā)生細胞壞死是肝臟纖維化發(fā)生發(fā)展的主要癥狀之一。 肝臟細胞發(fā)生可觀察到的壞死，說明肝臟進入免疫耐受狀態(tài)，無法清除受損發(fā)生壞死的組織。如圖3所示，肝臟壞死可以通過肝臟的H&E染色切片觀察到。 在四氯化碳腹腔注射下，小鼠肝臟組織出現(xiàn)典型的壞死，如箭頭所示。 四氯化碳腹腔注射可以有效地增多組織壞死的出現(xiàn)，暗示肝臟處于免疫耐受狀態(tài)，發(fā)生纖維化。而給予本發(fā)明藥物組合物治療，小鼠的肝臟組織外觀發(fā)生顯著改善，其狀態(tài)與正常對照組水平相似。

小鼠的肝臟組織H&E染色見圖2，相比于正常對照組小鼠，

（1）“肝纖維化造模組”，肝纖維化造模組”肝纖維化小鼠經過四氯化碳腹腔注射8周后產生肝臟組織壞死；

（2） 治療組，經過本發(fā)明藥物組合物在喂養(yǎng)8周后，肝臟切片形態(tài)恢復到正常水平。

如圖2所示，肝臟組織切片H&E染色結果，觀察其肝臟組織形態(tài)，正常小鼠肝臟組織健康有序，在四氯化碳腹腔注射下，小鼠的肝臟組織中可觀察到發(fā)生組織壞死，而給予本發(fā)明藥物組合物治療的小鼠的肝臟組織形態(tài)得到顯著恢復，接近正常對照組水平。

3.本發(fā)明藥物組合物對小鼠肝臟纖維化的拮抗

膠原纖維，或稱細胞外基質在肝臟組織內的沉積是肝臟纖維化、肝硬化最主要的癥狀。在細胞水平上，肝臟纖維化的實質是肝臟星狀細胞的激活與轉分化，形成肌成纖維細胞。 組織纖維化可以為腫瘤的形成提供生長環(huán)境。Masson’s trichrome組織染色和Sirius Red 組織染色結果顯示，在四氯化碳腹腔注射下，小鼠肝臟組織出現(xiàn)明顯的纖維橋。四氯化碳腹腔注射可以有效地增多纖維沉積出現(xiàn)，說明小鼠處于肝臟纖維化乃至肝硬化的狀態(tài)。而給予葉綠素銅鈉，小鼠的肝臟內纖維沉積明顯減少，纖維橋變細乃至消失，其狀態(tài)與正常對照組水平相似。同時我們采用單盲測試（single-blind trail）打分，評分標準采用Batts-Ludwig肝臟纖維化分類標準，具體為： 0=無纖維化，1=門靜脈纖維化，2=門靜脈周纖維化，3=形成纖維橋，4=壞死。結果造模組小鼠肝臟纖維化得分為3分左右，大部分形成明顯纖維橋，而治療組小鼠肝臟纖維化得分為1分左右，顯著低于肝纖維化造模組，恢復至接近正常對照組，Sirius Red染色陽性面積統(tǒng)計也得到類似結論。此外，我們應用了RT－PCR分析技術從mRNA轉錄水平定量肝纖維化的程度。四氯化碳腹腔注射可以有效地增加促進肝臟纖維化關鍵基因a-SMA、I型膠原、III型膠原的表達，葉綠素銅鈉治療組小鼠該類基因表達量則顯著下降，恢復至或接近正常對照水平。此外，我們應用了蛋白質免疫印跡技術從蛋白水平半定量肝纖維化的程度。四氯化碳腹腔注射可以有效地增加衡量肝臟纖維化關鍵蛋白質a-SMA、纖連蛋白的蛋白質水平表達，本發(fā)明藥物組合物治療組小鼠該類蛋白質表達量則顯著下降，恢復至或接近正常對照水平。因此在飲用水中添加10mg/ml的葉綠素銅鈉可以有效地抵御肝臟纖維化。

肝臟組織Massion’s Trichrome組織染色結果見圖3-8，依據(jù)Batts-Ludwig肝臟纖維化分類標準的單盲測驗打分見圖4，肝臟組織Sirius Red組織染色結果見圖5，Sirius Red組織染色陽性面積統(tǒng)計見圖6，肝臟組織a-SMA、I型膠原、III型膠原RT－PCR結果見圖7，肝臟組織a-SMA、纖連蛋白、β-Actin、GAPDH蛋白質免疫印跡結果見圖8；相比于正常對照組小鼠，

（1）“肝纖維化造模組”，肝纖維化造模組”肝纖維化小鼠經過四氯化碳腹腔注射8周后產生肝臟纖維化

（2） 治療組，經過本發(fā)明藥物組合物喂養(yǎng)8周后，肝臟纖維化恢復到正常對照水平。

如圖3-8，我們從mRNA轉錄水平、蛋白質水平、組織形態(tài)學水平的不同染色方法鑒定了，正常小鼠肝臟組織無纖維化發(fā)生，在四氯化碳腹腔注射下，小鼠的肝臟發(fā)生嚴重纖維化，而給予本發(fā)明藥物組合物治療的小鼠的肝臟組織纖維化得到顯著改善，接近正常對照組水平。因此，通過動物實驗，我們證明應用本發(fā)明藥物組合物可顯著改善肝臟纖維化。

4．本發(fā)明藥物組合物對小鼠肝臟炎癥因子的拮抗

肝臟星狀細胞由靜息狀態(tài)發(fā)生激活與轉分化需要促纖維化因子組織生長因子-β（TGF-β）和促炎癥因子的刺激。激活的成肌纖維細胞分泌α-SMA、Ⅰ型膠原，引起細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)沉積，并最終導致肝纖維化的發(fā)生。我們應用了RT－PCR分析技術從mRNA轉錄水平定量肝臟促炎因子基因表達的程度。四氯化碳腹腔注射可以有效地增加肝臟內促炎因子基因白介素-1β、白介素-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達，本發(fā)明藥物組合物治療組小鼠該類基因表達量則顯著下降，恢復至或接近正常對照水平。

肝臟組織白介素-1β、白介素-6、腫瘤壞死因子-α的RT－PCR結果見圖9；相比于正常對照組小鼠，

（1）“肝纖維化造模組”，肝纖維化造模組”肝纖維化小鼠經過四氯化碳腹腔注射8周后產生肝臟炎癥基因表達量明顯上調；

（2） 治療組，經過本發(fā)明藥物組合物喂養(yǎng)8周后，肝臟炎癥基因表達量下降或者恢復到正常對照水平。

如圖3-8，我們從mRNA轉錄水平鑒定了，正常小鼠肝臟組織無炎癥或者炎癥程度較低，在四氯化碳腹腔注射下，小鼠的肝臟發(fā)生炎癥，而給予本發(fā)明藥物組合物治療的小鼠的肝臟組織炎癥得到顯著改善，接近正常對照組水平。因此，通過動物實驗，我們證明應用本發(fā)明藥物組合物可顯著改善肝臟炎癥。

5．本發(fā)明藥物組合物對小鼠系統(tǒng)性炎癥的拮抗

由單核巨噬細胞產生的腫瘤壞死因子α（TNF-α）在病理狀態(tài)下分泌量增加可引起各種炎癥因子的瀑布式爆發(fā)，導致機體發(fā)熱、休克等。 肝纖維化、肝硬化常常伴隨著機體系統(tǒng)性炎癥，而血清中腫瘤壞死因子α含量是衡量系統(tǒng)性炎癥的重要標準。我們應用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測了血清中TNF-α含量，在四氯化碳腹腔注射下，小鼠血清中TNF-α明顯升高，說明小鼠處于系統(tǒng)性炎癥狀態(tài)。而給予本發(fā)明藥物組合物，小鼠血清中TNF-α明顯減少，其水平與正常對照組相似。

血清TNF-α的ELISA結果見圖10；相比于正常對照組小鼠，

（1）“肝纖維化造模組”，肝纖維化造模組”肝纖維化小鼠經過四氯化碳腹腔注射8周后產生系統(tǒng)性炎癥

（2） 治療組，經過本發(fā)明藥物組合物喂養(yǎng)8周后，機體系統(tǒng)性炎癥得到緩解。

通過檢測血液中TNF-α含量來衡量機體系統(tǒng)炎癥水平，結果正常小鼠的血液TNF-α含量為69.89±9.70ng/L，在四氯化碳腹腔注射下上升至105.40±18.63 ng/L，給予本發(fā)明藥物組合物后降至62.46±3.75 ng/L，有效降低了四氯化碳腹腔注射誘導的系統(tǒng)炎癥。通過動物實驗，我們證明應用本發(fā)明藥物組合物可顯著改善由于肝臟纖維化導致的系統(tǒng)性炎癥。

6.葉綠素銅鈉對小鼠肝臟基質金屬蛋白酶及其抑制劑的再平衡

肝臟纖維化的實質是I型膠原為主的細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)合成與降解失衡，在肝內過度沉積。這種過度沉積不僅是由于ECM合成增多，還有相當部分原因是由于降解減少。而基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)及其抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)是調節(jié)ECM降解的主要酶系。在正常生理情況下，肝臟內的基質金屬蛋白酶降解膠原，但其活性又受到對應抑制因子的抑制，兩者形成動態(tài)平衡，使肝臟內膠原維持在一個穩(wěn)定水平。但當肝臟處于病理狀態(tài)下，如病毒性肝炎、酒精性肝炎或者非酒精性肝炎，兩者之間的平衡被打破，導致膠原沉積，并最終形成肝臟纖維化乃至肝硬化。我們應用了RT－PCR分析技術從mRNA轉錄水平定量肝臟內與纖維化相關的基質金屬蛋白酶基因及其對應抑制因子表達的程度，并將每只小鼠對應MMP/TIMP基因表達量比值進行了計算。四氯化碳腹腔注射可以有效地降低肝臟內MMP-9/TIMP-1、MMP-14/TIMP-2比值，本發(fā)明藥物組合物治療組小鼠肝臟MMP-9/TIMP-1、MMP-13/TIMP-1和MMP-14/TIMP-2比值顯著上調，恢復至正常對照水平。

肝臟組織MMP-9/TIMP-1、MMP-13/TIMP-1和MMP-14/TIMP-2基因表達量比值的結果見圖11；相比于正常對照組小鼠，

（1）“肝纖維化造模組”，肝纖維化造模組”肝纖維化小鼠經過四氯化碳腹腔注射8周后MMP-9/TIMP-1、MMP-14/TIMP-2比值下調

（2） 治療組，經過本發(fā)明藥物組合物喂養(yǎng)8周后，肝臟MMP-9/TIMP-1、MMP-13/TIMP-1和MMP-14/TIMP-2比值顯著上調。

如圖3-8，我們從mRNA轉錄水平鑒定了，正常小鼠肝臟組織基質金屬蛋白酶與其抑制因子維持平衡，在四氯化碳腹腔注射下，小鼠的肝臟受損，基質金屬蛋白酶與其抑制因子動態(tài)穩(wěn)態(tài)被打破，導致膠原的沉積并最終發(fā)生纖維化，而給予本發(fā)明藥物組合物治療的小鼠的基質金屬蛋白酶與其抑制因子基因表達量比值顯著升高，暗示本發(fā)明藥物組合物治療肝臟纖維化實質是增強了膠原的消融。因此，通過動物實驗，我們證明應用本發(fā)明藥物組合物可顯著改善各類肝病導致的機體肝臟基質金屬蛋白酶與其抑制因子的紊亂。